Dziękujemy za odwiedzenie strony nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z najnowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Dodatkowo, aby zapewnić ciągłą obsługę, ta strona nie będzie zawierać stylów ani JavaScript.
Melamina jest znanym zanieczyszczeniem żywności, które może występować w niektórych kategoriach żywności zarówno przypadkowo, jak i celowo. Celem niniejszego badania była weryfikacja wykrywania i ilościowego oznaczania melaminy w mleku modyfikowanym dla niemowląt i mleku w proszku. Przeanalizowano łącznie 40 próbek żywności dostępnej w handlu, w tym mleko modyfikowane i mleko w proszku, z różnych regionów Iranu. Przybliżoną zawartość melaminy w próbkach określono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z wiązką promieniowania ultrafioletowego (HPLC-UV). Sporządzono krzywą kalibracyjną (R2 = 0,9925) dla oznaczania melaminy w zakresie 0,1–1,2 μg mL−1. Granice oznaczalności i wykrywalności wynosiły odpowiednio 1 μg mL−1 i 3 μg mL−1. Badania zawartości melaminy w mleku modyfikowanym i mleku w proszku wykazały, że poziom melaminy w mleku modyfikowanym i mleku w proszku wynosił odpowiednio 0,001–0,095 mg kg−1 i 0,001–0,004 mg kg−1. Wartości te są zgodne z przepisami UE i Kodeksem Żywnościowym (Codex Alimentarius). Należy zauważyć, że spożycie tych produktów mlecznych o obniżonej zawartości melaminy nie stanowi znaczącego zagrożenia dla zdrowia konsumentów. Potwierdzają to również wyniki oceny ryzyka.
Melamina to związek organiczny o wzorze sumarycznym C3H6N6, pochodzący z cyjanamidu. Charakteryzuje się bardzo niską rozpuszczalnością w wodzie i zawiera około 66% azotu. Melamina jest szeroko stosowanym związkiem przemysłowym o szerokim zakresie zastosowań w produkcji tworzyw sztucznych, nawozów i urządzeń do przetwarzania żywności (w tym opakowań do żywności i naczyń kuchennych)1,2. Melamina jest również stosowana jako nośnik leków w leczeniu chorób. Wysoka zawartość azotu w melaminie może prowadzić do niewłaściwego wykorzystania tego związku i nadawania składnikom żywności właściwości cząsteczek białkowych3,4. Dlatego dodawanie melaminy do produktów spożywczych, w tym produktów mlecznych, zwiększa zawartość azotu. W związku z tym błędnie wyciągnięto wniosek, że zawartość białka w mleku jest wyższa niż w rzeczywistości.
Każdy gram dodanej melaminy zwiększa zawartość białka w żywności o 0,4%. Melamina jest jednak dobrze rozpuszczalna w wodzie i może powodować poważniejsze szkody. Dodanie 1,3 grama melaminy do produktów płynnych, takich jak mleko, może zwiększyć zawartość białka w mleku o 30%5,6. Chociaż melaminę dodaje się do żywności zwierzęcej, a nawet ludzkiej w celu zwiększenia zawartości białka7, Komisja Kodeksu Żywnościowego (Codex Alimentarius Commission, CAC) i władze krajowe nie zatwierdziły melaminy jako dodatku do żywności i wymieniły ją jako niebezpieczną w przypadku połknięcia, wdychania lub wchłonięcia przez skórę. W 2012 roku Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) wymieniła melaminę jako substancję rakotwórczą klasy 2B, ponieważ może być szkodliwa dla zdrowia ludzi8. Długotrwała ekspozycja na melaminę może powodować raka lub uszkodzenie nerek2. Melamina w żywności może kompleksować się z kwasem cyjanurowym, tworząc nierozpuszczalne w wodzie żółte kryształy, które mogą powodować uszkodzenia nerek i tkanki pęcherza moczowego, a także raka dróg moczowych i utratę masy ciała9,10. Może powodować ostre zatrucie pokarmowe, a w wysokich stężeniach śmierć, szczególnie u niemowląt i małych dzieci.11 Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) również ustaliła tolerowane dzienne spożycie (TDI) melaminy dla ludzi na 0,2 mg/kg masy ciała na dzień w oparciu o wytyczne CAC.12 Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (US FDA) ustaliła maksymalny poziom pozostałości melaminy na 1 mg/kg w mleku modyfikowanym dla niemowląt i 2,5 mg/kg w innych produktach spożywczych.2,7 We wrześniu 2008 r. doniesiono, że kilku krajowych producentów mleka modyfikowanego dla niemowląt dodało melaminę do mleka w proszku w celu zwiększenia zawartości białka w swoich produktach, co spowodowało zatrucie mlekiem w proszku i wywołało ogólnokrajowy incydent zatrucia melaminą, w wyniku którego zachorowało ponad 294 000 dzieci, a ponad 50 000 zostało hospitalizowanych. 13
