Artykuł jest częścią tematu badawczego „Zaawansowane technologie bioremediacji i procesy recyklingu syntetycznych związków organicznych (SOC)”. Zobacz wszystkie 14 artykułów
Niskocząsteczkowe wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), takie jak naftalen i podstawione naftaleny (metylonaftalen, kwas naftoesowy, 1-naftylo-N-metylokarbaminian itp.), są szeroko stosowane w różnych gałęziach przemysłu i są genotoksyczne, mutagenne i/lub rakotwórcze dla organizmów. Te syntetyczne związki organiczne (SOC) lub ksenobiotyki są uważane za priorytetowe zanieczyszczenia i stanowią poważne zagrożenie dla globalnego środowiska i zdrowia publicznego. Intensywność działalności człowieka (np. zgazowanie węgla, rafinacja ropy naftowej, emisje z pojazdów i zastosowania rolnicze) determinuje stężenie, los i transport tych wszechobecnych i trwałych związków. Oprócz fizycznych i chemicznych metod oczyszczania/usuwania, zielone i przyjazne dla środowiska technologie, takie jak bioremediacja, wykorzystujące mikroorganizmy zdolne do całkowitego rozkładu WWA lub przekształcania ich w nietoksyczne produkty uboczne, wyłoniły się jako bezpieczna, opłacalna i obiecująca alternatywa. Różne gatunki bakterii należące do typów Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia i Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus i Paenibacillus) oraz Actinobacteria (Rhodococcus i Arthrobacter) w mikrobiomie glebowym wykazały zdolność do degradacji różnych związków organicznych. Badania metaboliczne, genomika i analiza metagenomiczna pomagają nam zrozumieć złożoność i różnorodność kataboliczną tych prostych form życia, co może być wykorzystane do efektywnej biodegradacji. Długotrwałe istnienie WWA doprowadziło do powstania nowych fenotypów degradacji poprzez horyzontalny transfer genów z wykorzystaniem elementów genetycznych, takich jak plazmidy, transpozony, bakteriofagi, wyspy genomowe i integracyjne elementy koniugacyjne. Biologia systemowa i inżynieria genetyczna określonych izolatów lub społeczności modelowych (konsorcja) mogą umożliwić kompleksową, szybką i skuteczną bioremediację tych WWA poprzez efekty synergistyczne. W niniejszym przeglądzie skupiamy się na różnych szlakach metabolicznych i ich różnorodności, składzie genetycznym i jego różnorodności oraz reakcjach/adaptacjach komórkowych bakterii degradujących naftalen i podstawione naftaleny. Dostarczy to informacji ekologicznych do zastosowań polowych i optymalizacji szczepów w celu efektywnej bioremediacji.
Szybki rozwój przemysłu (petrochemicznego, rolniczego, farmaceutycznego, barwników tekstylnych, kosmetycznego itp.) przyczynił się do globalnego dobrobytu gospodarczego i poprawy standardów życia. Ten wykładniczy rozwój doprowadził do produkcji dużej liczby syntetycznych związków organicznych (SOC), które są wykorzystywane do wytwarzania różnych produktów. Do tych związków obcych, czyli SOC, należą wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), pestycydy, herbicydy, plastyfikatory, barwniki, produkty farmaceutyczne, związki fosforoorganiczne, środki zmniejszające palność, lotne rozpuszczalniki organiczne itp. Są one emitowane do atmosfery, ekosystemów wodnych i lądowych, gdzie wywierają wielowymiarowy wpływ, powodując szkodliwe skutki dla różnych bioform poprzez zmianę właściwości fizykochemicznych i struktury zbiorowisk (Petrie i in., 2015; Bernhardt i in., 2017; Sarkar i in., 2020). Wiele zanieczyszczeń aromatycznych wywiera silny i destrukcyjny wpływ na wiele nienaruszonych ekosystemów/ośrodków bioróżnorodności (np. rafy koralowe, pokrywy lodowe Arktyki/Antarktydy, jeziora wysokogórskie, osady głębinowe itp.) (Jones 2010; Beyer i in. 2020; Nordborg i in. 2020). Najnowsze badania geomikrobiologiczne wykazały, że depozycja syntetycznej materii organicznej (np. zanieczyszczeń aromatycznych) i jej pochodnych na powierzchniach sztucznych konstrukcji (środowiska zabudowanego) (np. obiektów dziedzictwa kulturowego i pomników wykonanych z granitu, kamienia, drewna i metalu) przyspiesza ich degradację (Gadd 2017; Liu i in. 2018). Działalność człowieka może nasilać i pogarszać biologiczną degradację zabytków i budynków poprzez zanieczyszczenie powietrza i zmiany klimatu (Liu i in. 2020). Te zanieczyszczenia organiczne reagują z parą wodną w atmosferze i osadzają się na konstrukcji, powodując fizyczną i chemiczną degradację materiału. Biodegradacja jest powszechnie uznawana za niepożądane zmiany w wyglądzie i właściwościach materiałów, wywołane przez organizmy żywe, które wpływają na ich zachowanie (Pochon i Jaton, 1967). Dalsze działanie mikroorganizmów (metabolizm) tych związków może zmniejszyć integralność strukturalną, skuteczność konserwacji i wartość kulturową (Gadd, 2017; Liu i in., 2018). Z drugiej strony, w niektórych przypadkach stwierdzono, że adaptacja i reakcja mikroorganizmów do tych struktur jest korzystna, ponieważ tworzą one biofilmy i inne ochronne skorupy, które spowalniają tempo rozkładu (Martino, 2016). Dlatego opracowanie skutecznych, długoterminowych i zrównoważonych strategii konserwacji zabytków kamiennych, metalowych i drewnianych wymaga dogłębnego zrozumienia kluczowych procesów zaangażowanych w ten proces. W porównaniu z procesami naturalnymi (procesy geologiczne, pożary lasów, erupcje wulkaniczne, reakcje roślin i bakterii), działalność człowieka powoduje uwalnianie do ekosystemów dużych ilości wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) i innego węgla organicznego (OC). Wiele WWA stosowanych w rolnictwie (insektycydy i pestycydy, takie jak DDT, atrazyna, karbaryl, pentachlorofenol itp.), przemyśle (ropa naftowa, osady/odpady olejowe, tworzywa sztuczne pochodzenia ropopochodnego, PCB, plastyfikatory, detergenty, środki dezynfekujące, fumiganty, substancje zapachowe i konserwanty), produktach do pielęgnacji ciała (kremy przeciwsłoneczne, środki dezynfekujące, repelenty na owady i piżma wielopierścieniowe) oraz amunicji (materiały wybuchowe, takie jak 2,4,6-TNT) to potencjalne ksenobiotyki, które mogą wpływać na zdrowie planety (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna i Phale, 2008; Petrie i in., 2015). Listę tę można rozszerzyć o związki ropopochodne (oleje opałowe, smary, asfalteny), biotworzywa o dużej masie cząsteczkowej oraz ciecze jonowe (Amde i in., 2015). Tabela 1 przedstawia listę różnych zanieczyszczeń aromatycznych i ich zastosowań w różnych gałęziach przemysłu. W ostatnich latach antropogeniczne emisje lotnych związków organicznych, a także dwutlenku węgla i innych gazów cieplarnianych zaczęły rosnąć (Dvorak i in., 2017). Jednakże oddziaływanie antropogeniczne znacznie przewyższa oddziaływanie naturalne. Ponadto stwierdziliśmy, że wiele substancji SOC utrzymuje się w wielu środowiskach i zostało zidentyfikowanych jako nowe zanieczyszczenia o niekorzystnym wpływie na biomy (rysunek 1). Agencje ochrony środowiska, takie jak Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (USEPA), umieściły wiele z tych zanieczyszczeń na swojej liście priorytetów ze względu na ich właściwości cytotoksyczne, genotoksyczne, mutagenne i rakotwórcze. Dlatego konieczne są surowe przepisy dotyczące utylizacji i skuteczne strategie przetwarzania/usuwania odpadów z zanieczyszczonych ekosystemów. Różne metody przetwarzania fizycznego i chemicznego, takie jak piroliza, utleniające przetwarzanie termiczne, napowietrzanie powietrza, składowanie na składowiskach, spalanie itp., są nieskuteczne i kosztowne, a także generują żrące, toksyczne i trudne do oczyszczenia produkty uboczne. Wraz ze wzrostem globalnej świadomości ekologicznej, mikroorganizmy zdolne do degradacji tych zanieczyszczeń i ich pochodnych (takich jak halogenowane, nitrowe, alkilowe i/lub metylowe) cieszą się coraz większym zainteresowaniem (Fennell i in., 2004; Haritash i Kaushik, 2009; Phale i in., 2020; Sarkar i in., 2020; Schwanemann i in., 2020). Wykorzystanie tych rodzimych mikroorganizmów kandydujących, samodzielnie lub w kulturach mieszanych (koloniach), do usuwania zanieczyszczeń aromatycznych ma zalety pod względem bezpieczeństwa środowiskowego, kosztów, wydajności, skuteczności i zrównoważonego rozwoju. Naukowcy badają również integrację procesów mikrobiologicznych z elektrochemicznymi metodami redoks, a mianowicie systemami bioelektrochemicznymi (BES), jako obiecującą technologię oczyszczania/usuwania zanieczyszczeń (Huang i in., 2011). Technologia BES cieszy się coraz większym zainteresowaniem ze względu na wysoką wydajność, niskie koszty, bezpieczeństwo środowiskowe, możliwość pracy w temperaturze pokojowej, materiały biokompatybilne oraz możliwość odzyskiwania cennych produktów ubocznych (np. energii elektrycznej, paliwa i chemikaliów) (Pant i in., 2012; Nazari i in., 2020). Pojawienie się wysokoprzepustowych narzędzi/metod sekwencjonowania genomu i omiki dostarczyło mnóstwa nowych informacji na temat regulacji genetycznej, proteomiki i fluksomiki reakcji różnych mikroorganizmów degradujących. Połączenie tych narzędzi z biologią systemów dodatkowo pogłębiło naszą wiedzę na temat selekcji i precyzyjnego dostrajania docelowych szlaków katabolicznych w mikroorganizmach (tj. projektowania metabolicznego) w celu osiągnięcia wydajnej i efektywnej biodegradacji. Aby zaprojektować skuteczne strategie bioremediacji z wykorzystaniem odpowiednich mikroorganizmów kandydujących, musimy zrozumieć potencjał biochemiczny, różnorodność metaboliczną, skład genetyczny i ekologię (autoekologię/synekologię) mikroorganizmów.
