Obecnie†Aktualny adres: OX11 0DE, Wielka Brytania, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Wielka Brytania, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Kompleks zbierający światło w centrum reakcji 1 (RC-LH1) jest głównym składnikiem fotosyntetycznym purpurowych bakterii fototroficznych. Przedstawiliśmy dwie struktury kriomikroskopii elektronowej kompleksu RC-LH1 z Rhodopseudomonas palustris. Struktura kompleksu RC-LH114-W o rozdzielczości 2,65 Å składa się z 14 pętli podjednostki LH1 otaczających RC, które są przerwane białkiem W, podczas gdy kompleks bez białka W jest całkowicie złożony z RC otoczony przez RC. Zamknięta pętla 16 podjednostek LH1. Porównanie tych struktur dostarcza wglądu w dynamikę chinonu w kompleksie RC-LH1, w tym w wcześniej nieokreślone zmiany konformacyjne podczas wiązania chinonu w miejscu RC QB, a także w lokalizację pomocniczych miejsc wiązania chinonu, które pomagają w jego przekazaniu do RC. Unikalna struktura białka W zapobiega zamknięciu pętli LH1, tworząc w ten sposób kanał przyspieszający wymianę chinon/chinolon.
Energia dostarczana przez fotosyntezę może podtrzymać niemal całe życie na Ziemi i ma ogromny potencjał dla biotechnologii słonecznej. Promując globalną fotosyntezę, purpurowe bakterie fototroficzne wykazują również różne tryby energetyczne i zdolności metaboliczne. Potrafią unikać fotosyntezy i rosnąć jako bakterie heterotroficzne w ciemności, mogą wiązać azot i dwutlenek węgla, produkować wodór i degradować związki aromatyczne (1-3). Aby zapewnić energię do tych procesów, światło musi być szybko i wydajnie przekształcane w energię chemiczną. Proces ten rozpoczyna się, gdy kompleks antenowy wychwytujący światło absorbuje światło i przekazuje uwięzioną energię do centrum reakcji (RC), rozpoczynając w ten sposób separację ładunku (4-7). Podstawowa jednostka fotosyntezy u purpurowych bakterii fototroficznych składa się z RC typu 2, otoczonego kompleksem zbierającym światło 1 (LH1), tworząc kompleks rdzeniowy RC-LH1. LH1 jest tworzony przez szereg zakrzywionych heterodimerów αβ, z których każdy wiąże dwie cząsteczki chlorofilu bakteryjnego (BChl) a oraz jeden lub dwa karotenoidy (8-12). Najprostsza antena LH1 składa się z 16 lub 17 heterodimerów αβ otaczających RC (9-13) w zamkniętej pętli, ale w innych kompleksach rdzeniowych peptydy transbłonowe przerywają ciągłość otaczającego LH1, promując w ten sposób dyfuzję chinolu/chinonu między RC a kompleksem cytochromu bc1 (11, 13-15). Fioletowa roślina fototroficzna Rhodopseudomonas (Rps.) jest organizmem modelowym, który może zrozumieć transfer energii i elektronów wspomagający fotosyntezę. Pierwsza struktura krystaliczna Rps. Model kompleksu RC-LH1 u pszczoły palustris to RC, otoczony 15 heterodimerycznymi pętlami LH1, które są przerwane przez nieznane białko zwane „białkiem W” (14). Białko W zostało następnie zidentyfikowane jako RPA4402, które jest niescharakteryzowanym białkiem o masie cząsteczkowej 10,5 kDa z trzema przewidywanymi helisami transbłonowymi (TMH) (16). Proponujemy zmianę nazwy genu rpa4402 kodującego białko W na pufW, aby była zgodna z nomenklaturą stosowaną dla genów kodujących podjednostki RC-L, M (pufL, pufM) i LH1α, β (pufA, pufB). Co ciekawe, białko W jest obecne tylko w około 10% RC-LH1, co wskazuje, że Rps. palustris produkuje dwa różne kompleksy RC-LH1. W niniejszym artykule przedstawiamy struktury kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM) o wysokiej rozdzielczości dwóch kompleksów rdzeniowych, jednego z białkiem W i 14 heterodimerami αβ, drugiego bez białka W i zamkniętą pętlą 16 heterodimerów LH1. Nasza struktura stanowi skokowy krok w zrozumieniu kompleksu RC-LH1 Rps. palustris, ponieważ przeanalizowaliśmy jednorodną populację każdego wariantu i uzyskaliśmy wystarczającą rozdzielczość, aby jednoznacznie przypisać każdy peptyd i związane pigmenty oraz powiązane lipidy i chinony. Porównanie tych struktur pokazuje, że trzy białka TMH-W, których do tej pory nie znaleziono w żadnym innym kompleksie RC-LH1, generują kanał chinonowy, aby przyspieszyć wymianę chinon/chinolon. Zidentyfikowano szereg konserwatywnych miejsc wiązania lipidów i chinonów, a także ujawniliśmy nową zmianę konformacyjną po połączeniu chinonu i RC, która może być odpowiednia dla fotosystemu II (PSII) RC utlenionych organizmów fototroficznych. Nasze odkrycia rzucają nowe światło na kinetykę wiązania i wymiany chinonu/chinolonu w rdzeniowym kompleksie RC-LH1 fioletowych bakterii fototroficznych.
Aby ułatwić szczegółowe badanie dwóch kompleksów występujących w Rps. palustris, wyizolowaliśmy każdy z nich metodą biochemiczną. Kompleks pozbawiony białka W (zwany dalej ΔpufW) został oczyszczony ze szczepu pozbawionego genu pufW (16) i udało się wytworzyć tylko jeden kompleks RC-LH1. Kompleks zawierający białko W jest wytwarzany przez szczep. Białko W tego szczepu jest modyfikowane znacznikiem 10x His na C-końcu, dzięki czemu kompleks zawierający białko W może być skutecznie łączony z większością białek W, w których go brakuje, poprzez immobilizację metalu. Kompleks jest skutecznie rozdzielany (16) metodą chromatografii powinowactwa (IMAC).
Jak pokazano na rysunku 1, oba kompleksy zawierają trzy podjednostki RC (RC-L, RC-M i RC-H) otoczone anteną LH1. Struktura kompleksu o długości fali 2,80 Å, w którym brakuje białka-W, przedstawia 16 heterodimerów αβ, tworzących zamkniętą pętlę LH1 całkowicie otaczającą RC, zwaną dalej kompleksem RC-LH116. Struktura kompleksu zawierającego białko-W o długości fali 2,65 Å zawiera 14-heterodimer LH1 przerwany przez białko-W, zwaną dalej kompleksem RC-LH114-W.
(A i B) Reprezentacja powierzchni związku. (C i D) Połączone pigmenty wyrażone w pręcikach. (E i F) Kompleksy obserwowane z powierzchni cytoplazmy mają peptydy i podjednostki LH1 przedstawione w postaci rysunków i są ponumerowane zgodnie z ruchem wskazówek zegara od przerwy białko-W [zgodnie z numeracją Rba. kompleks sphaeroides (13)]. Dla LH1-α kolor podjednostki białkowej jest żółty; dla LH1-β kolor podjednostki białkowej jest niebieski; dla białka-W białko jest czerwone; dla RC-H jest cyjanowe; dla RC-L jest pomarańczowe; dla RC-M, magenta. Kofaktory są przedstawione jako pręciki, zielony reprezentuje cząsteczki BChl i BPh a, fioletowy reprezentuje karotenoidy, a żółty reprezentuje cząsteczki UQ10. (G i H) Powiększony obraz luki białko-W w regionie równoważnym kompleksu RC-LH114-W (G) i kompleksu RC-LH116 (H). Kofaktory są przedstawione w postaci wypełnienia przestrzeni, chelatowany chinon jest przedstawiony na niebiesko. Luka białko-W jest zaznaczona niebieską linią przerywaną na rysunku (G), a małe otwory, w których chinon/chinolol dyfunduje na pierścieniu LH116, są zaznaczone czarną linią przerywaną na rysunku (H).
Rysunek 1 (A i B) przedstawia RC otoczony otwartymi lub zamkniętymi macierzami heterodimerów LH1αβ, z których każdy wiąże dwa BChl i jeden karotenoid (Rysunek 1, C i D). Poprzednie badania wykazały, że Rps jest kompleksem LH1. W szlaku biosyntezy ksantyny spiruliny gatunki te zawierają mieszane populacje karotenoidów (17). Jednakże spiropyroksantyna jest dominującym karotenoidem, a jej gęstość jest zadowalająca. Dlatego zdecydowaliśmy się modelować spiroksantynę we wszystkich miejscach wiązania LH1. Polipeptydy alfa i beta to pojedyncze TMH z krótkimi zewnętrznymi regionami błonowymi (Rysunek 1, A, B, E i F). Chociaż nie zaobserwowano gęstości 17 reszt na C-końcu, polipeptyd alfa został rozszczepiony od Met1 do Ala46 w obu kompleksach. Polipeptyd β został zredukowany z Gly4 do Tyr52 w RC-LH116 oraz z Ser5 do Tyr52 w RC-LH114-W. Nie zaobserwowano zagęszczenia 3 lub 4 reszt N-końcowych ani 13 reszt C-końcowych (ryc. S1). Analiza spektrometrii masowej mieszanego kompleksu RC-LH1 przygotowanego ze szczepu dzikiego typu wykazała, że ​​brakujący region był wynikiem heterologicznego rozszczepienia tych peptydów (ryc. S1 i S2). Zaobserwowano również formylację N-końcową α-Met1 (f). Analiza wykazała, że ​​α-peptyd składa się z reszt fMet1 do Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, a β-peptyd składa się z reszt Ser2 do Ala53, co jest zgodne z mapą gęstości uzyskaną w niskotemperaturowym mikroskopie elektronowym.