Karmienie piersią nie zawsze jest możliwe z powodu różnych czynników, takich jak trudności związane z życiem w mieście, choroby matki lub dziecka, co prowadzi do stosowania mleka modyfikowanego do karmienia niemowląt. W związku z tym powstały fabryki produkujące mleko modyfikowane, którego skład jest jak najbardziej zbliżony do składu mleka matki14. Mleko modyfikowane dostępne na rynku jest zazwyczaj wytwarzane z mleka krowiego i zawiera specjalną mieszankę tłuszczów, białek, węglowodanów, witamin, minerałów i innych związków. Aby mleko było zbliżone do mleka matki, zawartość białka i tłuszczu w mleku modyfikowanym jest zróżnicowana, a w zależności od rodzaju mleka jest ono wzbogacane związkami takimi jak witaminy i minerały, np. żelazem15. Ponieważ niemowlęta są grupą wrażliwą i istnieje ryzyko zatrucia, bezpieczeństwo spożycia mleka w proszku ma kluczowe znaczenie dla zdrowia. Po przypadku zatrucia melaminą wśród chińskich niemowląt, kraje na całym świecie zwróciły szczególną uwagę na ten problem, a wrażliwość w tym obszarze również wzrosła. Dlatego szczególnie ważne jest wzmocnienie kontroli produkcji mleka modyfikowanego w celu ochrony zdrowia niemowląt. Istnieją różne metody wykrywania melaminy w żywności, w tym wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), elektroforeza, metoda sensoryczna, spektrofotometria oraz test immunoenzymatyczny antygen-przeciwciało16. W 2007 roku amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) opracowała i opublikowała metodę HPLC do oznaczania melaminy i kwasu cyjanurowego w żywności, która jest najskuteczniejszą metodą oznaczania zawartości melaminy17.
Stężenia melaminy w mleku modyfikowanym dla niemowląt mierzone nową techniką spektroskopii w podczerwieni wahały się od 0,33 do 0,96 miligrama na kilogram (mg kg-1). 18 Badanie przeprowadzone na Sri Lance wykazało, że poziom melaminy w pełnym mleku w proszku wahał się od 0,39 do 0,84 mg kg-1. Ponadto importowane próbki mleka modyfikowanego dla niemowląt zawierały najwyższe poziomy melaminy, odpowiednio 0,96 i 0,94 mg/kg. Poziomy te są poniżej dopuszczalnego limitu (1 mg/kg), ale dla bezpieczeństwa konsumentów konieczny jest program monitorowania. 19
W kilku badaniach zbadano poziom melaminy w irańskich mieszankach mlecznych dla niemowląt. Około 65% próbek zawierało melaminę, ze średnią zawartością 0,73 mg/kg i maksymalną 3,63 mg/kg. W innym badaniu stwierdzono, że poziom melaminy w mieszankach mlecznych dla niemowląt wahał się od 0,35 do 3,40 μg/kg, ze średnią zawartością 1,38 μg/kg. Ogólnie rzecz biorąc, obecność i poziom melaminy w irańskich mieszankach mlecznych dla niemowląt zostały ocenione w różnych badaniach, przy czym niektóre próbki zawierały melaminę przekraczającą maksymalny limit ustalony przez organy regulacyjne (2,5 mg/kg/karmę).
Biorąc pod uwagę ogromne, bezpośrednie i pośrednie zużycie mleka w proszku w przemyśle spożywczym oraz szczególne znaczenie mleka modyfikowanego w żywieniu dzieci, celem niniejszego badania była walidacja metody wykrywania melaminy w mleku w proszku i mleku modyfikowanym. Pierwszym celem badania było opracowanie szybkiej, prostej i dokładnej ilościowej metody wykrywania zafałszowań melaminą w mleku modyfikowanym i mleku w proszku z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i detekcji ultrafioletowej (UV). Drugim celem badania było określenie zawartości melaminy w mleku modyfikowanym i mleku w proszku sprzedawanych na rynku irańskim.