Rys. 1. Źródła i szlaki przemieszczania się niskocząsteczkowych WWA w różnych środowiskach i różnych czynnikach wpływających na biotę. Linie przerywane przedstawiają interakcje między elementami ekosystemu.
W niniejszym przeglądzie podjęliśmy próbę podsumowania danych dotyczących degradacji prostych WWA, takich jak naftalen i podstawione naftaleny, przez różne izolaty bakteryjne, uwzględniając szlaki metaboliczne i ich różnorodność, enzymy biorące udział w degradacji, skład/zawartość i różnorodność genów, odpowiedzi komórkowe oraz różne aspekty bioremediacji. Zrozumienie poziomu biochemicznego i molekularnego pomoże w identyfikacji odpowiednich szczepów gospodarza i ich dalszej inżynierii genetycznej w celu skutecznej bioremediacji tak priorytetowych zanieczyszczeń. Pomoże to w opracowaniu strategii tworzenia specyficznych dla danego miejsca konsorcjów bakteryjnych w celu skutecznej bioremediacji.
Obecność dużej liczby toksycznych i niebezpiecznych związków aromatycznych (spełniających regułę Hückela 4n + 2π elektronów, n = 1, 2, 3, …) stanowi poważne zagrożenie dla różnych mediów środowiskowych, takich jak powietrze, gleba, osady oraz wody powierzchniowe i gruntowe (Puglisi i in., 2007). Związki te posiadają pojedyncze pierścienie benzenowe (monocykliczne) lub wiele pierścieni benzenowych (policykliczne) ułożonych liniowo, kątowo lub w formie klastrów i wykazują stabilność (stabilność/niestabilność) w środowisku dzięki wysokiej ujemnej energii rezonansowej i bezwładności (inertności), co można wyjaśnić ich hydrofobowością i stanem zredukowanym. Po dalszym zastąpieniu pierścienia aromatycznego grupami metylowymi (-CH3), karboksylowymi (-COOH), hydroksylowymi (-OH) lub sulfonianowymi (-HSO3), staje się on bardziej stabilny, ma silniejsze powinowactwo do makrocząsteczek i jest bioakumulacyjny w układach biologicznych (Seo i in., 2009; Phale i in., 2020). Niektóre wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne o niskiej masie cząsteczkowej (LMWAH), takie jak naftalen i jego pochodne [metylonaftalen, kwas naftoesowy, naftalenosulfonian i 1-naftylo-N-metylokarbaminian (karbaryl)], zostały wpisane na listę priorytetowych zanieczyszczeń organicznych Agencji Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (EPA) jako genotoksyczne, mutagenne i/lub rakotwórcze (Cerniglia, 1984). Uwolnienie tej klasy NM-WWA do środowiska może skutkować bioakumulacją tych związków na wszystkich poziomach łańcucha pokarmowego, wpływając tym samym na zdrowie ekosystemów (Binkova i in., 2000; Srogi, 2007; Quinn i in., 2009).
Źródła i drogi przedostawania się WWA do bioty to przede wszystkim migracja i interakcje między różnymi składnikami ekosystemów, takimi jak gleba, wody gruntowe, wody powierzchniowe, uprawy i atmosfera (Arey i Atkinson, 2003). Rysunek 1 przedstawia interakcje i rozmieszczenie różnych WWA o niskiej masie cząsteczkowej w ekosystemach oraz ich drogi przedostawania się do bioty/narażenia człowieka. WWA osadzają się na powierzchniach w wyniku zanieczyszczenia powietrza oraz poprzez migrację (dryfowanie) emisji samochodowych, spalin przemysłowych (gazyfikacja węgla, spalanie i produkcja koksu) i ich depozycję. Działalność przemysłowa, taka jak produkcja tekstyliów syntetycznych, barwników i farb; konserwacja drewna; przetwórstwo gumy; produkcja cementu; produkcja pestycydów; oraz zastosowania rolnicze są głównymi źródłami WWA w systemach lądowych i wodnych (Bamforth i Singleton, 2005; Wick i in., 2011). Badania wykazały, że gleby na obszarach podmiejskich i miejskich, w pobliżu autostrad oraz w dużych miastach są bardziej podatne na wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) ze względu na emisje z elektrowni, ogrzewania domów, obciążenia ruchem lotniczym i drogowym oraz działalność budowlaną (Suman i in., 2016). (2008) wykazali, że stężenie WWA w glebie w pobliżu dróg w Nowym Orleanie w Luizjanie w USA sięgało 7189 μg/kg, podczas gdy na otwartej przestrzeni wynosiło zaledwie 2404 μg/kg. Podobnie, poziomy WWA sięgające 300 μg/kg odnotowano w obszarach w pobliżu instalacji zgazowania węgla w kilku miastach USA (Kanaly i Harayama, 2000; Bamforth i Singleton, 2005). Gleby z różnych indyjskich miast, takich jak Delhi (Sharma i in., 2008), Agra (Dubey i in., 2014), Bombaj (Kulkarni i Venkataraman, 2000) i Visakhapatnam (Kulkarni i in., 2014), wykazują wysokie stężenia WWA. Związki aromatyczne łatwiej adsorbują się na cząsteczkach gleby, materii organicznej i minerałach ilastych, stając się w ten sposób głównymi pochłaniaczami węgla w ekosystemach (Srogi, 2007; Peng i in., 2008). Głównymi źródłami WWA w ekosystemach wodnych są opady (mokre/suche opady i para wodna), spływy miejskie, zrzuty ścieków, zasilanie wód gruntowych itp. (Srogi, 2007). Szacuje się, że około 80% WWA w ekosystemach morskich pochodzi z opadów atmosferycznych, sedymentacji i zrzutu odpadów (Motelay-Massei i in., 2006; Srogi, 2007). Wyższe stężenia WWA w wodach powierzchniowych lub odciekach z wysypisk odpadów stałych ostatecznie przedostają się do wód gruntowych, stanowiąc poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego, ponieważ ponad 70% populacji Azji Południowej i Południowo-Wschodniej pije wodę gruntową (Duttagupta i in., 2019). Niedawne badanie przeprowadzone przez Duttaguptę i in. (2020) dotyczące analiz rzek (32) i wód gruntowych (235) w Zachodnim Bengalu w Indiach wykazało, że około 53% mieszkańców miast i 44% mieszkańców wsi (łącznie 20 milionów mieszkańców) może być narażonych na naftalen (4,9–10,6 μg/l) i jego pochodne. Zróżnicowane wzorce użytkowania gruntów i zwiększone wydobycie wód gruntowych są uważane za główne czynniki kontrolujące transport pionowy (adwekcję) niskocząsteczkowych WWA w warstwie podpowierzchniowej. Stwierdzono, że WWA w dorzeczach i osadach podpowierzchniowych wpływają na spływ wód rolniczych, zrzuty ścieków komunalnych i przemysłowych oraz zrzuty odpadów stałych/śmieci. Opady atmosferyczne dodatkowo zwiększają zanieczyszczenie WWA. Wysokie stężenia WWA i ich pochodnych alkilowych (łącznie 51) odnotowano w rzekach/zlewniach na całym świecie, takich jak Fraser, Louan, Denso, Missouri, Anacostia, Ebro i Delaware (Yunker i in., 2002; Motelay-Massei i in., 2006; Li i in., 2010; Amoako i in., 2011; Kim i in., 2018). W osadach dorzecza Gangesu naftalen i fenantren okazały się najbardziej znaczące (wykryto je w 70% próbek) (Duttagupta i in., 2019). Ponadto badania wykazały, że chlorowanie wody pitnej może prowadzić do powstawania bardziej toksycznych utlenionych i chlorowanych WWA (Manoli i Samara, 1999). WWA kumulują się w zbożach, owocach i warzywach w wyniku wchłaniania przez rośliny z zanieczyszczonych gleb, wód gruntowych i opadów atmosferycznych (Fismes i in., 2002). Wiele organizmów wodnych, takich jak ryby, małże, małże i krewetki, jest zanieczyszczonych WWA poprzez spożycie skażonej żywności i wody morskiej, a także poprzez tkanki i skórę (Mackay i Fraser, 2000). Metody gotowania/przetwarzania, takie jak grillowanie, pieczenie, wędzenie, smażenie, suszenie, pieczenie i gotowanie na węglu drzewnym, również mogą prowadzić do znacznych ilości WWA w żywności. Zależy to w dużej mierze od wyboru materiału wędzonego, zawartości węglowodorów fenolowych/aromatycznych, sposobu gotowania, rodzaju grzałki, zawartości wilgoci, dopływu tlenu i temperatury spalania (Guillén i in., 2000; Gomes i in., 2013). Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) wykryto również w mleku w różnych stężeniach (0,75–2,1 mg/l) (Girelli i in., 2014). Kumulacja tych WWA w żywności zależy również od jej właściwości fizykochemicznych, a ich toksyczne działanie jest związane z funkcjami fizjologicznymi, aktywnością metaboliczną, wchłanianiem, dystrybucją i dystrybucją w organizmie (Mechini i in., 2011).