Koordynacja α-His29 i β-His36 sprawia, że ​​BChls są ustawione twarzą w twarz; każdy heterodimer αβ łączy się ze swoimi sąsiadami, tworząc otwartą pętlę (RC-LH114-W) lub zamkniętą pętlę (RC-LH116) wokół RC. Tablica pigmentów sprzężonych z ekscytonami (Rysunek 1, C i D). W porównaniu z pasmem 877 nm RC-LH114-W, przesunięcie absorpcji ku czerwieni 880 nm RC-LH116 wynosi 3 nm (Rysunek 2A). Jednakże widmo dichroizmu kołowego jest prawie takie samo (Rysunek 2B), co wskazuje, że chociaż istnieje wyraźna różnica między pętlami otwartymi i zamkniętymi, lokalne środowisko BChls jest bardzo podobne. Przesunięcie ku czerwieni absorpcyjnej może być wynikiem zmniejszonego ruchu termicznego i zwiększonej stabilności pętli zamkniętej (18, 19), zmiany sprzężenia pigmentu spowodowanej pętlą zamkniętą (20, 21) lub kombinacji tych dwóch efektów (11).
(A) Widmo absorpcji w ultrafiolecie/widzialnym/bliskiej podczerwieni, którego piki oznaczono odpowiadającymi im pigmentami i znormalizowano do piku BPh przy 775 nm. (B) Widmo dichroizmu kołowego znormalizowane do absorbancji BChl przy 805 nm. (C i D) Wybrane widma ΔA z widm absorpcji czasowo-rozdzielczej kompleksu RC-LH114-W (C) i kompleksu RC-LH116 (D). Dla lepszej porównywalności wszystkie widma znormalizowano do ∆A −A przy 0,2 ps. (E) Szybkość utleniania cytochromu c2 po napromieniowaniu w obecności różnych stężeń UQ2 (patrz rysunek S8 dla danych surowych). (F) W komórkach hodowanych w świetle o niskiej, średniej lub wysokiej intensywności (odpowiednio 10, 30 lub 300 μMm-2 s-1), stosunek podjednostek białka W i białka RC-L w oczyszczonym kompleksie oraz stosunek oddzielonej błony. Określ poziom białka za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS i immunoanalizy (patrz rysunek S9 dla danych surowych). Określ stosunek względem oczyszczonego kompleksu RC-LH114-W. Stosunek stechiometryczny RC-L do białka W w kompleksie wynosi 1:1.
BChl w pozycji 1 w zdeformowanej pętli αβ14 kompleksu RC-LH114-W (rysunek 1, A, C i E) są bliżej pierwotnego dawcy RC (P) o 6,8 Å niż równoważne BChl w kompleksie RC-LH116 (rysunek 1, B, D i F oraz rysunek S3); jednak kinetyka absorpcji przejściowej obu kompleksów pokazuje, że dla kompleksów RC-LH114-W i RC-LH116 stałe czasowe transferu energii wzbudzenia z LH1 do RC wynoszą odpowiednio 40 ±4 i 44 ±3 ps (rysunek 2). , C i D, rysunek S4 oraz tabela S2). Nie stwierdzono również istotnych różnic w transferze elektronów w kompleksie RC (rysunek S5 i powiązany tekst uzupełniający). Podejrzewamy, że bliski związek czasu transferu energii między LH1 a RC-P wynika z podobnej odległości, kąta i energii potencjalnej większości BChl w obu pętlach LH1. Wydaje się, że badanie wzorca energii LH1 w celu osiągnięcia minimalnej odległości nie jest szybsze niż bezpośredni transfer energii z miejsc suboptymalnych do RC. Otwarta pętla LH1 w RC-LH114-W może również podlegać nieznacznemu ruchowi termicznemu w warunkach niskiej temperatury, co jest przydatne w analizie strukturalnej, a w temperaturze pokojowej występuje dłuższa konformacja pierścienia αβ14 w porównaniu z odległością pigmentacji βBChl w pozycji RC 1.
Kompleks RC-LH116 zawiera 32 BChl i 16 karotenoidów, a jego ogólny układ jest taki sam, jak uzyskany z Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), szczepu Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (PDB ID 7C9R) (12) i zielenic (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Po wyrównaniu zaobserwowano jedynie niewielkie odchylenia w pozycjach heterodimerów αβ, szczególnie 1-5, 15 i 16 (Rysunek S6). Obecność białka-W ma istotny wpływ na strukturę LH1. Jego trzy TMH są połączone krótkimi pętlami, z N-końcową pętlą po stronie światła kompleksu i C-końcową pętlą po stronie cytoplazmatycznej (Rysunki 1A i 3, od A do D). Białko W jest w dużej mierze hydrofobowe (ryc. 3B), a TMH2 i TMH3 oddziałują z LH1αβ-14, tworząc powierzchnię transbłonową (ryc. 3, B oraz E–G). Interfejs składa się głównie z reszt Phe, Leu i Val w obszarze transbłonowym. Reszty te są ułożone w stos z hydrofobowymi aminokwasami i pigmentami αβ-14. Niektóre reszty polarne również przyczyniają się do tej interakcji, w tym wiązanie wodorowe między W-Thr68 a β-Trp42 na powierzchni złożonej wnęki (ryc. 3, F i G). Na powierzchni cytoplazmy Gln34 sąsiaduje z grupą ketonową karotenoidów αβ-14. Ponadto, cząsteczka n-dodecylo-β-d-maltozydu (β-DDM) została rozdzielona, ​​a jej hydrofobowy ogon rozciągał się do granicy między białkiem W a αβ-14, a ogon lipidowy może znajdować się w organizmie. Zauważyliśmy również, że regiony rozdzielenia C-końcowego białka W i RCH są bardzo blisko siebie, ale nie w zakresie tworzenia specyficznych interakcji (Rysunek 1, A i E). Mogą jednak występować interakcje w nierozdzielonych aminokwasach C-końcowych tych dwóch białek, co może stanowić mechanizm rekrutacji białka W podczas tworzenia kompleksu RC-LH114-W.
(A) Białko-W, które jest zwrócone w stronę interfejsu z LH1αβ14 w formie rysunku, ma łańcuch boczny w kształcie pręta (czerwony), przedstawiony na części diagramu potencjału elektrostatycznego (przezroczysta szara powierzchnia o poziomie konturu 0,13). (B) Białko-W przedstawione za pomocą kolorowej powierzchni hydrofobowej. Obszary polarne i naładowane są przedstawione na cyjanowo, obszary hydrofobowe na biało, a obszary silnie hydrofobowe na pomarańczowo. (C i D) Białko-W przedstawione na rysunku, jego orientacja jest taka sama jak w (A) (C) i obrócona o 180° (D). Zgodnie z pozycją w sekwencji, rozróżnialne reszty przyjmują schemat kolorów tęczy, gdzie N-koniec jest niebieski, a C-koniec jest czerwony. (E) Białko-W w tym samym widoku co w (A), a reszty na interfejsie białko-W:LH1 są przedstawione za pomocą prętów z dołączonymi znakami. (F) Białko W jest obrócone o 90° względem (E) i LH1αβ14 na rysunku oraz względem reszt interfejsu na rysunku słupkowym. Wystające reszty beta-polipeptydu są oznaczone. Kofaktor jest przedstawiony jako słupek o kolorze odpowiadającym kolorowi na rysunku 1, rozłożony β-DDM jest pokazany na szaro, a tlen na czerwono. (G) Widok na rysunku (F) jest obrócony o 180°, z widocznymi resztami znakowanego alfa-polipeptydu.
Białko W zastępuje heterodimer αβ (piętnasty na rycinie 1F), zapobiegając w ten sposób zamknięciu pętli i przechyleniu pierwszych trzech heterodimerów αβ. Zaobserwowano, że maksymalny kąt nachylenia pierwszego heterodimeru αβ-1 względem normalnej do filmu wynosił od 25° do 29° (rycina 1, A i E), co wynikało z nachylenia αβ-1 od 2° do 8° w ostrym kontraście RC A-LH116 (rycina 1, B i F). Drugi i trzeci heterodimer mają nachylenie odpowiednio od 12° do 22° i od 5° do 10°. Ze względu na zawadę przestrzenną RC, pochylenie αβ-1 nie obejmuje drugiej pary αβ (która odpowiada 16. αβ na Rysunku 1F), tworząc w ten sposób wyraźną przerwę w pierścieniu LH1 (Rysunek 1, A i E). Ze względu na brak dwóch heterodimerów αβ, wraz z utratą czterech BChl i dwóch karotenoidów, żaden z karotenoidów nie wiąże się ze skręconą podjednostką αβ-1, co skutkuje pierścieniem LH114-W zawierającym 13 karotenoidów Vegetarian i 28 BChl. Lokalne oszacowania rozdzielczości dwóch kompleksów w regionach od αβ1 do 7 są niższe niż oszacowania reszty pętli LH1, co może odzwierciedlać wrodzoną plastyczność podjednostki LH1 sąsiadującej z miejscem QB RC (Rysunek 4).