Instrumenty używane do analizy melaminy różnią się w zależności od miejsca produkcji żywności. Do pomiaru pozostałości melaminy w mleku i mleku modyfikowanym zastosowano czułą i niezawodną metodę analizy HPLC-UV. Produkty mleczne zawierają różne białka i tłuszcze, które mogą zakłócać pomiar melaminy. Dlatego, jak zauważyli Sun i in. 22, przed analizą instrumentalną konieczna jest odpowiednia i skuteczna strategia oczyszczania. W niniejszym badaniu użyliśmy jednorazowych filtrów strzykawkowych. W niniejszym badaniu użyliśmy kolumny C18 do oddzielenia melaminy w mleku modyfikowanym i mleku w proszku. Rysunek 1 przedstawia chromatogram wykrywania melaminy. Ponadto odzysk próbek zawierających 0,1–1,2 mg/kg melaminy wahał się od 95% do 109%, równanie regresji wynosiło y = 1,2487x − 0,005 (r = 0,9925), a wartości względnego odchylenia standardowego (RSD) wahały się od 0,8 do 2%. Dostępne dane wskazują, że metoda jest wiarygodna w badanym zakresie stężeń (Tabela 1). Instrumentalna granica wykrywalności (LOD) i granica oznaczalności (LOQ) melaminy wynosiły odpowiednio 1 μg mL−1 i 3 μg mL−1. Ponadto widmo UV melaminy wykazało pasmo absorpcji przy 242 nm. Metoda detekcji jest czuła, wiarygodna i dokładna. Metoda ta może być stosowana do rutynowego oznaczania poziomu melaminy.
Podobne wyniki opublikowali kilku autorów. Opracowano metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej z matrycą fotodiodową (HPLC) do analizy melaminy w produktach mlecznych. Dolne granice oznaczalności wynosiły 340 μg kg−1 dla mleka w proszku i 280 μg kg−1 dla mleka modyfikowanego dla niemowląt przy 240 nm. Filazzi i in. (2012) podali, że melamina nie została wykryta w mleku modyfikowanym dla niemowląt metodą HPLC. Jednak 8% próbek mleka w proszku zawierało melaminę na poziomie 0,505–0,86 mg/kg. Tittlemiet i in.23 przeprowadzili podobne badanie i określili zawartość melaminy w mleku modyfikowanym dla niemowląt (numer próbki: 72) metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas/MS (HPLC-MS/MS) na około 0,0431–0,346 mg kg−1. W badaniu przeprowadzonym przez Venkatasamy i in. (2010), do oszacowania zawartości melaminy w mleku modyfikowanym i mleku dla niemowląt zastosowano podejście zielonej chemii (bez acetonitrylu) oraz wysokosprawną chromatografię cieczową w fazie odwróconej (RP-HPLC). Zakres stężeń próbek wynosił od 1,0 do 80 g/ml, a odpowiedź była liniowa (r > 0,999). Metoda wykazała odzysk 97,2–101,2 w zakresie stężeń 5–40 g/ml, a powtarzalność była mniejsza niż 1,0% względnego odchylenia standardowego. Ponadto zaobserwowane wartości LOD i LOQ wynosiły odpowiednio 0,1 g mL−1 i 0,2 g mL−124. Lutter i in. (2011) określili zanieczyszczenie melaminą mleka krowiego i mleka modyfikowanego za pomocą HPLC-UV. Stężenia melaminy wahały się od < 0,2 do 2,52 mg kg−1. Liniowy zakres dynamiczny metody HPLC-UV wynosił od 0,05 do 2,5 mg kg−1 dla mleka krowiego, od 0,13 do 6,25 mg kg−1 dla mleka modyfikowanego dla niemowląt o ułamku masowym białka <15% i od 0,25 do 12,5 mg kg−1 dla mleka modyfikowanego dla niemowląt o ułamku masowym białka 15%. Wyniki LOD (i LOQ) wynosiły 0,03 mg kg−1 (0,09 mg kg−1) dla mleka krowiego, 0,06 mg kg−1 (0,18 mg kg−1) dla mleka modyfikowanego dla niemowląt o zawartości białka <15% i 0,12 mg kg−1 (0,36 mg kg−1) dla mleka modyfikowanego dla niemowląt o zawartości białka 15%, przy stosunku sygnału do szumu wynoszącym odpowiednio 3 i 1025 dla LOD i LOQ. (2012) zbadali poziom melaminy w próbkach mleka modyfikowanego i mleka w proszku metodą HPLC/DMD. W mleku modyfikowanym najniższy i najwyższy poziom wyniósł odpowiednio 9,49 mg kg−1 i 258 mg kg−1. Granica wykrywalności (LOD) wyniosła 0,05 mg kg−1.