Toksyczność i szkodliwe działanie wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) są znane od dawna (Cherniglia, 1984). Węglowodory aromatyczne o małej masie cząsteczkowej (LMW-WWA) (dwa do trzech pierścieni) mogą kowalencyjnie wiązać się z różnymi makrocząsteczkami, takimi jak DNA, RNA i białka, i są rakotwórcze (Santarelli i in., 2008). Ze względu na swoją hydrofobową naturę są one rozdzielone błonami lipidowymi. U ludzi monooksygenazy cytochromu P450 utleniają WWA do epoksydów, z których niektóre są wysoce reaktywne (np. epoksyd bediolu) i mogą prowadzić do przekształcenia komórek prawidłowych w złośliwe (Marston i in., 2001). Ponadto produkty transformacji WWA, takie jak chinony, fenole, epoksydy, diole itp., są bardziej toksyczne niż związki macierzyste. Niektóre WWA i ich metabolity pośrednie mogą wpływać na hormony i różne enzymy metaboliczne, negatywnie oddziałując na wzrost, ośrodkowy układ nerwowy, układ rozrodczy i układ odpornościowy (Swetha i Phale, 2005; Vamsee-Krishna i in., 2006; Oostingh i in., 2008). Donoszono, że krótkotrwała ekspozycja na WWA o małej masie cząsteczkowej powoduje zaburzenia czynności płuc i zakrzepicę u astmatyków oraz zwiększa ryzyko raka skóry, płuc, pęcherza moczowego i przewodu pokarmowego (Olsson i in., 2010; Diggs i in., 2011). Badania na zwierzętach wykazały również, że ekspozycja na WWA może mieć niekorzystny wpływ na funkcje rozrodcze i rozwój oraz może powodować zaćmę, uszkodzenie nerek i wątroby oraz żółtaczkę. Wykazano, że różne produkty biotransformacji WWA, takie jak diole, epoksydy, chinony i wolne rodniki (kationy), tworzą addukty DNA. Wykazano, że stabilne addukty modyfikują mechanizm replikacji DNA, podczas gdy niestabilne addukty mogą depurynować DNA (głównie do adeniny, a czasami do guaniny); oba te czynniki mogą generować błędy prowadzące do mutacji (Schweigert i in. 2001). Ponadto chinony (benzo-/pan-) mogą generować reaktywne formy tlenu (RFT), powodując śmiertelne uszkodzenia DNA i innych makrocząsteczek, wpływając tym samym na funkcjonowanie/żywotność tkanek (Ewa i Danuta 2017). Donoszono, że przewlekła ekspozycja na niskie stężenia pirenu, bifenylu i naftalenu powoduje raka u zwierząt doświadczalnych (Diggs i in. 2012). Ze względu na ich śmiertelną toksyczność, priorytetem jest oczyszczenie/usunięcie tych WWA z miejsc dotkniętych/zanieczyszczonych.
Do usuwania WWA z zanieczyszczonych miejsc/środowisk stosowano różne metody fizyczne i chemiczne. Procesy takie jak spalanie, dechlorowanie, utlenianie UV, utrwalanie i ekstrakcja rozpuszczalnikowa mają wiele wad, w tym powstawanie toksycznych produktów ubocznych, złożoność procesu, problemy z bezpieczeństwem i regulacjami, niską wydajność i wysokie koszty. Biodegradacja mikrobiologiczna (zwana bioremediacją) to jednak obiecująca alternatywna metoda, która polega na wykorzystaniu mikroorganizmów w postaci czystych kultur lub kolonii. W porównaniu z metodami fizycznymi i chemicznymi, proces ten jest przyjazny dla środowiska, nieinwazyjny, opłacalny i zrównoważony. Bioremediację można przeprowadzić w miejscu skażenia (in situ) lub w specjalnie przygotowanym miejscu (ex situ), dlatego uważa się ją za bardziej zrównoważoną metodę remediacji niż tradycyjne metody fizyczne i chemiczne (Juhasz i Naidu, 2000; Andreoni i Gianfreda, 2007; Megharaj i in., 2011; Phale i in., 2020; Sarkar i in., 2020).
Zrozumienie etapów metabolizmu mikroorganizmów zaangażowanych w rozkład zanieczyszczeń aromatycznych ma ogromne implikacje naukowe i ekonomiczne dla zrównoważonego rozwoju ekologicznego i środowiskowego. Szacuje się, że na całym świecie 2,1×1018 gramów węgla (C) jest magazynowane w osadach i związkach organicznych (tj. ropie naftowej, gazie ziemnym i węglu, tj. paliwach kopalnych), co stanowi znaczący wkład w globalny obieg węgla. Jednak gwałtowna industrializacja, wydobycie paliw kopalnych i działalność człowieka wyczerpują te litosferyczne rezerwuary węgla, uwalniając do atmosfery około 5,5×1015 g węgla organicznego (w postaci zanieczyszczeń) rocznie (Gonzalez-Gaya i in., 2019). Większość tego węgla organicznego przedostaje się do ekosystemów lądowych i morskich poprzez sedymentację, transport i spływ. Ponadto nowe syntetyczne zanieczyszczenia pochodzące z paliw kopalnych, takie jak tworzywa sztuczne, plastyfikatory i stabilizatory tworzyw sztucznych (ftalany i ich izomery), poważnie zanieczyszczają ekosystemy morskie, glebowe i wodne oraz ich biotę, tym samym pogłębiając globalne zagrożenia klimatyczne. Różne rodzaje mikroplastiku, nanoplastiku, fragmentów plastiku i ich toksycznych monomerów pochodzących z politereftalanu etylenu (PET) nagromadziły się w Oceanie Spokojnym między Ameryką Północną a Azją Południowo-Wschodnią, tworząc „Wielką Pacyficzną Plamę Śmieci”, szkodząc życiu morskiemu (Newell i in., 2020). Badania naukowe dowiodły, że nie jest możliwe usunięcie takich zanieczyszczeń/odpadów żadnymi metodami fizycznymi ani chemicznymi. W tym kontekście najbardziej pożytecznymi mikroorganizmami są te, które są zdolne do utleniającego metabolizowania zanieczyszczeń do dwutlenku węgla, energii chemicznej i innych nietoksycznych produktów ubocznych, które ostatecznie wchodzą w skład innych procesów obiegu składników odżywczych (H, O, N, S, P, Fe itp.). Zatem zrozumienie mikrobiologicznej ekofizjologii mineralizacji zanieczyszczeń aromatycznych i jej wpływu na środowisko ma kluczowe znaczenie dla oceny mikrobiologicznego obiegu węgla, bilansu węglowego netto i przyszłych zagrożeń klimatycznych. W obliczu pilnej potrzeby usuwania tych związków ze środowiska, pojawiły się różne eko-przemysły koncentrujące się na czystych technologiach. Alternatywnie, waloryzacja odpadów przemysłowych/chemicznych odpadów nagromadzonych w ekosystemach (tj. podejście „od odpadów do bogactwa”) jest uważana za jeden z filarów gospodarki o obiegu zamkniętym i celów zrównoważonego rozwoju (Close i in., 2012). Dlatego zrozumienie metabolicznych, enzymatycznych i genetycznych aspektów tych potencjalnych kandydatów do degradacji ma ogromne znaczenie dla skutecznego usuwania i bioremediacji takich zanieczyszczeń aromatycznych.