Zdjęcia RC-LH114-W (A i B) i RC-LH116 (C i D) przedstawiono z tego samego widoku z góry/boku (A i B) (A i C) oraz z powierzchni wnęki z rys. 1 (B i D). Kolorowe klucze pokazano po prawej stronie.
Jedynym innym charakterystycznym kompleksem rdzeniowym o stosunku stechiometrycznym 1:14 jest dimer RC-LH1-PufX Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Jednakże białko W i PufX nie wykazują wyraźnej homologii i mają znaczący wpływ na swoje struktury LH1. PufX to pojedynczy TMH z N-końcową domeną cytoplazmatyczną, która oddziałuje z cytoplazmatyczną stroną podjednostki RC-H (13) w pozycji odpowiadającej LH116αβ-16 Rps. palustris. PufX tworzy kanał wymiany chinon/chinolon między RC-LH1 a kompleksem cytochromu bcl i jest obecny we wszystkich kompleksach rdzeniowych Rba. sphaeroides (13). Chociaż interfejs monomer-monomer znajduje się w Rba. Dimer RC-LH1-PufX sphaeroides znajduje się w pozycji wiązania białka W w RC-LH114-W, a przerwa indukowana przez PufX i białko W znajduje się w równoważnej pozycji (ryc. S7A). Przerwa w RC-LH114-W jest również zgodna z hipotetycznym kanałem chinonowym (8) LH1 Pseudomonas rosea, który jest tworzony przez peptydy niezwiązane z białkiem W ani PufX (ryc. S7B). Ponadto kanał chinonowy w Blc. Szmaragdowozielony LH1 utworzony przez wykluczenie jednej podjednostki γ (7) znajduje się w podobnej pozycji (ryc. S7C). Chociaż pośredniczą w tym różne białka, pojawienie się tych kanałów chinonowych/chinololowych we wspólnej pozycji w kompleksie RC-LH1 wydaje się być przykładem ewolucji konwergentnej, wskazując, że przerwa utworzona przez białko W może działać jak kanał chinonowy.
Przerwa w pętli LH114-W umożliwia utworzenie ciągłego regionu błonowego pomiędzy przestrzenią wewnętrzną kompleksu RC-LH114-W a błoną objętościową (Rysunek 1G), zamiast łączyć te dwie domeny poprzez por białkowy, jak w białkach. Kompleks RC-LH116 jest podobny do zamkniętego kompleksu Tch w kształcie igły (22) (Rysunek 1H). Ponieważ dyfuzja chinonu przez błonę jest szybsza niż dyfuzja przez wąski kanał białkowy, otwarta pętla LH114-W może umożliwić szybszy obrót RC niż zamknięta pętla LH116, a dyfuzja chinonu do RC może być bardziej ograniczona. Aby sprawdzić, czy białko W wpływa na konwersję chinonów przez RC, przeprowadziliśmy test utleniania cytochromu przy określonym stężeniu ubichinonu 2 (UQ2) (analogu naturalnego UQ10 z krótszym ogonem izoprenowym) (Rysunek 2E). Mimo że obecność chelatowanego chinonu utrudnia dokładne określenie pozornej stałej Michaelisa (RC-LH114-W i RC-LH116 nadają się odpowiednio do 0,2±0,1μM i 0,5±0,2μM), maksymalna szybkość reakcji RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) jest o 28±5% większa niż RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Początkowo oszacowaliśmy, że białko W jest obecne w około 10% kompleksu rdzeniowego (16); w tym przypadku wskaźniki obsadzenia komórek wzrostu w warunkach słabego, średniego i silnego oświetlenia wynoszą odpowiednio 15 ± 0,6%, 11 ± 1% i 0,9 ± 0,5% (ryc. 2F). Ilościowe porównanie spektrometrii mas wykazało, że dodanie znacznika histydynowego nie zmniejszyło względnej obfitości białka W w porównaniu ze szczepami dzikiego typu (P = 0,59), zatem poziomy te nie są artefaktem zmodyfikowanego białka W (ryc. S10). Jednakże to niskie obłożenie białka W w kompleksie RC-LH1 może umożliwiać niektórym RC obrót w przyspieszonym tempie, łagodząc w ten sposób wolniejszą wymianę chinon/chinolon w kompleksie RC-LH116. Zauważyliśmy, że wysoki wskaźnik zajętości światła jest niezgodny z najnowszymi danymi transkryptomicznymi, które wskazują na wzrost ekspresji genu pufW pod wpływem silnego światła (ryc. S11) (23). Różnica między transkrypcją pufW a wbudowywaniem białka W do kompleksu RC-LH1 jest myląca i może odzwierciedlać złożoną regulację białka.
W RC-LH114-W, 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatydylocholiny (POPC), 1 fosfatydyloglicerol (POPG) i 29 cząsteczek β-DDM jest przydzielonych i modelowanych w nim 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG i 12 βDDM. RC-LH116 (Rysunek 5, A i B). W tych dwóch strukturach CDL jest zlokalizowane prawie po stronie cytoplazmatycznej kompleksu, podczas gdy POPC, POPG i β-DDM są zlokalizowane głównie po stronie luminalnej. Dwie cząsteczki lipidu i detergentu zostały wyizolowane w regionie αβ-1 do αβ-6 kompleksu RC-LH114-W (Rysunek 5A), a pięć zostało wyizolowanych w równoważnym regionie RC-LH116 (Rysunek 5B). Więcej lipidów znaleziono po drugiej stronie kompleksu, głównie CDL, zgromadzonych pomiędzy RC a αβ-7 do αβ-13 (Rysunek 5, A i B). Inne strukturalnie rozdzielone lipidy i detergenty znajdują się poza pierścieniem LH1, a dobrze rozdzielone łańcuchy acylowe rozciągają się pomiędzy podjednostkami LH1, tymczasowo oznaczone jako β-DDM w RC-LH114-W i zdefiniowane jako β-DDM w RC A, mieszaninie β-DDM i POPC-LH116. Podobne położenie chelatujących lipidów i detergentów w naszej strukturze wskazuje, że są one fizjologicznie istotnymi miejscami wiązania (Rysunek S12A). Pozycje równoważnych cząsteczek w Tch również wykazują dobrą spójność. Gentle i Trv. Szczep 970 RC-LH1s (ryc. S12, B do E) (9, 12) i reszty wiązań wodorowych grupy lipidowej głowy wykazały dość dobrą konserwację w wyrównaniu sekwencji (ryc. S13), co wskazuje, że konserwatywne CDL wiążące się z RC (24) – te miejsca mogą być konserwowane w kompleksie RC-LH1.
(A i B) Peptydy RC-LH114-W (A) i RC-LH116 (B) są przedstawione na rycinach, a pigmenty na pręcikach, zgodnie ze schematem kolorów z rysunku 1. Lipidy są pokazane na czerwono, a detergenty na szaro. UQ związany z miejscami RC QA i QB jest żółty, a izolowany UQ jest niebieski. (C i D) Te same widoki co na (A) i (B), z pominięciem lipidów. (E do G) Powiększony widok Q1(E), Q2(F) i Q3(G) z RC-LH116, z łańcuchami bocznymi, które na siebie wpływają. Wiązania wodorowe są pokazane jako czarne linie przerywane.