Javaid i in. podali, że pozostałości melaminy w mleku modyfikowanym dla niemowląt mieściły się w zakresie 0,002–2 mg kg−1, co jest wartością mierzoną metodą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-MIR) (LOD = 1 mg kg−1; LOQ = 3,5 mg kg−1). Rezai i in.27 zaproponowali metodę HPLC-DDA (λ = 220 nm) do oszacowania melaminy i osiągnęli LOQ wynoszącą 0,08 μg mL−1 dla mleka w proszku, co było wartością niższą od uzyskanej w tym badaniu. Sun i in. opracowali metodę RP-HPLC-DAD do wykrywania melaminy w mleku płynnym metodą ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Otrzymali wartości LOD i LOQ wynoszące odpowiednio 18 i 60 μg kg−128, co jest wartością bardziej czułą niż w obecnym badaniu. Montesano i in. potwierdzono skuteczność metody HPLC-DMD w ocenie zawartości melaminy w suplementach białkowych przy granicy oznaczalności 0,05–3 mg/kg, która była mniej czuła od metody stosowanej w tym badaniu29.
Niewątpliwie laboratoria analityczne odgrywają ważną rolę w ochronie środowiska poprzez monitorowanie zanieczyszczeń w różnych próbkach. Jednak stosowanie dużej liczby odczynników i rozpuszczalników podczas analizy może prowadzić do powstawania niebezpiecznych pozostałości. Dlatego w 2000 roku opracowano zieloną chemię analityczną (GAC), aby ograniczyć lub wyeliminować negatywny wpływ procedur analitycznych na operatorów i środowisko26. Do identyfikacji melaminy stosowano tradycyjne metody wykrywania melaminy, takie jak chromatografia, elektroforeza, elektroforeza kapilarna i test immunoenzymatyczny (ELISA). Jednak spośród licznych metod wykrywania, czujniki elektrochemiczne cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich doskonałą czułość, selektywność, szybki czas analizy i łatwość obsługi30,31. Zielona nanotechnologia wykorzystuje biologiczne szlaki syntezy nanomateriałów, co może zmniejszyć generowanie niebezpiecznych odpadów i zużycie energii, promując w ten sposób wdrażanie zrównoważonych praktyk. Nanokompozyty, na przykład wykonane z materiałów przyjaznych dla środowiska, można stosować w biosensorach do wykrywania substancji takich jak melamina32,33,34.
Badanie pokazuje, że mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME) jest skutecznie stosowana ze względu na wyższą efektywność energetyczną i zrównoważony rozwój w porównaniu z tradycyjnymi metodami ekstrakcji. Ekologiczna i energooszczędna technologia SPME sprawia, że ​​stanowi ona doskonałą alternatywę dla tradycyjnych metod ekstrakcji w chemii analitycznej i zapewnia bardziej zrównoważoną i wydajną metodę przygotowania próbek35.
W 2013 roku Wu i wsp. opracowali wysoce czuły i selektywny biosensor wykorzystujący metodę powierzchniowego rezonansu plazmonowego (mini-SPR), który wykorzystuje sprzężenie między melaminą a przeciwciałami antymelaminowymi do szybkiego wykrywania melaminy w mleku modyfikowanym dla niemowląt za pomocą immunotestu. Biosensor SPR w połączeniu z immunotestem (z wykorzystaniem albuminy surowicy bydlęcej sprzężonej z melaminą) to łatwa w użyciu i tania technologia o granicy wykrywalności wynoszącej zaledwie 0,02 μg mL-136.
Nasiri i Abbasian wykorzystali przenośny czujnik o wysokim potencjale w połączeniu z kompozytami tlenku grafenu i chitozanu (GOCS) do wykrywania melaminy w próbkach komercyjnych37. Metoda ta wykazała ultrawysoką selektywność, dokładność i responsywność. Czujnik GOCS charakteryzował się niezwykłą czułością (239,1 μM−1), zakresem liniowym od 0,01 do 200 μM, stałą powinowactwa 1,73 × 10⁻¹ i granicą wykrywalności (LOD) do 10 nM. Co więcej, w badaniu przeprowadzonym przez Chandrasekhar i in. w 2024 roku zastosowano przyjazne dla środowiska i ekonomiczne podejście. Wykorzystali oni ekstrakt ze skórki papai jako czynnik redukujący do syntezy nanocząstek tlenku cynku (ZnO-NP) w sposób przyjazny dla środowiska. Następnie opracowano unikalną technikę mikrospektroskopii Ramana do oznaczania melaminy w mieszankach mlecznych dla niemowląt. Cząsteczki ZnO-NP pochodzące z odpadów rolniczych wykazały potencjał jako cenne narzędzie diagnostyczne i niezawodna, niedroga technologia monitorowania i wykrywania melaminy38.