Spośród wielu zanieczyszczeń aromatycznych szczególną uwagę poświęcamy WWA o niskiej masie cząsteczkowej, takim jak naftalen i podstawione naftaleny. Związki te są głównymi składnikami paliw ropopochodnych, barwników tekstylnych, produktów konsumenckich, pestycydów (naftali i repelentów na owady), plastyfikatorów i garbników, a zatem są szeroko rozpowszechnione w wielu ekosystemach (Preuss i in., 2003). Najnowsze doniesienia wskazują na akumulację stężeń naftalenu w osadach wodonośnych, wodach gruntowych i glebach podziemnych, strefach aeracji i korytach rzek, co sugeruje jego bioakumulację w środowisku (Duttagupta i in., 2019, 2020). Tabela 2 podsumowuje właściwości fizykochemiczne, zastosowania i wpływ na zdrowie naftalenu i jego pochodnych. W porównaniu z innymi WWA o dużej masie cząsteczkowej, naftalen i jego pochodne są mniej hydrofobowe, lepiej rozpuszczalne w wodzie i szeroko rozpowszechnione w ekosystemach, dlatego często wykorzystuje się je jako substraty modelowe do badań metabolizmu, genetyki i różnorodności metabolicznej WWA. Wiele mikroorganizmów jest w stanie metabolizować naftalen i jego pochodne, a dostępne są kompleksowe informacje na temat ich szlaków metabolicznych, enzymów i funkcji regulacyjnych (Mallick i in., 2011; Phale i in., 2019, 2020). Ponadto, naftalen i jego pochodne są uznawane za związki prototypowe do oceny zanieczyszczenia środowiska ze względu na ich wysoką liczebność i biodostępność. Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska szacuje, że średni poziom naftalenu w dymie papierosowym, głównie z niepełnego spalania, wynosi 5,19 μg na metr sześcienny, a w dymie z papierosów od 7,8 do 46 μg. Natomiast narażenie na kreozot i naftalen jest od 100 do 10 000 razy wyższe (Preuss i in. 2003). W szczególności stwierdzono, że naftalen wykazuje toksyczność oddechową i rakotwórczość w zależności od gatunku, regionu i płci. Na podstawie badań na zwierzętach Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem (IARC) sklasyfikowała naftalen jako „potencjalny czynnik rakotwórczy dla ludzi” (Grupa 2B)1. Narażenie na podstawione naftaleny, głównie drogą inhalacji lub pozajelitową (doustną), powoduje uszkodzenie tkanki płucnej i zwiększa częstość występowania guzów płuc u szczurów i myszy (Narodowy Program Toksykologiczny 2). Do ostrych skutków należą nudności, wymioty, bóle brzucha, biegunka, ból głowy, dezorientacja, obfite pocenie się, gorączka, tachykardia itp. Z drugiej strony, insektycyd karbaminianowy o szerokim spektrum działania, karbarylo(1-naftylo-N-metylokarbaminian), okazał się toksyczny dla bezkręgowców wodnych, płazów, pszczół miodnych i ludzi, a także hamował acetylocholinoesterazę, powodując paraliż (Smulders i in., 2003; Bulen i Distel, 2011). Dlatego zrozumienie mechanizmów degradacji mikrobiologicznej, regulacji genetycznej oraz reakcji enzymatycznych i komórkowych ma kluczowe znaczenie dla opracowania strategii bioremediacji w zanieczyszczonych środowiskach.
Tabela 2. Szczegółowe informacje dotyczące właściwości fizykochemicznych, zastosowań, metod identyfikacji i chorób towarzyszących naftalenu i jego pochodnych.
W zanieczyszczonych niszach hydrofobowe i lipofilowe zanieczyszczenia aromatyczne mogą powodować różnorodne skutki komórkowe dla mikrobiomu środowiskowego (zbiorowości), takie jak zmiany płynności błon, przepuszczalności błon, pęcznienie dwuwarstwy lipidowej, zaburzenia transportu energii (łańcuch transportu elektronów/siła napędowa protonów) oraz aktywność białek związanych z błoną (Sikkema i in., 1995). Ponadto niektóre rozpuszczalne produkty pośrednie, takie jak katechole i chinony, generują reaktywne formy tlenu (ROS) i tworzą addukty z DNA i białkami (Penning i in., 1999). Zatem obfitość tych związków w ekosystemach wywiera presję selekcyjną na zbiorowiska mikroorganizmów, aby stały się one efektywnymi degradatorami na różnych poziomach fizjologicznych, w tym na poziomie pobierania/transportu, transformacji wewnątrzkomórkowej, asymilacji/wykorzystania i kompartmentacji.
Przeszukanie bazy danych Ribosomal Database Project-II (RDP-II) ujawniło, że z pożywek lub kultur wzbogaconych zanieczyszczonych naftalenem lub jego pochodnymi wyizolowano łącznie 926 gatunków bakterii. Najliczniejszą grupę reprezentatywną (n = 755) stanowiły Proteobacteria, a następnie Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) i bakterie niesklasyfikowane (8) (ryc. 2). Przedstawiciele γ-Proteobacteria (Pseudomonadales i Xanthomonadales) dominowali we wszystkich grupach Gram-ujemnych o wysokiej zawartości G+C (54%), podczas gdy Clostridiales i Bacillales (30%) to grupy Gram-dodatnie o niskiej zawartości G+C. Donoszono, że Pseudomonas (największa liczba, 338 gatunków) jest w stanie degradować naftalen i jego pochodne metylowe w różnych zanieczyszczonych ekosystemach (smoła węglowa, ropa naftowa, ropa naftowa, osady ściekowe, wycieki ropy naftowej, ścieki, odpady organiczne i składowiska odpadów), a także w nienaruszonych ekosystemach (gleba, rzeki, osady i wody gruntowe) (rysunek 2). Ponadto badania wzbogacania i analiza metagenomiczna niektórych z tych regionów wykazały, że niehodowane gatunki Legionella i Clostridium mogą mieć zdolność degradacji, co wskazuje na potrzebę hodowli tych bakterii w celu zbadania nowych szlaków i różnorodności metabolicznej.
Rys. 2. Różnorodność taksonomiczna i rozmieszczenie ekologiczne przedstawicieli bakterii w środowiskach zanieczyszczonych naftalenem i pochodnymi naftalenu.