W RC-LH116 zarówno RC QA, jak i QB UQ, uczestniczące w przenoszeniu elektronów w procesie separacji ładunków, ulegają rozkładowi w swoich miejscach wiązania. Natomiast w RC-LH114-W chinon QB nie został rozdzielony i zostanie szczegółowo omówiony poniżej. Oprócz chinonów QA i QB, w strukturze RC-LH114-W przypisano dwie chelatowane cząsteczki UQ (znajdujące się pomiędzy pierścieniami RC i LH1) zgodnie z ich dobrze rozdzielonymi grupami głównymi (znajdującymi się odpowiednio w Q1 i Q2). (Rysunek 5C). Dwie jednostki izoprenowe przypisano do Q1, a mapa gęstości rozdziela wszystkie 10 ogonów izoprenowych Q2. W strukturze RC-LH116 rozdzielono trzy chelatowane cząsteczki UQ10 (od Q1 do Q3, Rysunek 5D), a wszystkie cząsteczki mają wyraźną gęstość w całym ogonie (Rysunek 5, od D do G). W obu strukturach pozycje grup głów chinonowych Q1 i Q2 wykazują doskonałą spójność (rysunek S12F) i oddziałują one tylko z RC. Q1 znajduje się przy wejściu do szczeliny W RC-LH114-W (rysunek 1G i 5, C, D i E), a Q2 znajduje się w pobliżu miejsca wiązania QB (rysunek 5, C, D) i F). Konserwatywne reszty L-Trp143 i L-Trp269 znajdują się bardzo blisko Q1 i Q2 i zapewniają potencjalne oddziaływania π-stacking (rysunek 5, E i F oraz rysunek S12). L-Gln88, 3,0 Å od dystalnego tlenu Q1, zapewnia silne wiązanie wodorowe (rysunek 5E); ta reszta jest konserwowana we wszystkich RC z wyjątkiem najbardziej odległego pokrewieństwa (rysunek S13). L-Ser91 jest konserwatywnie zastępowany przez Thr w większości innych RC (rysunek S13), znajduje się w odległości 3,8 angstremów od tlenu metylowego Q1 i może tworzyć słabe wiązania wodorowe (rysunek 5E). Q3 nie wydaje się mieć specyficznej interakcji, ale znajduje się w regionie hydrofobowym między podjednostką RC-M a podjednostką LH1-α 5 do 6 (rysunek 5, D i G). Q1, Q2 i Q3 lub pobliskie chelatowane chinony zostały również wykryte w Tch. Gentle, Trv. Strain 970 i Blc. Struktura tęczówki (9, 10, 12) wskazuje na konserwatywne pomocnicze miejsce wiązania chinonu w kompleksie RC-LH1 (rysunek S12G). Pięć rozłożonych cząsteczek UQ w RC-LH116 jest w dobrej zgodności z wartością 5,8 ± 0,7 każdego kompleksu określoną metodą chromatografii cieczowej wysokosprawnej (HPLC), podczas gdy wartość trzech rozłożonych cząsteczek UQ w RC-LH114-W jest niższa niż Zmierzona wartość 6,2 ± 0,3 (rys. S14) wskazuje, że w strukturze znajdują się nierozdzielone cząsteczki UQ.
Pseudosymetryczne polipeptydy L i M zawierają po pięć TMH i tworzą heterodimer, który łączy jeden dimer BChl, dwa monomery BChl, dwa monomery bakteriofaga (BPh), jedno żelazo niehemowe i jedną lub dwie cząsteczki UQ10. Dzięki obecności wiązań wodorowych na terminalnej grupie ketonowej i jej znanej akumulacji w Rps, karotenoidy są włączane do podjednostki M, która nosi nazwę cis-3,4-dehydroorodopina. Gatunek (25). Domena błony zewnętrznej RC-H jest zakotwiczona do błony przez pojedynczy TMH. Ogólna struktura RC jest podobna do struktury trzech podjednostek RC pokrewnych gatunków (takich jak Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrocykle BChl i BPh, szkielet karotenoidowy i żelazo niehemowe nakładają się na siebie w zakresie rozdzielczości tych struktur, podobnie jak grupa główna UQ10 w miejscu QA i chinon QB w RC-LH116 (rysunek S15).
Dostępność dwóch struktur RC z różnymi wskaźnikami zajętości miejsc QB stwarza nową możliwość zbadania spójnych zmian konformacyjnych towarzyszących wiązaniu chinonu QB. W kompleksie RC-LH116 chinon QB znajduje się w całkowicie związanej pozycji „proksymalnej” (26), ale oddzielenie RC-LH114-W nie zawiera chinonu QB. W RC-LH114-W nie ma chinonu QB, co jest zaskakujące, ponieważ kompleks jest aktywny, bardziej niż kompleks RC-LH116 ze strukturalnie rozdzielonym chinonem QB. Chociaż dwa pierścienie LH1 chelatują około sześciu chinonów, pięć jest strukturalnie rozdzielonych w zamkniętym pierścieniu RC-LH116, podczas gdy tylko trzy są strukturalnie ograniczone w otwartym pierścieniu RC-LH114-W. To zwiększone zaburzenie strukturalne może odzwierciedlać szybszą wymianę miejsc QB RC-LH114-W, szybszą kinetykę chinonu w kompleksie i zwiększone prawdopodobieństwo przekroczenia pętli LH1. Sugerujemy, że brak UQ w miejscu RC QB białka RC-LH114-W może być wynikiem bardziej złożonego i bardziej aktywnego kompleksu, a miejsce QB białka RC-LH114-W zostało natychmiast zamrożone w obrocie UQ. Konkretny etap (wejście do miejsca QB zostało zamknięte) odzwierciedla konformację tej aktywności.
Bez QB towarzysząca temu rotacja L-Phe217 do pozycji, która jest niezgodna z wiązaniem UQ10, ponieważ spowoduje kolizję przestrzenną z pierwszą jednostką izoprenową ogona (Rysunek 6A). Ponadto oczywiste są główne zmiany konformacyjne, szczególnie helisa de (krótka helisa w pętli między TMH D i E), gdzie L-Phe217 jest przesunięty do kieszeni wiążącej QB i rotacja L-Tyr223 (Rysunek 6A) w celu zerwania wiązania wodorowego z ramą M-Asp45 i zamknięcia wejścia do miejsca wiązania QB (Rysunek 6B). Helisa de obraca się u swojej podstawy, Cα L-Ser209 jest przesunięte o 0,33Å, podczas gdy L-Val221Cα jest przesunięte o 3,52Å. Nie obserwuje się żadnych zmian w TMH D i E, które nakładają się na siebie w obu strukturach (rysunek 6A). O ile nam wiadomo, jest to pierwsza struktura w naturalnym RC, która zamyka miejsce QB. Porównanie z kompletną (związaną z QB) strukturą pokazuje, że przed redukcją chinonu wymagana jest zmiana konformacji, aby wszedł on do chinonu. L-Phe217 obraca się, tworząc interakcję π-stacking z grupą głowową chinonu, a helisa przesuwa się na zewnątrz, umożliwiając szkieletowi L-Gly222 i łańcuchowi bocznemu L-Tyr223 utworzenie sieci wiązań wodorowych o stabilnej strukturze (rysunek 6, A i C).
(A) Nakładający się rysunek hologramu (łańcuch L, pomarańczowy/łańcuch M, magenta) i struktury apo (szary), w którym kluczowe reszty są wyświetlane w formie reprezentacji przypominającej pręt. UQ10 jest reprezentowany przez żółty pasek. Linia przerywana wskazuje wiązania wodorowe utworzone w całej strukturze. (B i C) Reprezentacja powierzchni apolipoproteiny i całej struktury pierścienia, wyróżniająca tlen łańcucha bocznego L-Phe217 na niebiesko i L-Tyr223 na czerwono, odpowiednio. Podjednostka L jest pomarańczowa; podjednostki M i H nie są pokolorowane. (D i E) Apolipoproteina (D) i całe (E) miejsca RC QB [odpowiednio pokolorowane przez (A)] i Thermophilus thermophilus PSII (zielony, niebieski z plastikowym chinonem; ID PDB: 3WU2) Wyrównaj (58).
Nieoczekiwanie, chociaż dostępnych jest kilka struktur RC z niedoborem QB bez LH1, zmiany konformacyjne zaobserwowane w tym badaniu nie zostały wcześniej zgłoszone. Należą do nich struktura zubożona QB z Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) i Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), z których wszystkie są prawie takie same jak ich ogólna struktura QB. Dokładna inspekcja 3PRC ujawniła, że ​​cząsteczki detergentu LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) wiążą się na wejściu do pozycji QB, co może zapobiegać przegrupowaniu w zamkniętą konformację. Chociaż LDAO nie rozkłada się w tej samej pozycji w 1EYS lub 1OGV, te RC są przygotowywane przy użyciu tego samego detergentu i dlatego mogą dawać ten sam efekt. Struktura krystaliczna Rba. Sphaeroides RC współkrystalizowany z cytochromem c2 (PDB ID: 1L9B) wydaje się również mieć zamknięte miejsce QB. Jednak w tym przypadku region N-końcowy polipeptydu RC-M (oddziałujący z miejscem wiązania QB poprzez wiązanie H reszty Tyr na helisie Q) przyjmuje nienaturalną konformację, a zmiana konformacji QB nie jest dalej badana (30). Uspokajające jest to, że nie zaobserwowaliśmy tego rodzaju deformacji polipeptydu M w strukturze RC-LH114-W, która jest prawie taka sama jak region N-końcowy RC-LH116 RC. Należy również zauważyć, że po usunięciu anteny LH1 opartej na detergentach, apolipoproteinowe RC w PDB zostały rozdzielone, co wyeliminowało wewnętrzne pule chinonów i lipidy w szczelinie między RC a wewnętrzną powierzchnią otaczającego pierścienia LH1 (31, 32). RC pozostaje funkcjonalny, ponieważ zachowuje wszystkie kofaktory, z wyjątkiem rozkładającego się chinonu QB, który jest mniej stabilny i często tracony podczas procesu przygotowania (33). Ponadto wiadomo, że usunięcie LH1 i naturalnych lipidów cyklicznych z RC może mieć wpływ na funkcje, takie jak skrócenie czasu życia stanu P+QB z rozdzielonym ładunkiem (31, 34, 35). Dlatego spekulujemy, że istnienie lokalnego pierścienia LH1 otaczającego RC może utrzymywać „zamknięte” miejsce QB, zachowując w ten sposób lokalne środowisko w pobliżu QB.