Alizadeh i in. (2024) wykorzystali wysoce czułą platformę fluorescencyjną z metaloorganicznym szkieletem (MOF) do oznaczania melaminy w mleku w proszku. Zakres liniowy i dolna granica wykrywalności czujnika, określone za pomocą 3σ/S, wynosiły odpowiednio od 40 do 396,45 nM (co odpowiada 25 μg kg−1 do 0,25 mg kg−1) i 40 nM (co odpowiada 25 μg kg−1). Zakres ten jest znacznie niższy od najwyższych dopuszczalnych poziomów pozostałości (MRL) ustalonych dla identyfikacji melaminy w mleku w proszku dla niemowląt (1 mg kg−1) i innych próbkach żywności/paszy (2,5 mg kg−1). Czujnik fluorescencyjny (terb (Tb)@NH−2-MIL-253(Al)MOF) wykazał wyższą dokładność i bardziej precyzyjne możliwości pomiarowe niż metoda HPLC39 w wykrywaniu melaminy w mleku w proszku. Biosensory i nanokompozyty stosowane w zielonej chemii nie tylko zwiększają możliwości wykrywania, ale także minimalizują zagrożenia dla środowiska, zgodnie z zasadami zrównoważonego rozwoju.
Zasady zielonej chemii zostały zastosowane do różnych metod oznaczania melaminy. Jednym z podejść jest opracowanie zielonej dyspersyjnej metody mikroekstrakcji w fazie stałej z wykorzystaniem naturalnego polimeru polarnego β-cyklodekstryny usieciowanej kwasem cytrynowym, umożliwiającej wydajną ekstrakcję melaminy (40) z próbek takich jak mleko modyfikowane dla niemowląt i gorąca woda. Inna metoda wykorzystuje reakcję Mannicha do oznaczania melaminy w próbkach mleka. Metoda ta jest niedroga, przyjazna dla środowiska i bardzo dokładna, z liniowym zakresem 0,1–2,5 ppm i niską granicą wykrywalności (41). Ponadto opracowano ekonomiczną i przyjazną dla środowiska metodę ilościowego oznaczania melaminy w mleku płynnym i mleku modyfikowanym dla niemowląt, wykorzystującą spektroskopię transmisyjną w podczerwieni z transformacją Fouriera, charakteryzującą się wysoką dokładnością i granicami wykrywalności odpowiednio 1 ppm i 3,5 ppm (42). Metody te demonstrują zastosowanie zasad zielonej chemii w opracowaniu wydajnych i zrównoważonych metod oznaczania melaminy.
W kilku badaniach zaproponowano innowacyjne metody wykrywania melaminy, takie jak zastosowanie ekstrakcji w fazie stałej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)43, a także szybkiej wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), która nie wymaga skomplikowanej obróbki wstępnej ani odczynników do analizy par jonowych, co pozwala zmniejszyć ilość odpadów chemicznych44. Metody te nie tylko zapewniają dokładne wyniki oznaczania melaminy w produktach mlecznych, ale są również zgodne z zasadami zielonej chemii, minimalizując użycie niebezpiecznych substancji chemicznych i zmniejszając ogólny wpływ procesu analitycznego na środowisko.
Czterdzieści próbek różnych marek przebadano trzykrotnie, a wyniki przedstawiono w tabeli 2. Stężenia melaminy w próbkach mleka modyfikowanego i mleka w proszku wahały się odpowiednio od 0,001 do 0,004 mg/kg i od 0,001 do 0,095 mg/kg. Nie zaobserwowano istotnych różnic między trzema grupami wiekowymi mleka modyfikowanego. Ponadto melaminę wykryto w 80% mleka w proszku, ale 65% mieszanek modyfikowanych było zanieczyszczonych melaminą.
Zawartość melaminy w przemysłowym mleku w proszku była wyższa niż w mleku modyfikowanym dla niemowląt, a różnica ta była istotna statystycznie (p<0,05) (ryc. 2).
Uzyskane wyniki były poniżej limitów ustalonych przez FDA (poniżej 1 i 2,5 mg/kg). Ponadto wyniki są zgodne z limitami ustalonymi przez CAC (2010) i UE45,46, tj. maksymalny dopuszczalny limit wynosi 1 mg kg-1 dla mleka modyfikowanego dla niemowląt i 2,5 mg kg-1 dla produktów mlecznych.