Spośród różnych mikroorganizmów rozkładających węglowodory aromatyczne, większość jest zdolna do degradacji naftalenu jako jedynego źródła węgla i energii. Sekwencję zdarzeń związanych z metabolizmem naftalenu opisano dla Pseudomonas sp. (szczepy: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 i CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 i inne szczepy (ND6 i AS1) (Mahajan i in., 1994; Resnick i in., 1996; Annweiler i in., 2000; Basu i in., 2003; Dennis i Zylstra, 2004; Sota i in., 2006; Metabolizm jest inicjowany przez wieloskładnikową dioksygenazę [dioksygenazę naftalenu (NDO), dioksygenazę hydroksylującą pierścień], która katalizuje utlenianie jednego z pierścieni aromatycznych naftalenu, wykorzystując tlen cząsteczkowy jako drugi substrat, przekształcając naftalen w cis-naftalenodiol (rysunek 3). Cis-dihydrodiol jest przekształcany do 1,2-dihydroksynaftalenu przez dehydrogenazę. Dioksygenaza rozszczepiająca pierścień, 1,2-dihydroksynaftalenodioksygenaza (12DHNDO), przekształca 1,2-dihydroksynaftalen do kwasu 2-hydroksychromen-2-karboksylowego. Enzymatyczna izomeryzacja cis-trans wytwarza trans-o-hydroksybenzylidenopirogronian, który jest rozszczepiany przez aldolazę hydratazową do aldehydu salicylowego i pirogronianu. Kwas organiczny pirogronian był pierwszym związkiem C3 pochodzącym ze szkieletu węglowego naftalenu i skierowanym do centralnego szlaku węglowego. Ponadto, NAD+-zależna dehydrogenaza salicylaldehydu przekształca salicylaldehyd do kwasu salicylowego. Metabolizm na tym etapie nazywany jest „górnym szlakiem” degradacji naftalenu. Szlak ten jest bardzo powszechny w większości Bakterie degradujące naftalen. Istnieje jednak kilka wyjątków; na przykład u termofilnej bakterii Bacillus hamburgii 2 degradacja naftalenu jest inicjowana przez 2,3-dioksygenazę naftalenu, tworząc 2,3-dihydroksynaftalen (Annweiler i in., 2000).
Rysunek 3. Drogi degradacji naftalenu, metylonaftalenu, kwasu naftoesowego i karbarylu. Zakreślone liczby oznaczają enzymy odpowiedzialne za sekwencyjną konwersję naftalenu i jego pochodnych do kolejnych produktów. 1 — dioksygenaza naftalenu (NDO); 2 — dehydrogenaza cis-dihydrodiolu; 3 — dioksygenaza 1,2-dihydroksynaftalenu; 4 — izomeraza kwasu 2-hydroksychromen-2-karboksylowego; 5 — aldolaza hydratazy trans-O-hydroksybenzylidenopirorogronianu; 6 — dehydrogenaza aldehydu salicylowego; 7 — 1-hydroksylaza salicylanu; 8 — 2,3-dioksygenaza katecholowa (C23DO); 9 — dehydrogenaza semialdehydu 2-hydroksymukonianowego; 10, hydrataza 2-oksopent-4-enianowa; 11, aldolaza 4-hydroksy-2-oksopentanoanowa; 12, dehydrogenaza aldehydu octowego; 13, katecholo-1,2-dioksygenaza (C12DO); 14, cykloizomeraza mukonianowa; 15, delta-izomeraza mukonolaktonu; 16, hydrolaza β-ketoadypinianu-laktonu; 17, sukcynylo-CoA-transferaza β-ketoadypinianu; 18, tiolaza β-ketoadypinianu-CoA; 19, sukcynylo-CoA: acetylo-CoA-sukcynylotransferaza; 20, salicylan 5-hydroksylaza; 21 – gentyzynianowa 1,2-dioksygenaza (GDO); 22, izomeraza maleilopirogronianu; 23, hydrolaza fumarylopirogronianu; 24, hydroksylaza metylonaftalenu (NDO); 25, dehydrogenaza hydroksymetylonaftalenu; 26, dehydrogenaza naftaldehydu; 27, oksydaza kwasu 3-formylsalicylowego; 28, dekarboksylaza hydroksyizoftalanu; 29, hydrolaza karbarylu (CH); 30, 1-naftolo-2-hydroksylaza.
W zależności od organizmu i jego składu genetycznego, powstały kwas salicylowy jest dalej metabolizowany albo poprzez szlak katecholowy z udziałem salicylanowej 1-hydroksylazy (S1H), albo poprzez szlak gentyzynowy z udziałem salicylanowej 5-hydroksylazy (S5H) (Rysunek 3). Ponieważ kwas salicylowy jest głównym produktem pośrednim w metabolizmie naftalenu (szlak górny), etapy od kwasu salicylowego do pośredniego kwasu trójchlorooctowego (TCA) są często określane jako szlak dolny, a geny są zorganizowane w pojedynczy operon. Często obserwuje się, że geny operonu szlaku górnego (nah) i operonu szlaku dolnego (sal) są regulowane przez wspólne czynniki regulacyjne; na przykład NahR i kwas salicylowy działają jako induktory, umożliwiając obu operonom całkowite metabolizowanie naftalenu (Phale i in., 2019, 2020).
Ponadto katechol jest cyklicznie rozszczepiany do semialdehydu 2-hydroksymukonianowego poprzez szlak meta przez 2,3-dioksygenazę katecholową (C23DO) (Yen i in., 1988), a następnie hydrolizowany przez hydrolazę semialdehydu 2-hydroksymukonianowego, tworząc kwas 2-hydroksypent-2,4-dienowy. 2-hydroksypent-2,4-dienonian jest następnie przekształcany w pirogronian i aldehyd octowy przez hydratazę (hydratazę 2-oksopent-4-enianową) i aldolazę (aldolazę 4-hydroksy-2-oksopentanianową), a następnie wchodzi do centralnego szlaku węglowego (ryc. 3). Alternatywnie, katechol jest cyklicznie rozszczepiany do cis,cis-mukonianu poprzez szlak orto przez 1,2-oksygenazę katecholową (C12DO). Cykloizomeraza mukonianowa, izomeraza mukonolaktonu i hydrolaza β-ketoadypinianu-nolaktonu przekształcają cis,cis-mukonian w 3-oksoadypinian, który trafia do centralnego szlaku węglowego poprzez sukcynylo-CoA i acetylo-CoA (Nozaki i in., 1968) (ryc. 3).
W szlaku gentyzynianowym (2,5-dihydroksybenzoesanowym) pierścień aromatyczny jest rozszczepiany przez gentyzynianową 1,2-dioksygenazę (GDO), tworząc maleilopirogronian. Produkt ten może być bezpośrednio hydrolizowany do pirogronianu i jabłczanu lub może ulec izomeryzacji do fumarylopirogronianu, który następnie może być hydrolizowany do pirogronianu i fumaranu (Larkin i Day, 1986). Wybór alternatywnego szlaku zaobserwowano zarówno u bakterii Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich, na poziomie biochemicznym i genetycznym (Morawski i in., 1997; Whyte i in., 1997). Bakterie Gram-ujemne (Pseudomonas) preferują kwas salicylowy, który indukuje metabolizm naftalenu, dekarboksylując go do katecholu za pomocą salicylanowej 1-hydroksylazy (Gibson i Subramanian, 1984). Z kolei u bakterii Gram-dodatnich (Rhodococcus) salicylanowa 5-hydroksylaza przekształca kwas salicylowy w kwas gentyzynowy, podczas gdy kwas salicylowy nie ma wpływu indukującego na transkrypcję genów naftalenu (Grund i in., 1992) (ryc. 3).
Donoszono, że gatunki takie jak Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas i Mycobacterium mogą degradować monometylonaftalen lub dimetylonaftalen (Dean-Raymond i Bartha, 1975; Cane i Williams, 1982; Mahajan i in., 1994; Dutta i in., 1998; Hedlund i in., 1999). Spośród nich szlak degradacji 1-metylonaftalenu i 2-metylonaftalenu przez Pseudomonas sp. CSV86 został dokładnie zbadany na poziomie biochemicznym i enzymatycznym (Mahajan i in., 1994). Metabolizm 1-metylonaftalenu przebiega dwoma szlakami. Najpierw pierścień aromatyczny ulega hydroksylacji (niepodstawiony pierścień metylonaftalenu), tworząc cis-1,2-dihydroksy-1,2-dihydro-8-metylonaftalen, który następnie utlenia się do salicylanu metylu i metylokatecholu, a następnie po rozszczepieniu pierścienia wchodzi do centralnego szlaku węglowego (rysunek 3). Szlak ten nazywany jest „szlakiem źródła węgla”. W drugim „szlaku detoksykacji” grupa metylowa może zostać hydroksylowana przez NDO, tworząc 1-hydroksymetylonaftalen, który następnie utlenia się do kwasu 1-naftoesowego i jest wydalany do pożywki hodowlanej jako produkt końcowy. Badania wykazały, że szczep CSV86 nie jest w stanie rosnąć na kwasie 1- i 2-naftoesowym jako jedynym źródle węgla i energii, co potwierdza jego szlak detoksykacji (Mahajan i in., 1994; Basu i in., 2003). W 2-metylonaftalenie grupa metylowa ulega hydroksylacji przez hydroksylazę, tworząc 2-hydroksymetylonaftalen. Ponadto, niepodstawiony pierścień pierścienia naftalenu ulega hydroksylacji, tworząc dihydrodiol, który jest utleniany do 4-hydroksymetylokatecholu w serii reakcji katalizowanych enzymatycznie i wchodzi do centralnego szlaku węglowego poprzez szlak rozszczepienia metapierścienia. Podobnie wykazano, że S. paucimobilis 2322 wykorzystuje NDO do hydroksylacji 2-metylonaftalenu, który następnie utlenia się, tworząc salicylan metylu i metylokatechol (Dutta i in., 1998).