Chociaż apolipoproteina (bez chinonu QB) i kompletna struktura reprezentują tylko dwa migawki obrotu miejsca QB, a nie serię zdarzeń, istnieją przesłanki, że wiązanie może być bramkowane, aby zapobiec ponownemu wiązaniu przez hydrochinon w celu zahamowania hamowania substratu. Interakcja chinololu i chinonu w pobliżu miejsca QB apolipoproteiny może być inna, co prowadzi do jego odrzucenia przez RC. Od dawna postulowano, że zmiany konformacyjne odgrywają rolę w wiązaniu i redukcji chinonów. Zdolność zamrożonych RC do redukcji chinonów po adaptacji do ciemności jest upośledzona (36); krystalografia rentgenowska pokazuje, że uszkodzenie to jest spowodowane uwięzieniem chinonów QB w konformacji „dystalnej” około 4,5 Å od aktywnej pozycji proksymalnej (26) , 37). Sugerujemy, że ta dystalna konformacja wiązania jest migawką stanu pośredniego między apolipoproteiną a pełną strukturą pierścienia, który następuje po początkowej interakcji z chinonem i otwarciu miejsca QB.
Typ II RC znaleziony w kompleksie PSII niektórych bakterii fototroficznych i sinic, glonów i roślin charakteryzuje się konserwacją strukturalną i funkcjonalną (38). Strukturalne ułożenie przedstawione na rysunku 6 (D i E) podkreśla podobieństwo między PSII RC a miejscem QB bakteryjnego kompleksu RC. To porównanie od dawna stanowi model do badania blisko spokrewnionych systemów wiązania i redukcji chinonu. Wcześniejsze publikacje sugerowały, że zmianom konformacyjnym towarzyszy redukcja chinonów przez PSII (39, 40). Zatem, biorąc pod uwagę ewolucyjną konserwację RC, ten wcześniej nieobserwowany mechanizm wiązania może mieć również zastosowanie do miejsca QB PSII RC w utlenionych roślinach fototroficznych.
Szczepy Rps ΔpufW (delecja pufW bez oznaczenia) i PufW-His (białko W z tagiem 10x His na C-końcu, ekspresowane z naturalnego locus pufW). palustris CGA009 zostały opisane w naszej poprzedniej pracy (16). Te szczepy i izogeniczny szczep rodzicielski dzikiego typu odzyskano z zamrażarki poprzez posianie niewielkiej liczby komórek na płytce z PYE (każda po 5 g l -1) (przechowywanej w LB w temperaturze -80°C, zawierającej 50% (w/v) glicerolu), białka, ekstraktu drożdżowego i bursztynianu) agaru [1,5% (w/v)]. Płytkę inkubowano przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej w warunkach beztlenowych, a następnie naświetlano światłem białym (~50 μmolm-2 s-1) dostarczanym przez żarówki halogenowe OSRAM 116 W (RS Components, Wielka Brytania) przez 3 do 5 dni, aż do pojawienia się pojedynczej kolonii. Pojedynczą kolonię wykorzystano do zaszczepienia 10 ml podłoża M22+ (41) uzupełnionego 0,1% (w/v) kwasami kazeinowymi (zwanymi dalej M22). Hodowlę prowadzono w warunkach niskiego stężenia tlenu w ciemności w temperaturze 34°C, z wytrząsaniem przy 180 obr./min przez 48 godzin, a następnie zaszczepiono 70 ml hodowli w tych samych warunkach przez 24 godziny. Półtlenową kulturę o objętości 1 ml zaszczepiono 30 ml pożywki M22 w 30 ml uniwersalnej przezroczystej szklanej butelce z zakrętką i napromieniowano mieszając (~50 μmolm-2 s-1) przez 48 godzin sterylnym prętem magnetycznym. Następnie 30 ml hodowli zaszczepiono około 1 litrem kultury w tych samych warunkach, którą następnie wykorzystano do zaszczepienia około 9 litrów kultury naświetlanej z natężeniem ~200 μmolm-2 s-1 przez 72 godziny. Komórki zebrano przez wirowanie w 7132 RCF przez 30 minut, zawieszono w ~10 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) i przechowywano w temperaturze -20°C do momentu użycia.
Po rozmrożeniu, do zawieszonych komórek dodać kryształy deoksyrybonukleazy I (Merck, Wielka Brytania), lizozym (Merck, Wielka Brytania) oraz dwie tabletki inhibitora proteazy holoenzymu Roche (Merck, Wielka Brytania). W komorze ciśnieniowej French 20 000 psi (Aminco, USA) komórki rozbijano 8 do 12 razy. Po usunięciu nieuszkodzonych komórek i nierozpuszczalnych resztek poprzez wirowanie z prędkością 18 500 RCF przez 15 minut w temperaturze 4°C, membranę wytrącono z lizatu pigmentowanego poprzez wirowanie z prędkością 113 000 RCF przez 2 godziny w temperaturze 43 000°C. Odrzucić frakcję rozpuszczalną i zawiesić zabarwioną membranę w 100 do 200 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) i homogenizować do momentu, aż nie będzie widocznych agregatów. Zawieszoną membranę inkubowano w 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) z 2% (w/v) β-DDM przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4°C, delikatnie mieszając. Następnie odwirowano w temperaturze 70°C, aby rozpuścić 150 000 RCF w temperaturze 4°C przez 1 godzinę, usuwając resztkowe substancje nierozpuszczalne.
Membranę solubilizującą ze szczepu ΔpufW nałożono na kolumnę jonowymienną DEAE Sepharose o pojemności 50 ml z trzema objętościami kolumny (CV) buforu wiążącego [20 mM Tris-HCl (pH 8,0) zawierającym 0,03% (w/v) β-DDM]. Przemyto kolumnę dwoma buforami wiążącymi CV, a następnie przemyto ją dwoma buforami wiążącymi zawierającymi 50 mM NaCl. Kompleks RC-LH116 eluowano liniowym gradientem od 150 do 300 mM NaCl (w buforze wiążącym) przy 1,75 CV, a pozostały kompleks wiążący eluowano buforem wiążącym zawierającym 300 mM NaCl przy 0,5 CV. Zbierz widmo absorpcyjne w zakresie od 250 do 1000 nm, zachowaj frakcję o stosunku absorbancji (A880/A280) większym niż 1 w zakresie od 880 do 280 nm, rozcieńcz ją dwukrotnie w buforze wiążącym i powtórz tę samą procedurę na kolumnie DEAE podczas oczyszczania. Rozcieńcz frakcje o stosunku A880/A280 większym niż 1,7 i A880/A805 większym niż 3,0, przeprowadź trzecią rundę wymiany jonowej i zachowaj frakcje o stosunku A880/A280 większym niż 2,2 i A880/A805 większym niż 5,0. Częściowo oczyszczony kompleks zagęszczono do ~2 ml w filtrze wirówkowym Amicon o masie cząsteczkowej odcięcia (MWCO) 100 000 (Merck, Wielka Brytania) i naniesiono na kolumnę z wykluczeniem wielkościowym Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, USA) zawierającą 200 mM buforu NaCl, a następnie eluowano w tym samym buforze przy 1,5 CV. Zebrać widma absorpcji frakcji wykluczenia wielkościowego i zagęścić widma absorpcji przy stosunkach A880/A280 powyżej 2,4 i A880/A805 powyżej 5,8 do 100 A880, a następnie natychmiast użyć do przygotowania siatki krio-TEM lub przechowywania. Przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.
Membranę solubilizującą ze szczepu PufW-His nałożono na kolumnę HisPrep FF Ni-NTA Sepharose o pojemności 20 ml (20 mM Tris-HCl (pH 8,0) z dodatkiem 200 mM NaCl i 0,03% (w/w)) w buforze IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM). Kolumnę przemyto pięcioma objętościami buforu IMAC, a następnie pięcioma objętościami buforu IMAC zawierającymi 10 mM histydyny. Kompleks rdzeniowy wyeluowano z kolumny pięcioma objętościami buforów IMAC zawierającymi 100 mM histydyny. Frakcję zawierającą kompleks RC-LH114-W zagęszcza się do objętości ~10 ml w zbiorniku mieszającym wyposażonym w filtr Amicon 100 000 MWCO (Merck, Wielka Brytania), rozcieńcza 20-krotnie buforem wiążącym, a następnie dodaje do 25 ml. W kolumnie DEAE Sepharose cztery CV związane z buforem są używane wcześniej. Przemyj kolumnę czterema buforami wiążącymi CV, a następnie eluuj kompleks na ośmiu CV przy liniowym gradiencie od 0 do 100 mM NaCl (w buforze wiążącym), a pozostałe cztery CV zawierają 100 mM buforu wiążącego. Pozostałe kompleksy eluowane na frakcjach chlorku sodu w połączeniu ze stosunkiem A880/A280 wyższym niż 2,4 i stosunkiem A880/A805 wyższym niż 4,6 zagęszczono do ~2 ml w filtrze odśrodkowym Amicon 100 000 MWCO i wypełniono go wcześniej filtrem IMAC o pojemności 1,5 CV. Zrównoważono buforem kolumnę wykluczania wielkościowego Superdex 200 16/600, a następnie eluowano w tym samym buforze przez 1,5 CV. Zbierz widma absorpcyjne frakcji wykluczenia wielkościowego i zagęść widma absorpcyjne ze współczynnikami A880/A280 powyżej 2,1 i A880/A805 powyżej 4,6 do 100 A880, których natychmiast użyjesz do przygotowania zamrożonej siatki TEM lub przechowujesz w temperaturze -80°C do momentu użycia.