Według badania przeprowadzonego w 2023 roku przez Ghanati i in.47, zawartość melaminy w różnych rodzajach mleka pakowanego w Iranie wahała się od 50,7 do 790 μg kg−1. Ich wyniki były poniżej dopuszczalnego limitu FDA. Nasze wyniki są niższe niż wyniki Shodera i in.48 oraz Rimy i in.49. Shoder i in. (2010) stwierdzili, że poziomy melaminy w mleku w proszku (n = 49) oznaczone metodą ELISA wahały się od 0,5 do 5,5 mg/kg. Rima i in. przeanalizowali pozostałości melaminy w mleku w proszku za pomocą spektrofotometrii fluorescencyjnej i stwierdzili, że zawartość melaminy w mleku w proszku wynosiła 0,72–5,76 mg/kg. W Kanadzie w 2011 roku przeprowadzono badanie w celu monitorowania poziomów melaminy w mleku modyfikowanym (n = 94) za pomocą chromatografii cieczowej (LC/MS). Stwierdzono, że stężenia melaminy były poniżej dopuszczalnego limitu (wstępna norma: 0,5 mg kg−1). Jest mało prawdopodobne, aby wykryte fałszywe poziomy melaminy były taktyką mającą na celu zwiększenie zawartości białka. Nie można tego jednak wytłumaczyć stosowaniem nawozów, przenoszeniem zawartości pojemników ani podobnymi czynnikami. Ponadto nie ujawniono źródła melaminy w mleku w proszku importowanym do Kanady50.
Hassani i in. zmierzyli zawartość melaminy w mleku w proszku i mleku płynnym na rynku irańskim w 2013 r. i uzyskali podobne wyniki. Wyniki pokazały, że z wyjątkiem jednej marki mleka w proszku i mleka płynnego, wszystkie inne próbki były zanieczyszczone melaminą, przy poziomach od 1,50 do 30,32 μg g−1 w mleku w proszku i 0,11 do 1,48 μg ml−1 w mleku. Co godne uwagi, w żadnej z próbek nie wykryto kwasu cyjanurowego, co zmniejsza możliwość zatrucia melaminą u konsumentów. 51 Wcześniejsze badania oceniały stężenie melaminy w produktach czekoladowych zawierających mleko w proszku. Około 94% próbek importowanych i 77% próbek irańskich zawierało melaminę. Poziomy melaminy w próbkach importowanych wahały się od 0,032 do 2,692 mg/kg, podczas gdy w próbkach irańskich wahały się od 0,013 do 2,600 mg/kg. Ogółem melaminę wykryto w 85% próbek, ale tylko w przypadku jednej konkretnej marki jej poziom przekroczył dopuszczalny limit.44 Tittlemier i in. podali, że poziom melaminy w mleku w proszku mieścił się w przedziale od 0,00528 do 0,0122 mg/kg.
Tabela 3 podsumowuje wyniki oceny ryzyka dla trzech grup wiekowych. Ryzyko było mniejsze niż 1 we wszystkich grupach wiekowych. Oznacza to, że melamina w mleku modyfikowanym dla niemowląt nie stanowi nierakotwórczego zagrożenia dla zdrowia.
Niższy poziom zanieczyszczenia produktów mlecznych może wynikać z niezamierzonego zanieczyszczenia podczas przygotowywania, natomiast wyższy poziom – z celowych dodatków. Ponadto, ogólne ryzyko dla zdrowia ludzi wynikające ze spożywania produktów mlecznych o niskiej zawartości melaminy jest uważane za niskie. Można wnioskować, że spożywanie produktów o tak niskiej zawartości melaminy nie stanowi żadnego zagrożenia dla zdrowia konsumentów52.
Biorąc pod uwagę znaczenie zarządzania bezpieczeństwem żywności w przemyśle mleczarskim, zwłaszcza w kontekście ochrony zdrowia publicznego, niezwykle istotne jest opracowanie i walidacja metody oceny i porównywania poziomów i pozostałości melaminy w mleku w proszku i mleku modyfikowanym. Opracowano prostą i dokładną metodę spektrofotometryczną HPLC-UV do oznaczania melaminy w mleku modyfikowanym i mleku w proszku. Metodę zwalidowano w celu zapewnienia jej niezawodności i dokładności. Wykazano, że granice wykrywalności i oznaczalności metody są wystarczająco czułe, aby mierzyć poziomy melaminy w mleku modyfikowanym i mleku w proszku. Według naszych danych, melaminę wykryto w większości próbek irańskich. Wszystkie wykryte poziomy melaminy były poniżej maksymalnych dopuszczalnych limitów określonych przez CAC, co wskazuje, że spożycie tego rodzaju produktów mlecznych nie stanowi zagrożenia dla zdrowia ludzi.