Kwasy naftoesowe (podstawione/niepodstawione) to produkty uboczne detoksykacji/biotransformacji powstające podczas degradacji metylonaftalenu, fenantrenu i antracenu i uwalniane do zużytej pożywki hodowlanej. Doniesiono, że izolat glebowy Stenotrophomonas maltophilia CSV89 jest zdolny do metabolizowania kwasu 1-naftoesowego jako źródła węgla (Phale i in., 1995). Metabolizm rozpoczyna się od dihydroksylacji pierścienia aromatycznego, tworząc 1,2-dihydroksy-8-karboksynaftalen. Powstały diol jest utleniany do katecholu poprzez 2-hydroksy-3-karboksybenzylidenopirofosforan, kwas 3-formylosalicylowy, kwas 2-hydroksyizoftalowy i kwas salicylowy, a następnie wchodzi do centralnego szlaku węglowego poprzez szlak rozszczepienia metapierścienia (rysunek 3).
Karbaryl to pestycyd z grupy karbaminianów naftylu. Od czasu Zielonej Rewolucji w Indiach w latach 70. XX wieku stosowanie nawozów sztucznych i pestycydów doprowadziło do wzrostu emisji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) z rolniczych źródeł rozproszonych (Pingali, 2012; Duttagupta i in., 2020). Szacuje się, że 55% (85 722 000 hektarów) całkowitej powierzchni upraw w Indiach jest traktowane pestycydami chemicznymi. W ciągu ostatnich pięciu lat (2015–2020) indyjski sektor rolny zużywał średnio od 55 000 do 60 000 ton pestycydów rocznie (Departament Spółdzielczości i Dobrobytu Rolników, Ministerstwo Rolnictwa, Rząd Indii, sierpień 2020). Na północnych i środkowych Nizinach Gangesu (stanach o największej liczbie ludności i gęstości zaludnienia) stosowanie pestycydów w uprawach jest powszechne, a dominują insektycydy. Karbaryl (1-naftylo-N-metylokarbaminian) to karbaminianowy insektycyd o szerokim spektrum działania, o umiarkowanej do wysokiej toksyczności, stosowany w rolnictwie indyjskim w ilości średnio 100–110 ton. Jest powszechnie sprzedawany pod nazwą handlową Sevin i służy do zwalczania owadów (mszyc, mrówek ognistych, pcheł, roztoczy, pająków i wielu innych szkodników zewnętrznych) atakujących różne uprawy (kukurydzę, soję, bawełnę, owoce i warzywa). Niektóre mikroorganizmy, takie jak Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus i Arthrobacter, mogą być również stosowane do zwalczania innych szkodników. Doniesiono, że RC100 może degradować karbaryl (Larkin i Day, 1986; Chapalamadugu i Chaudhry, 1991; Hayatsu i in., 1999; Swetha i Phale, 2005; Trivedi i in., 2017). Szlak degradacji karbarylu był szeroko badany na poziomie biochemicznym, enzymatycznym i genetycznym w izolatach glebowych Pseudomonas sp. szczepów C4, C5 i C6 (Swetha i Phale, 2005; Trivedi i in., 2016) (ryc. 3). Szlak metaboliczny rozpoczyna się od hydrolizy wiązania estrowego przez hydrolazę karbarylową (CH), w wyniku czego powstaje 1-naftol, metyloamina i dwutlenek węgla. 1-naftol jest następnie przekształcany w 1,2-dihydroksynaftalen przez hydroksylazę 1-naftolową (1-NH), który jest dalej metabolizowany w centralnym szlaku węglowym poprzez salicylan i gentyzynian. Niektóre bakterie degradujące karbaryle metabolizują go do kwasu salicylowego poprzez rozszczepienie pierścienia orto katecholu (Larkin i Day, 1986; Chapalamadugu i Chaudhry, 1991). Co istotne, bakterie degradujące naftalen metabolizują kwas salicylowy głównie poprzez katechol, podczas gdy bakterie degradujące karbaryle preferują metabolizację kwasu salicylowego poprzez szlak gentyzynianowy.
Pochodne kwasu naftalenosulfonowego/disulfonowego i kwasu naftyloaminosulfonowego mogą być stosowane jako półprodukty w produkcji barwników azowych, środków zwilżających, dyspergatorów itp. Chociaż związki te charakteryzują się niską toksycznością dla ludzi, badania cytotoksyczności wykazały, że są one śmiertelne dla ryb, dafni i glonów (Greim i in., 1994). Donoszono, że przedstawiciele rodzaju Pseudomonas (szczepy A3, C22) rozpoczynają metabolizm poprzez podwójną hydroksylację pierścienia aromatycznego zawierającego grupę kwasu sulfonowego, tworząc dihydrodiol, który następnie jest przekształcany w 1,2-dihydroksynaftalen poprzez spontaniczne rozszczepienie grupy siarczynowej (Brilon i in., 1981). Powstały 1,2-dihydroksynaftalen jest katabolizowany klasyczną drogą naftalenu, tj. szlakiem katecholowym lub gentyzynianowym (rysunek 4). Wykazano, że kwas aminonaftalenosulfonowy i kwas hydroksynaftalenosulfonowy mogą być całkowicie degradowane przez mieszane konsorcja bakteryjne o uzupełniających się szlakach katabolicznych (Nortemann i in., 1986). Wykazano, że jeden z członków konsorcjum odsiarcza kwas aminonaftalenosulfonowy lub kwas hydroksynaftalenosulfonowy poprzez 1,2-dioksygenację, podczas gdy aminosalicylan lub hydroksysalicylan jest uwalniany do pożywki hodowlanej jako metabolit ślepy, a następnie wchłaniany przez innych członków konsorcjum. Kwas naftalenodisulfonowy jest stosunkowo polarny, ale słabo biodegradowalny i dlatego może być metabolizowany różnymi szlakami. Pierwsza desulfuryzacja zachodzi podczas regioselektywnej dihydroksylacji pierścienia aromatycznego i grupy kwasu sulfonowego; druga desulfuryzacja zachodzi podczas hydroksylacji kwasu 5-sulfosalicylowego przez 5-hydroksylazę kwasu salicylowego, tworząc kwas gentyzynowy, który wchodzi do centralnego szlaku węglowego (Brilon i in., 1981) (rysunek 4). Enzymy odpowiedzialne za degradację naftalenu odpowiadają również za metabolizm naftalenosulfonianu (Brilon i in., 1981; Keck i in., 2006).
Rysunek 4. Szlaki metaboliczne degradacji naftalenosulfonianu. Liczby w kółkach oznaczają enzymy odpowiedzialne za metabolizm naftalenosulfonianu, podobne/identyczne z enzymami opisanymi na rys. 3.
Niskocząsteczkowe WWA (LMW-WWA) są redukowalne, hydrofobowe i słabo rozpuszczalne, a zatem niepodatne na naturalny rozkład/degradację. Jednak mikroorganizmy tlenowe potrafią je utleniać poprzez absorpcję tlenu cząsteczkowego (O2). Enzymy te należą głównie do klasy oksydoreduktaz i mogą przeprowadzać różne reakcje, takie jak hydroksylacja pierścienia aromatycznego (mono- lub dihydroksylacja), dehydrogenacja i rozszczepianie pierścienia aromatycznego. Produkty otrzymywane w tych reakcjach znajdują się na wyższym stopniu utlenienia i są łatwiej metabolizowane poprzez centralny szlak węglowy (Phale i in., 2020). Donoszono, że enzymy w szlaku degradacji są indukowalne. Aktywność tych enzymów jest bardzo niska lub znikoma, gdy komórki hodowane są na prostych źródłach węgla, takich jak glukoza lub kwasy organiczne. W tabeli 3 podsumowano różne enzymy (oksygenazy, hydrolazy, dehydrogenazy, oksydazy itp.) biorące udział w metabolizmie naftalenu i jego pochodnych.