Do przygotowania siatek TEM o niskiej temperaturze użyto zamrażarki zanurzeniowej Leica EM GP. Kompleks rozcieńczono w buforze IMAC do A880 równego 50, a następnie 5 μl naniesiono na nowo wypolerowaną siatkę miedzianą QUANTIFOIL 1,2/1,3 pokrytą węglem (Agar Scientific, Wielka Brytania). Inkubować siatkę w temperaturze 20°C i wilgotności względnej 60% przez 30 sekund, następnie osuszyć ją przez 3 sekundy, a następnie schłodzić w ciekłym etanie w temperaturze -176°C.
Dane kompleksu RC-LH114-W zostały zarejestrowane na eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) za pomocą mikroskopu Titan Krios, który pracuje przy napięciu przyspieszającym 300 kV, z nominalnym powiększeniem 130 000x i energią - Wybierz przerwę 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum z detektorem szczytowym K2 został użyty do rejestrowania obrazów w trybie zliczania w celu zebrania danych. Skalibrowany rozmiar piksela wynosi 1,048 Å, a moc dawki wynosi 3,83 e-Å-2s-1. Zebrano film w ciągu 11 sekund i podzielono go na 40 części. Użyj obszaru pokrytego węglem, aby ponownie ustawić ostrość mikroskopu, a następnie zbierz trzy filmy na otwór. W sumie zebrano 3130 filmów z wartościami rozogniskowania od -1 do -3 μm.
Dane dotyczące kompleksu RC-LH116 zebrano za pomocą tego samego mikroskopu w Asterbury Biostructure Laboratory (Uniwersytet w Leeds, Wielka Brytania). Dane zebrano w trybie zliczania z powiększeniem 130 tys. pikseli, a rozmiar piksela skalibrowano do 1,065 Å i dawki 4,6 e-Å-2s-1. Film nagrano w ciągu 12 sekund i podzielono na 48 części. Łącznie zebrano 3359 filmów z wartościami rozogniskowania od -1 do -3 μm.
Całe przetwarzanie danych odbywa się w systemie Relion 3.0 (42). Użyj Motioncorr 2 (43) do korekcji ruchu wiązki poprzez ważenie dawki, a następnie użyj CTFFIND 4.1 (44) do określenia parametru CTF (funkcji transferu kontrastu). Typowe mikrofotografie po tych wstępnych etapach przetwarzania przedstawiono na rysunku 2. S16. Szablon automatycznej selekcji jest generowany poprzez ręczny wybór około 250 pikseli z 1000 cząstek w ramce 250 pikseli i bez odniesienia do dwuwymiarowej (2D) klasyfikacji, odrzucając w ten sposób klasyfikacje, które spełniają kryteria zanieczyszczenia próbki lub nie mają dostrzegalnych cech. Następnie przeprowadzono automatyczną selekcję na wszystkich mikrofotografiach, a kompleks RC-LH114-W zawierał 849 359 cząstek, a kompleks RC-LH116 476 547 cząstek. Wszystkie wybrane cząstki przeszły dwie rundy niereferencyjnej klasyfikacji 2D, a po każdym przebiegu cząstki, które spełniają wymagania obszaru węglowego, zanieczyszczenia próbki, braku oczywistych cech lub silnie nakładających się cząstek, są odrzucane, co daje odpowiednio 772 033 (90,9%) i 359 678 (75,5%) cząstek. Cząstki są używane do klasyfikacji 3D RC-LH114-W i RC-LH116. Początkowy referencyjny model 3D został wygenerowany przy użyciu metody stochastycznego spadku gradientu. Używając początkowego modelu jako odniesienia, wybrane cząstki są klasyfikowane do czterech kategorii w 3D. Używając modelu w tej kategorii jako odniesienia, wykonaj rafinację 3D na cząstkach w największej kategorii, a następnie użyj początkowego filtra dolnoprzepustowego 15Å, aby pokryć obszar rozpuszczalnika, dodaj 6 pikseli miękkich krawędzi i przetwórz piksele, aby skorygować szczytową funkcję przenoszenia modulacji Gatan K2 górnego detektora. W przypadku zbioru danych RC-LH114-W ten początkowy model został zmodyfikowany przez usunięcie silnej gęstości na krawędziach maski (odłączonej od gęstości kompleksu rdzeniowego w UCSF Chimera). Powstałe modele (rozdzielczości RC-LH114-W i RC-LH116 wynoszą odpowiednio 3,91 i 4,16 Å) są używane jako odniesienie w drugiej rundzie klasyfikacji 3D. Użyte cząstki są grupowane w początkowej klasie 3D i nie zawierają silnej korelacji z sąsiedztwem. Nakładanie się lub brak oczywistych cech strukturalnych. Po drugiej rundzie klasyfikacji 3D wybrano kategorię o najwyższej rozdzielczości [W przypadku RC-LH114-W jedną kategorią jest 377 703 cząstki (44,5%), w przypadku RC-LH116 istnieją dwie kategorie, łącznie 260 752 cząstki (54,7%), gdzie są one takie same tylko wtedy, gdy są wyrównane po początkowym obrocie z niewielką różnicą]. Wybrane cząstki są ponownie ekstrahowane w polu o rozdzielczości 400 pikseli i udoskonalane przez udoskonalanie 3D. Maska rozpuszczalnika jest generowana przy użyciu początkowego filtra dolnoprzepustowego 15Å, rozszerzenia mapy o 3 piksele i 3-pikselowej maski miękkiej. Po każdym kroku przeprowadzane jest udoskonalanie CTF dla każdej cząstki, korekcja ruchu dla każdej cząstki oraz druga runda udoskonalania CTF dla każdej cząstki, udoskonalanie 3D, maskowanie rozpuszczalnika i przetwarzanie końcowe w celu dalszego udoskonalenia powstałej tekstury. Przy użyciu wartości odcięcia FSC (współczynnika korelacji powłoki Fouriera) wynoszącej 0,143, rozdzielczości ostatecznych modeli RC-LH114-W i RC-LH116 wynoszą odpowiednio 2,65 i 2,80Å. Krzywa FSC ostatecznego modelu jest pokazana na rysunku 2. S17.
Wszystkie sekwencje białkowe pobrano z bazy UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Do skonstruowania modelu homologicznego RC wykorzystano model SWISS-MODEL (45), który zawiera sekwencje białkowe RC-L, RC-M i RC-H oraz strukturę krystaliczną Rba. Jako szablon wykorzystano sphaeroides RC (PDB ID: 5LSE) (46). Użyj narzędzia „dopasuj mapę” w UCSF Chimera, aby dopasować wygenerowany model do mapy (47), poprawić strukturę białka i dodać kofaktor [4×BChl a (nazwa reszty w bibliotece monomerów = BCL), 2×BPh a (BPH), jeden lub dwa rodzaje UQ10 (U10), jedno żelazo niehemowe (Fe) i jedną 3,4-dihydroheksakarbonylocholinę (QAK)] za pomocą Coot (48). Ponieważ QAK nie jest dostępny w bibliotece monomerów, sparametryzowano go za pomocą narzędzia eLBOW w PHENIX (49).
Następnie skonstruowano podjednostkę LH1. Początkowo, narzędzie automatycznej konstrukcji w PHENIX (49) zostało użyte do automatycznego skonstruowania części sekwencji LH1 przy użyciu mapy i sekwencji białek LH1-α i LH1-β jako danych wejściowych. Wybierz najpełniejszą podjednostkę LH1, wyodrębnij ją i załaduj do Coot, ręcznie dodaj brakującą sekwencję i ręcznie udoskonal całą strukturę przed dodaniem dwóch BCl a (BCL) i spirilloksantyny (CRT) [zgodnie z odpowiednimi Rps Gęstość kompleksu LH1 i znana zawartość karotenoidów. Gatunek (17)]. Skopiuj kompletną podjednostkę LH1 i użyj narzędzia „Docking Map Tool” Chimera UCSF, aby zadokować ją w sąsiednim, niemodelowym obszarze gęstości LH1, a następnie udoskonal ją w Coot; powtarzaj proces, aż wszystkie podjednostki LH1 zostaną wymodelowane. W przypadku struktury RC-LH114-W, poprzez ekstrakcję nieprzydzielonej gęstości w Coot, białko jest segmentowane od pozostałych niebiałkowych składników na mapie chimery USCF, a narzędzie Autobuild jest używane do ustalenia początkowego modelu i pozostałych podjednostek (białko-W). Modelowanie w PHENIX (49). Dodaj wszelkie brakujące sekwencje do powstałego modelu w Coot (48), a następnie ręcznie udoskonal całą podjednostkę. Pozostała nieprzydzielona gęstość pasuje do kombinacji lipidów (identyfikator biblioteki monomerów PDB CDL = CDL, POPC = 6PL i POPG = PGT), detergentu β-DDM (LMT) i cząsteczek UQ10 (U10). Użyj optymalizacji PHENIX (49) i ręcznej optymalizacji w Coot (48), aby udoskonalić kompletny początkowy model, aż statystyki modelu i wizualna jakość dopasowania nie będą mogły być dalej ulepszone. Na koniec użyj LocScale (50) do wyostrzenia mapy lokalnej, a następnie wykonaj kilka innych cykli modelowania nieprzydzielonej gęstości oraz automatycznej i ręcznej optymalizacji.