Wszystkie użyte odczynniki chemiczne były klasy analitycznej: melamina (2,4,6-triamino-1,3,5-triazyna) o czystości 99% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); acetonitryl o czystości HPLC (Merck, Darmstadt, Niemcy); woda ultraczysta (Millipore, Morfheim, Francja). Jednorazowe filtry strzykawkowe (Chromafil Xtra PVDF-45/25, średnica porów 0,45 μm, średnica membrany 25 mm) (Macherey-Nagel, Düren, Niemcy).
Do przygotowania próbek zastosowano łaźnię ultradźwiękową (Elma, Niemcy), wirówkę (Beckman Coulter, Krefeld, Niemcy) i chromatografię cieczową (KNAUER, Niemcy).
Użyto chromatografu cieczowego wysokosprawnego (KNAUER, Niemcy) wyposażonego w detektor UV. Warunki analizy HPLC były następujące: użyto systemu UHPLC Ultimate wyposażonego w kolumnę analityczną ODS-3 C18 (4,6 mm × 250 mm, wielkość cząstek 5 μm) (MZ, Niemcy). Eluent HPLC (faza ruchoma) stanowiła mieszanina TFA/metanol (450:50 ml) o szybkości przepływu 1 ml min-1. Długość fali detekcji wynosiła 242 nm. Objętość nastrzyku wynosiła 100 μl, a temperatura kolumny 20°C. Ponieważ czas retencji leku jest długi (15 minut), następny nastrzyk należy wykonać po 25 minutach. Melaminę zidentyfikowano poprzez porównanie czasu retencji i piku widma UV standardów melaminy.
Roztwór wzorcowy melaminy (10 μg/ml) przygotowano z użyciem wody i przechowywano w lodówce (4°C), z dala od światła. Rozcieńczono roztwór macierzysty fazą ruchomą i przygotowano robocze roztwory wzorcowe. Każdy roztwór wzorcowy wstrzyknięto do chromatografu HPLC 7 razy. Równanie kalibracyjne 10 obliczono na podstawie analizy regresji wyznaczonej powierzchni piku i wyznaczonego stężenia.
Komercyjnie dostępne mleko w proszku krowie (20 próbek) i próbki różnych marek mleka modyfikowanego dla niemowląt na bazie mleka krowiego (20 próbek) zakupiono w lokalnych supermarketach i aptekach w Iranie do karmienia niemowląt w różnych grupach wiekowych (0–6 miesięcy, 6–12 miesięcy i >12 miesięcy) i przechowywano w temperaturze chłodniczej (4 °C) do czasu analizy. Następnie odważono 1 ± 0,01 g homogenizowanego mleka w proszku i zmieszano z acetonitrylem:wodą (50:50, v/v; 5 ml). Mieszaninę mieszano przez 1 minutę, a następnie sonikowano w łaźni ultradźwiękowej przez 30 minut i na koniec wytrząsano przez 1 minutę. Następnie mieszaninę wirowano przy 9000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a supernatant przefiltrowano do 2 ml fiolki do automatycznego próbnika za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm. Następnie filtrat (250 μl) zmieszano z wodą (750 μl) i wstrzyknięto do układu HPLC10,42.
Aby zweryfikować metodę, określiliśmy odzysk, dokładność, granicę wykrywalności (LOD), granicę oznaczalności (LOQ) oraz precyzję w warunkach optymalnych. LOD zdefiniowano jako zawartość próbki o wysokości piku trzykrotnie przekraczającej poziom szumu bazowego. Natomiast LOQ zdefiniowano dla zawartości próbki o wysokości piku dziesięciokrotnie przekraczającej stosunek sygnału do szumu.