Tabela 3. Charakterystyka biochemiczna enzymów odpowiedzialnych za degradację naftalenu i jego pochodnych.
Badania radioizotopowe (18O2) wykazały, że włączenie cząsteczkowego O2 do pierścieni aromatycznych przez oksygenazy jest najważniejszym etapem aktywacji dalszej biodegradacji związku (Hayaishi i in., 1955; Mason i in., 1955). Włączenie jednego atomu tlenu (O) z cząsteczkowego tlenu (O2) do substratu jest inicjowane przez endogenne lub egzogenne monooksygenazy (zwane również hydroksylazami). Kolejny atom tlenu jest redukowany do wody. Egzogenne monooksygenazy redukują flawinę za pomocą NADH lub NADPH, podczas gdy w endomonooksygenazach flawina jest redukowana przez substrat. Pozycja hydroksylacji powoduje różnorodność w tworzeniu produktów. Na przykład, salicylan-1-hydroksylaza hydroksyluje kwas salicylowy w pozycji C1, tworząc katechol. Z drugiej strony, wieloskładnikowa salicylanowa 5-hydroksylaza (zawierająca podjednostki reduktazy, ferredoksyny i oksydazy) hydroksyluje kwas salicylowy w pozycji C5, tworząc kwas gentyzynowy (Yamamoto i in., 1965).
Dioksygenazy włączają dwa atomy O2 do substratu. W zależności od powstających produktów, dzielą się na dioksygenazy hydroksylujące pierścień i dioksygenazy rozszczepiające pierścień. Dioksygenazy hydroksylujące pierścień przekształcają aromatyczne substraty w cis-dihydrodiole (np. naftalen) i są szeroko rozpowszechnione wśród bakterii. Do tej pory wykazano, że organizmy zawierające dioksygenazy hydroksylujące pierścień są zdolne do wzrostu na różnych aromatycznych źródłach węgla, a enzymy te klasyfikuje się jako NDO (naftalen), dioksygenazę toluenową (TDO, toluen) i dioksygenazę bifenylową (BPDO, bifenyl). Zarówno NDO, jak i BPDO mogą katalizować podwójne utlenianie i hydroksylację łańcuchów bocznych różnych wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (toluenu, nitrotoluenu, ksylenu, etylobenzenu, naftalenu, bifenylu, fluorenu, indolu, metylonaftalenu, naftalenosulfonianu, fenantrenu, antracenu, acetofenonu itp.) (Boyd i Sheldrake, 1998; Phale i in., 2020). NDO to wieloskładnikowy układ składający się z oksydoreduktazy, ferredoksyny oraz składnika oksygenazy zawierającego miejsce aktywne (Gibson i Subramanian, 1984; Resnick i in., 1996). Jednostka katalityczna NDO składa się z dużej podjednostki α i małej podjednostki β, ułożonych w konfiguracji α3β3. NDO należy do dużej rodziny oksygenaz, a jej podjednostka α zawiera miejsce Rieskego [2Fe-2S] i jednojądrowe żelazo niehemowe, które determinuje specyficzność substratową NDO (Parales i in., 1998). Typowo, w jednym cyklu katalitycznym, dwa elektrony z redukcji nukleotydu pirydynowego są przenoszone do jonu Fe(II) w miejscu aktywnym poprzez reduktazę, ferredoksynę i miejsce Rieskego. Redukujące równoważniki aktywują tlen cząsteczkowy, który jest warunkiem wstępnym dihydroksylacji substratu (Ferraro i in., 2005). Do tej pory tylko kilka NDO zostało oczyszczonych i scharakteryzowanych szczegółowo z różnych szczepów, a genetyczna kontrola ścieżek zaangażowanych w degradację naftalenu została szczegółowo zbadana (Resnick i in., 1996; Parales i in., 1998; Karlsson i in., 2003). Dioksygenazy rozszczepiające pierścienie (enzymy rozszczepiające endo- lub orto-pierścienie oraz egzodiolowe lub meta-pierścienie) działają na hydroksylowane związki aromatyczne. Na przykład, dioksygenaza rozszczepiająca orto-pierścienie to katecholo-1,2-dioksygenaza, natomiast dioksygenaza rozszczepiająca meta-pierścienie to katecholo-2,3-dioksygenaza (Kojima i in., 1961; Nozaki i in., 1968). Oprócz różnych oksygenaz, istnieją również różne dehydrogenazy odpowiedzialne za dehydrogenację aromatycznych dihydrodioli, alkoholi i aldehydów oraz wykorzystujące NAD+/NADP+ jako akceptory elektronów, które należą do ważnych enzymów zaangażowanych w metabolizm (Gibson i Subramanian, 1984; Shaw i Harayama, 1990; Fahle i in., 2020).
Enzymy takie jak hydrolazy (esterazy, amidazy) stanowią drugą ważną klasę enzymów, które wykorzystują wodę do rozszczepiania wiązań kowalencyjnych i wykazują szeroką specyficzność substratową. Hydrolaza karbarylowa i inne hydrolazy są uważane za składniki peryplazmy (błony transbłonowej) u bakterii Gram-ujemnych (Kamini i in., 2018). Karbaryl posiada zarówno wiązanie amidowe, jak i estrowe; dlatego może być hydrolizowany przez esterazę lub amidazę do 1-naftolu. Wykazano, że karbaryl w szczepie Rhizobium rhizobium AC10023 i szczepie Arthrobacter RC100 działa odpowiednio jako esteraza i amidaza. Karbaryl w szczepie Arthrobacter RC100 również działa jako amidaza. Wykazano, że RC100 hydrolizuje cztery insektycydy z klasy N-metylokarbaminianów, takie jak karbaryl, metomyl, kwas mefenamowy i XMC (Hayaatsu i in., 2001). Doniesiono, że CH w Pseudomonas sp. C5pp może oddziaływać na karbaryl (100% aktywności) i octan 1-naftylu (36% aktywności), ale nie na 1-naftyloacetamid, co wskazuje na jego esterazę (Trivedi i in., 2016).
Badania biochemiczne, wzorce regulacji enzymów i analiza genetyczna wykazały, że geny degradacji naftalenu składają się z dwóch indukowalnych jednostek regulacyjnych, czyli „operonów”: nah („ścieżka wstępująca”, przekształcająca naftalen w kwas salicylowy) i sal („ścieżka dolna”, przekształcająca kwas salicylowy w centralny szlak węglowy poprzez katechol). Kwas salicylowy i jego analogi mogą działać jako induktory (Shamsuzzaman i Barnsley, 1974). W obecności glukozy lub kwasów organicznych operon ulega represji. Rysunek 5 przedstawia pełną organizację genetyczną degradacji naftalenu (w formie operonu). Opisano kilka nazwanych wariantów/form genu nah (ndo/pah/dox), które wykazują wysoką homologię sekwencji (90%) wśród wszystkich gatunków Pseudomonas (Abbasian i in., 2016). Geny szlaku naftalenu w górę rzeki były generalnie ułożone w kolejności konsensusowej, jak pokazano na rysunku 5A. Donoszono również o innym genie, nahQ, który był zaangażowany w metabolizm naftalenu i zazwyczaj znajdował się pomiędzy nahC i nahE, ale jego faktyczna funkcja wciąż nie została wyjaśniona. Podobnie, gen nahY, odpowiedzialny za chemotaksję wrażliwą na naftalen, znajdował się na dystalnym końcu operonu nah u niektórych przedstawicieli. U Ralstonia sp. stwierdzono, że gen U2 kodujący S-transferazę glutationu (GSH) znajdował się pomiędzy nahAa i nahAb, ale nie wpływał na charakterystykę wykorzystania naftalenu (Zylstra i in., 1997).
Rysunek 5. Organizacja i różnorodność genetyczna obserwowana podczas degradacji naftalenu u gatunków bakterii; (A) Górny szlak naftalenowy, metabolizm naftalenu do kwasu salicylowego; (B) Dolny szlak naftalenowy, kwas salicylowy przez katechol do centralnego szlaku węglowego; (C) kwas salicylowy przez gentyzynian do centralnego szlaku węglowego.