Odpowiednie peptydy, kofaktory i inne lipidy oraz chinony zadokowane w obrębie swoich gęstości przedstawiono na rysunkach 1 i 2. S18 do S23. Informacje statystyczne dotyczące ostatecznego modelu przedstawiono w tabeli S1.
Jeżeli nie określono inaczej, widma absorpcji UV/Vis/NIR zbierano na spektrofotometrze Cary60 (Agilent, USA) w odstępach 1 nm od 250 nm do 1000 nm i czasie integracji 0,1 s.
Rozcieńczyć próbkę w kuwecie kwarcowej o ścieżce 2 mm do A880 równej 1 i zarejestrować widmo absorpcyjne w zakresie od 400 do 1000 nm. Widma dichroiczne kołowe zarejestrowano na spektropolarymetrze Jasco 810 (Jasco, Japonia) w odstępach co 1 nm w zakresie od 400 nm do 950 nm, z szybkością skanowania 20 nm/min.
Współczynnik ekstynkcji molowej określa się przez rozcieńczenie kompleksu rdzeniowego do A880 wynoszącego około 50. Rozcieńczyć objętość 10 μl w 990 μl buforu wiążącego lub metanolu i natychmiast zebrać widmo absorpcyjne, aby zminimalizować degradację BChl. Zawartość BChl w każdej próbce metanolu obliczono za pomocą współczynnika ekstynkcji przy 771 nm wynoszącego 54,8 mM-1 cm-1, a współczynnik ekstynkcji określono (51). Podzielić zmierzone stężenie BChl przez 32 (RC-LH114-W) lub 36 (RC-LH116), aby określić stężenie kompleksu rdzeniowego, które następnie wykorzystano do określenia widma absorpcyjnego tej samej próbki zebranej w buforze Współczynnik ekstynkcji. równolegle. Dla każdej próbki wykonano trzy powtórzone pomiary, a do obliczeń użyto średniej absorbancji maksimum BChl Qy. Współczynnik ekstynkcji RC-LH114-W mierzony przy długości fali 878 nm wynosi 3280±140 mM-1 cm-1, natomiast współczynnik ekstynkcji RC-LH116 mierzony przy długości fali 880 nm wynosi 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 oznaczono ilościowo zgodnie z metodą opisaną w (52). Krótko mówiąc, chromatografię cieczową z odwróconą fazą (RP-HPLC) wykonano przy użyciu systemu Agilent 1200 HPLC. Rozpuścić około 0,02 nmol RC-LH116 lub RC-LH114-W w 50 μl mieszaniny metanol:chloroform w proporcji 50:50, zawierającej 0,02% (w/v) chlorku żelazowego, a następnie wstrzyknąć wstępnie zrównoważoną ultrasferę Beckman Coulter ODS 4,6 mm. Rozpuścić w 1 ml-1 min-1 w temperaturze 40°C w rozpuszczalniku HPLC (80:20 metanol:2-propanol) na kolumnie o średnicy 25 cm. Przeprowadź elucję izokratyczną w rozpuszczalniku HPLC, aby monitorować absorbancję przy długości fali 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoidy) i 780 nm (BChl) przez 1 godzinę. Zintegrowano pik na chromatogramie przy długości fali 275 nm po 25,5 minucie, który nie zawierał żadnych innych wykrywalnych związków. Obszar integracji służy do obliczenia stężenia molowego wyekstrahowanego UQ10 w odniesieniu do krzywej kalibracyjnej obliczonej na podstawie wstrzyknięcia czystych standardów od 0 do 5,8 nmol (rysunek S14). Każdą próbkę analizowano w trzech powtórzeniach, a zgłoszony błąd odpowiada odchyleniu standardowemu średniej.
Przygotowano roztwór zawierający kompleks RC-LH1 o maksymalnej absorpcji Qy wynoszącej 0,1 przy użyciu 30 μM zredukowanego cytochromu c2 z serca końskiego (Merck, Wielka Brytania) i 0 do 50 μMUQ2 (Merck, Wielka Brytania). Przygotowano trzy próbki o objętości 1 ml dla każdego stężenia UQ2 i inkubowano je przez noc w ciemności w temperaturze 4°C, aby zapewnić pełną adaptację do ciemności przed pomiarem. Roztwór wprowadzono do modułowego spektrofotometru OLIS RSM1000 wyposażonego w płomień 300 nm/siatkę dyfrakcyjną 500, wlot 1,24 mm, środek 0,12 mm i wylot 0,6 mm. Na wejściu fotokomórki próbki i referencyjnego fotopowielacza umieszczono filtr przepuszczający o długości fali 600 nm, aby wykluczyć światło wzbudzające. Absorbancję monitorowano przy długości fali 550 nm z czasem integracji 0,15 s. Światło wzbudzające jest emitowane z diody LED M880F2 (dioda elektroluminescencyjna) o długości fali 880 nm (Thorlabs Ltd., Wielka Brytania) przez światłowód o natężeniu 90% za pośrednictwem kontrolera DC2200 (Thorlabs Ltd., Wielka Brytania) i jest emitowane do źródła światła pod kątem 90°. Wiązka pomiarowa jest skierowana przeciwnie do lustra, aby odbić światło, które nie zostało początkowo zaabsorbowane przez próbkę. Monitoruj absorbancję 10 s przed oświetleniem trwającym 50 s. Następnie absorbancję monitorowano przez 60 s w ciemności, aby ocenić, w jakim stopniu chinolol spontanicznie redukuje cytochrom c23+ (patrz rysunek S8 dla danych surowych).
Dane przetworzono, dopasowując liniową szybkość początkową w zakresie od 0,5 do 10 s (w zależności od stężenia UQ2) i uśredniając szybkości wszystkich trzech próbek dla każdego stężenia UQ2. Stężenie RC-LH1 obliczone na podstawie odpowiedniego współczynnika ekstynkcji wykorzystano do przeliczenia szybkości na wydajność katalityczną, wykreśloną w programie Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) i dopasowaną do modelu Michaelisa-Mentena w celu określenia pozornych wartości Km i Kcat.
Do pomiarów absorpcji przejściowej próbkę RC-LH1 rozcieńczono do stężenia ~2 μM w buforze IMAC zawierającym 50 mM askorbinianu sodu (Merck, USA) i 0,4 mM terbutyny (Merck, USA). Kwas askorbinowy jest stosowany jako ofiarny donor elektronów, a tert-butaklofen jako inhibitor QB, aby zapewnić, że główny donor RC pozostaje zredukowany (tj. nie ulega fotoutlenieniu) przez cały proces pomiaru. Około 3 ml próbki dodaje się do specjalnej obrotowej kuwety (o średnicy około 0,1 m, 350 obr./min) o długości drogi optycznej 2 mm, aby zapewnić próbce na ścieżce lasera wystarczająco dużo czasu na adaptację do ciemności między impulsami wzbudzenia. Użyj impulsów laserowych o długości ~100 fs do wzmocnienia systemu laserowego Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) w celu wzbudzenia próbki światłem o długości fali 880 nm z częstotliwością powtarzania 1 kHz (20 nJ dla NIR lub 100 nJ dla Vis). Przed zebraniem danych wyeksponuj próbkę na światło wzbudzające przez około 30 minut. Ekspozycja spowoduje inaktywację QA (prawdopodobnie zmniejszając QA raz lub dwa razy). Należy jednak pamiętać, że proces ten jest odwracalny, ponieważ po długim okresie adaptacji do ciemności, RC powoli powróci do aktywności QA. Do pomiaru widm przejściowych z opóźnieniem od -10 do 7000 ps użyto spektrometru Helios (Ultrafast Systems, USA). Użyj oprogramowania Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) do rozgrupowania zbiorów danych, a następnie scal je i znormalizuj. Użyj pakietu oprogramowania CarpetView (Light Conversion Ltd., Litwa), aby użyć połączonego zestawu danych w celu uzyskania widm różniczkowych związanych z rozpadem, lub użyj funkcji, która splata wiele wykładników z odpowiedzią instrumentu, aby dopasować ewolucję widmową pojedynczej długości fali w Origin (OriginLab, USA).