Odpowiedź urządzenia określono za pomocą krzywej kalibracyjnej składającej się z siedmiu punktów danych. Użyto różnych zawartości melaminy (0, 0,2, 0,3, 0,5, 0,8, 1 i 1,2). Określono liniowość procedury obliczania melaminy. Ponadto do próbek ślepych dodano kilka różnych ilości melaminy. Krzywą kalibracyjną skonstruowano poprzez ciągłe wstrzykiwanie 0,1–1,2 μg mL−1 standardowego roztworu melaminy do próbek mleka modyfikowanego dla niemowląt i mleka w proszku, a jego R2 = 0,9925. Dokładność oceniono na podstawie powtarzalności i odtwarzalności procedury i uzyskano ją poprzez wstrzykiwanie próbek w pierwszym i trzech kolejnych dniach (w trzech powtórzeniach). Powtarzalność metody oceniono poprzez obliczenie RSD % dla trzech różnych stężeń dodanej melaminy. Przeprowadzono badania odzysku w celu określenia precyzji. Stopień odzysku metodą ekstrakcji obliczono przy trzech poziomach stężenia melaminy (0,1, 1,2, 2) w próbkach mleka modyfikowanego i mleka w proszku9,11,15.
Szacowane dzienne spożycie (EDI) określono przy użyciu następującego wzoru: EDI = Ci × Cc/BW.
Gdzie Ci to średnia zawartość melaminy, Cc to spożycie mleka, a BW to średnia waga dzieci.
Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania SPSS 24. Normalność rozkładu sprawdzono testem Kołmogorowa-Smirnowa; wszystkie dane uzyskano za pomocą testów nieparametrycznych (p = 0). Dlatego do określenia istotnych różnic między grupami zastosowano test Kruskala-Wallisa i test Manna-Whitneya.
Ingelfinger, Jr. Melamina i jej wpływ na globalne zanieczyszczenie żywności. New England Journal of Medicine 359(26), 2745–2748 (2008).
Lynch, RA i wsp. Wpływ pH na migrację melaminy w miskach dziecięcych. International Journal of Food Contamination, 2, 1–8 (2015).
Barrett, MP i Gilbert, IH. Kierowanie toksycznych związków do wnętrza trypanosomów. Progress in Parasitology 63, 125–183 (2006).
Nirman, MF i in. Ocena in vitro i in vivo dendrymerów melaminowych jako nośników leków. International Journal of Pharmacy, 281(1–2), 129–132(2004).
Światowa Organizacja Zdrowia. Spotkania ekspertów 1–4 mające na celu przegląd aspektów toksykologicznych melaminy i kwasu cyjanurowego (2008).
Howe, AK-C., Kwan, TH i Lee, PK-T. Toksyczność melaminy a nerki. Journal of the American Society of Nephrology 20(2), 245–250 (2009).
Ozturk, S. i Demir, N. Opracowanie nowego adsorbentu IMAC do identyfikacji melaminy w produktach mlecznych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Journal of Food Synthesis and Analysis 100, 103931 (2021).
Chansuvarn, V., Panic, S. i Imim, A. Proste spektrofotometryczne oznaczanie melaminy w mleku płynnym w oparciu o reakcję Mannicha Greena. Spectrochem. Acta Part A Mol. Biomol. Spectrosc. 113, 154–158 (2013).
Deabes, M. i El-Habib, R. Oznaczanie melaminy w próbkach mleka modyfikowanego dla niemowląt, mleka w proszku i pangi metodą chromatografii HPLC/diodowej. Journal of Environmental Analytical Toxicology, 2(137), 2161–0525.1000137 (2012).
Skinner, KG, Thomas, JD i Osterloh, JD Toksyczność melaminy. Journal of Medical Toxicology, 6, 50–55 (2010).
Światowa Organizacja Zdrowia (WHO), Toksykologia i aspekty zdrowotne melaminy i kwasu cyjanurowego: Raport ze wspólnego spotkania ekspertów WHO/FAO, wspieranego przez Health Canada, Ottawa, Kanada, 1-4 grudnia 2008 r. (2009).
Korma, SA i in. Badanie porównawcze składu lipidów i jakości proszku mleka modyfikowanego dla niemowląt zawierającego nowe funkcjonalne lipidy strukturalne oraz komercyjnego mleka modyfikowanego dla niemowląt. European Food Research and Technology 246, 2569–2586 (2020).
El-Waseef, M. i Hashem, H. Poprawa wartości odżywczej, jakości i trwałości mleka modyfikowanego dla niemowląt przy użyciu oleju palmowego. Middle East Journal of Agricultural Research 6, 274–281 (2017).
Yin, W. i in. Produkcja przeciwciał monoklonalnych przeciwko melaminie i opracowanie pośredniej konkurencyjnej metody ELISA do wykrywania melaminy w mleku surowym, mleku w proszku i paszach dla zwierząt. Journal of Agricultural and Food Chemistry 58(14), 8152–8157 (2010).