Jak wspomniano powyżej (53), przygotowano film fotosyntetyczny zawierający kompleks LH1, pozbawiony zarówno anteny RC, jak i peryferyjnej anteny LH2. Membranę rozcieńczono w 20 mM Tris (pH 8,0), a następnie umieszczono w kuwecie kwarcowej o ścieżce optycznej 2 mm. Do wzbudzenia próbki przy długości fali 540 nm użyto impulsu laserowego o energii 30 nJ z czasem opóźnienia od -10 do 7000 ps. Przetworzyć zbiór danych zgodnie z opisem dla próbki Rps.pal.
Membranę odwirowano przy 150 000 RCF przez 2 godziny w temperaturze 4°C, a następnie jej absorbancję przy 880 nm zawieszono w 20 mM tris-HCl (pH 8,0) i 200 mM NaCl. Rozpuszczono membranę, powoli mieszając w 2% (w/v) β-DDM przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4°C. Próbkę rozcieńczono w 100 mM węglanie trietyloamoniowym (pH 8,0) (TEAB; Merck, Wielka Brytania) do stężenia białka 2,5 mg ml-1 (analiza Bio-Rad). Dalsze przetwarzanie przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą (54), zaczynając od rozcieńczenia 50 μg białka w sumie 50 μl TEAB zawierającego 1% (w/v) laurynianu sodu (Merck, Wielka Brytania). Po sonikacji przez 60 s, zredukowano ją 5 mM tris(2-karboksyetylo)fosfiną (Merck, Wielka Brytania) w temperaturze 37°C przez 30 minut. W celu S-alkilacji, inkubować próbkę z 10 mM metylu S-metylotiometanosulfonianu (Merck, Wielka Brytania) i dodać go z 200 mM roztworu macierzystego izopropanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Trawienie proteolityczne przeprowadzono poprzez dodanie 2 μg mieszaniny trypsyny/endoproteinazy Lys-C (Promega Wielka Brytania) i inkubację w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Surfaktant laurynianowy ekstrahowano poprzez dodanie 50 μl octanu etylu i 10 μl 10% (v/v) kwasu trifluorooctowego o czystości LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania) i worteksowanie przez 60 s. Rozdział faz przyspieszono poprzez wirowanie z prędkością 15 700 RCF przez 5 minut. Zgodnie z protokołem producenta, do ostrożnego odessania i odsalania dolnej fazy zawierającej peptyd użyto kolumny wirówkowej C18 (Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania). Po wysuszeniu metodą wirowania próżniowego próbkę rozpuszczono w 0,5% roztworze TFA i 3% acetonitrylu, a 500 ng analizowano metodą nanoprzepływowej chromatografii RP sprzężonej ze spektrometrią mas, z wykorzystaniem parametrów systemu opisanych wcześniej.
Do identyfikacji i kwantyfikacji białek należy użyć programu MaxQuant w wersji 1.5.3.30 (56) w celu wyszukania bazy danych proteomów Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Dane proteomiczne spektrometrii mas zostały zdeponowane w ProteomeXchange Alliance za pośrednictwem repozytorium partnerów PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) pod identyfikatorem zbioru danych PXD020402.
Do analizy metodą RPLC sprzężonej ze spektrometrią mas z jonizacją elektrosprayową kompleks RC-LH1 przygotowano z dzikiego typu Rps. Stosując wcześniej opublikowaną metodę (16), stężenie białka wytworzonego w komórkach palustris wynosiło 2 mg ml-1 w 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl i 0,03% (w/v) β- (analiza Bio-Rad) ) DDM. Zgodnie z protokołem producenta, użyj zestawu do oczyszczania 2D (GE Healthcare, USA) do ekstrakcji 10 μg białka metodą precypitacji i rozpuść osad w 20 μl 60% (v/v) kwasu mrówkowego (FA), 20% (v/v) acetonitrylu i 20% (v/v) wody. Pięć mikrolitrów przeanalizowano metodą RPLC (Dionex RSLC) sprzężoną ze spektrometrią mas (Maxis UHR-TOF, Bruker). Do rozdziału w temperaturze 60°C i przy szybkości przepływu 100 μlmin -1 użyto kolumny MabPac 1,2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania) z gradientem od 85% (v/v) rozpuszczalnika A [0,1% (v/v) FA i 0,02% (v/v) wodny roztwór TFA] do 85% (v/v) rozpuszczalnika B [0,1% (v/v) FA i 0,02% (v/v) w 90% (v/v) acetonitrylu TFA]. Przy użyciu standardowego źródła jonizacji elektrospray i domyślnych parametrów przez ponad 60 minut, spektrometr masowy uzyskuje od 100 do 2750 m/z (stosunek masy do ładunku). Korzystając z narzędzia FindPept, portalu zasobów bioinformatycznych ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), zmapuj widmo masowe na podjednostki kompleksu.
Komórki hodowano przez 72 godziny w 100 ml światła NF-niskiego (10 μMm-2 s-1), średniego (30 μMm-2 s-1) lub wysokiego (300 μMm-2 s-1). Medium M22 (w którym pominięto siarczan amonu, a bursztynian sodu zastąpiono octanem sodu) w 100 ml butelce z zakrętką (23). W pięciu 30-sekundowych cyklach, 0,1-mikronowe szklane kulki były nanoszone w stosunku objętości 1:1 w celu lizy komórek i chłodzone na lodzie przez 5 minut. Substancje nierozpuszczalne, nieuszkodzone komórki i szklane kulki usunięto przez wirowanie przy 16 000 RCF przez 10 minut w mikrowirówce laboratoryjnej. Membranę rozdzielono w rotorze Ti 70.1 przy użyciu 100 000 RCF w 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) przy gradiencie sacharozy 40/15% (w/w) przez 10 godzin.
Jak opisano w naszej poprzedniej pracy, immunodetekcja znacznika His na PufW (16). W skrócie, oczyszczony kompleks rdzeniowy (11,8 nM) lub membrana zawierająca to samo stężenie RC (określone przez odjęcie zredukowanego widma różnicowego od utleniania i dopasowanie obciążenia do barwionego żelu) w buforze ładującym 2x SDS (Merck, Wielka Brytania) rozcieńczono dwukrotnie. Białka rozdzielono na replikowanym żelu 12% bis-tris NuPage (Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania). Żel barwiono błękitem brylantowym Coomassie (Bio-Rad, Wielka Brytania) w celu naniesienia i uwidocznienia podjednostki RC-L. Białko z drugiego żelu przeniesiono na aktywowaną metanolem membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) (Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania) w celu przeprowadzenia testu immunologicznego. Membranę PVDF zablokowano w 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 i 5% (w/v) odtłuszczonego mleka w proszku, a następnie inkubowano z pierwotnym przeciwciałem anty-His (w buforze rozcieńczającym przeciwciało [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl i 0,05% (v/v) Tween-20] w stosunku 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) przez 4 godziny. Po 3-krotnym płukaniu przez 5 minut w buforze przeciwciał, membranę połączono z peroksydazą chrzanową (Sigma-Aldrich, Wielka Brytania) z przeciwciałem drugorzędowym anty-mysim (rozcieńczonym 1:10 000 w buforze przeciwciał). Inkubowano, aby umożliwić detekcję (5 minut po 3 płukaniach w buforze przeciwciał), przy użyciu substratu chemiluminescencyjnego WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Włochy) i urządzenia Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Wielka Brytania).
Rysując rozkład intensywności każdego barwionego żelu lub pasma immunoanalizy, całkując obszar pod szczytem i obliczając stosunek intensywności RC-L (barwiony żel) i białka W (immunoanaliza), w programie ImageJ (57) przetwórz obraz. Stosunki te przeliczono na stosunki molowe, zakładając, że stosunek RC-L do białka W w czystej próbce RC-LH114-W wynosi 1:1 i odpowiednio normalizując cały zestaw danych.
Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć na stronie http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Niniejszy artykuł jest udostępniany w otwartym dostępie na warunkach licencji Creative Commons Attribution License. Artykuł zezwala na nieograniczone wykorzystanie, dystrybucję i reprodukcję w dowolnym medium pod warunkiem prawidłowego cytowania oryginalnego dzieła.
Uwaga: Prosimy o podanie adresu e-mail tylko po to, aby osoba, którą polecasz na stronie, wiedziała, że ​​chcesz, aby otrzymała wiadomość e-mail i że nie jest to spam. Nie będziemy przechwytywać żadnych adresów e-mail.
To pytanie służy do sprawdzenia, czy jesteś gościem, i zapobiegania automatycznemu wysyłaniu spamu.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Wysokorozdzielcza struktura kompleksu pułapki świetlnej 1 w centrum reakcji dostarcza nowych informacji na temat dynamiki chinonu.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Wysokorozdzielcza struktura kompleksu pułapki świetlnej 1 w centrum reakcji dostarcza nowych informacji na temat dynamiki chinonu.
©2021 Amerykańskie Stowarzyszenie Postępu Nauki. wszelkie prawa zastrzeżone. AAAS jest partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.