„Dolna ścieżka” (operon sal) zazwyczaj składa się z nahGTHINLMOKJ i przekształca salicylan w pirogronian i aldehyd octowy poprzez szlak rozszczepienia metacholizy katecholowej. Stwierdzono, że gen nahG (kodujący hydroksylazę salicylową) jest konserwowany na proksymalnym końcu operonu (ryc. 5B). W porównaniu z innymi szczepami degradującymi naftalen, u P. putida CSV86 operony nah i sal są tandemowe i bardzo blisko spokrewnione (około 7,5 kb). U niektórych bakterii Gram-ujemnych, takich jak Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 i P. putida AK5, naftalen jest metabolizowany jako centralny metabolit węglowy poprzez szlak gentyzynowy (w postaci operonu sgp/nag). Kaseta genowa jest zwykle przedstawiana w formie nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, gdzie nagR (kodujący regulator typu LysR) znajduje się na górnym końcu (ryc. 5C).
Karbaryl wchodzi do centralnego obiegu węgla poprzez metabolizm 1-naftolu, 1,2-dihydroksynaftalenu, kwasu salicylowego i kwasu gentyzynowego (ryc. 3). Na podstawie badań genetycznych i metabolicznych zaproponowano podział tego szlaku na „w górę” (przemiana karbarylu w kwas salicylowy), „środkowy” (przemiana kwasu salicylowego w kwas gentyzynowy) i „w dół” (przemiana kwasu gentyzynowego w produkty pośrednie centralnego obiegu węgla) (Singh i in., 2013). Analiza genomiczna C5pp (supercontig A, 76,3 kb) wykazała, że ​​gen mcbACBDEF bierze udział w przekształcaniu karbarylu w kwas salicylowy, następnie gen mcbIJKL w przekształcaniu kwasu salicylowego w kwas gentyzynowy, a gen mcbOQP w przekształcaniu kwasu gentyzynowego w centralne węglowe związki pośrednie (fumaran i pirogronian, Trivedi i in., 2016) (ryc. 6).
Doniesiono, że enzymy biorące udział w degradacji węglowodorów aromatycznych (w tym naftalenu i kwasu salicylowego) mogą być indukowane przez odpowiednie związki i hamowane przez proste źródła węgla, takie jak glukoza lub kwasy organiczne (Shingler, 2003; Phale i in., 2019, 2020). Spośród różnych szlaków metabolicznych naftalenu i jego pochodnych, właściwości regulacyjne naftalenu i karbarylu zostały do ​​pewnego stopnia zbadane. W przypadku naftalenu, geny zarówno w szlakach wstępujących, jak i końcowych są regulowane przez NahR, pozytywny regulator trans działający na zasadzie LysR. Jest on niezbędny do indukcji genu nah przez kwas salicylowy i jego późniejszej ekspresji na wysokim poziomie (Yen i Gunsalus, 1982). Ponadto badania wykazały, że integracyjny czynnik gospodarza (IHF) i XylR (regulator transkrypcji zależny od sigma 54) są również kluczowe dla aktywacji transkrypcyjnej genów metabolizmu naftalenu (Ramos i in., 1997). Badania wykazały, że enzymy szlaku otwierania metapierścienia katecholowego, a mianowicie 2,3-dioksygenaza katecholowa, są indukowane w obecności naftalenu i/lub kwasu salicylowego (Basu i in., 2006). Badania wykazały, że enzymy szlaku otwierania ortopierścienia katecholowego, a mianowicie 1,2-dioksygenaza katecholowa, są indukowane w obecności kwasu benzoesowego i cis,cis-mukonianu (Parsek i in., 1994; Tover i in., 2001).
W szczepie C5pp pięć genów: mcbG, mcbH, mcbN, mcbR i mcbS koduje regulatory należące do rodziny regulatorów transkrypcyjnych LysR/TetR, odpowiedzialnych za kontrolę degradacji karbarylu. Stwierdzono, że homologiczny gen mcbG jest najbliżej spokrewniony z regulatorem typu LysR, PhnS (58% identyczności aminokwasów), zaangażowanym w metabolizm fenantrenu u Burkholderia RP00725 (Trivedi i in., 2016). Stwierdzono, że gen mcbH uczestniczy w szlaku pośrednim (konwersja kwasu salicylowego do kwasu gentyzynowego) i należy do regulatora transkrypcyjnego typu LysR, NagR/DntR/NahR u Pseudomonas i Burkholderia. Donoszono, że członkowie tej rodziny rozpoznają kwas salicylowy jako specyficzną cząsteczkę efektorową do indukcji genów degradacji. Z drugiej strony, trzy geny: mcbN, mcbR i mcbS, należące do regulatorów transkrypcyjnych typu LysR i TetR, zidentyfikowano na dalszej drodze (metabolity szlaku gentyzynian-węgiel centralny).
U prokariotów, horyzontalne procesy transferu genów (akwizycja, wymiana lub transfer) za pośrednictwem plazmidów, transpozonów, profagów, wysp genomowych i integracyjnych elementów koniugacyjnych (ICE) są głównymi przyczynami plastyczności genomów bakteryjnych, prowadzącej do nabycia lub utraty określonych funkcji/cech. Umożliwia to bakteriom szybką adaptację do zmiennych warunków środowiskowych, zapewniając gospodarzowi potencjalne korzyści adaptacyjne w zakresie metabolizmu, takie jak degradacja związków aromatycznych. Zmiany metaboliczne są często osiągane poprzez precyzyjne dostrojenie operonów degradacyjnych, ich mechanizmów regulacyjnych i specyficzności enzymów, co ułatwia degradację szerszego spektrum związków aromatycznych (Nojiri i in., 2004; Phale i in., 2019, 2020). Kasety genowe degradacji naftalenu znajdują się na różnych elementach ruchomych, takich jak plazmidy (sprzężone i niesprzężone), transpozony, genomy, ICE oraz kombinacje różnych gatunków bakterii (ryc. 5). W przypadku Pseudomonas G7 operony nah i sal plazmidu NAH7 są transkrybowane w tej samej orientacji i stanowią część wadliwego transpozonu, który do mobilizacji wymaga transpozazy Tn4653 (Sota i in., 2006). W przypadku Pseudomonas NCIB9816-4 gen ten został znaleziony na sprzężonym plazmidzie pDTG1 jako dwa operony (odległe od siebie o około 15 kb), transkrybowane w przeciwnych kierunkach (Dennis i Zylstra, 2004). W szczepie AK5 Pseudomonas putida, niesprzężony plazmid pAK5 koduje enzym odpowiedzialny za degradację naftalenu poprzez szlak gentyzynowy (Izmalkova i in., 2013). W szczepie Pseudomonas PMD-1 operon nah znajduje się na chromosomie, natomiast operon sal na sprzężonym plazmidzie pMWD-1 (Zuniga i in., 1981). Natomiast w szczepie AN10 Pseudomonas stutzeri wszystkie geny degradacji naftalenu (operony nah i sal) znajdują się na chromosomie i prawdopodobnie są rekrutowane poprzez transpozycję, rekombinację i przegrupowanie (Bosch i in., 2000). W Pseudomonas sp. CSV86 operony nah i sal znajdują się w genomie w postaci ICE (ICECSV86). Struktura jest chroniona przez tRNAGly, po którym następują bezpośrednie powtórzenia wskazujące na miejsca rekombinacji/przyłączenia (attR i attL) oraz integraza fagopodobna zlokalizowana na obu końcach tRNAGly, co czyni ją strukturalnie podobną do elementu ICEclc (ICEclcB13 w Pseudomonas knackmusii, odpowiedzialnego za degradację chlorokatecholi). Doniesiono, że geny na ICE mogą być przenoszone przez koniugację z wyjątkowo niską częstotliwością transferu (10-8), przenosząc w ten sposób właściwości degradacyjne na biorcę (Basu i Phale, 2008; Phale i in., 2019).
Większość genów odpowiedzialnych za degradację karbarylu znajduje się na plazmidach. Arthrobacter sp. RC100 zawiera trzy plazmidy (pRC1, pRC2 i pRC300), z których dwa plazmidy koniugacyjne, pRC1 i pRC2, kodują enzymy przekształcające karbaryl w gentyzynian. Z kolei enzymy biorące udział w przekształcaniu gentyzynian w centralne metabolity węglowe znajdują się na chromosomie (Hayaatsu i in., 1999). Bakterie z rodzaju Rhizobium. Szczep AC100, używany do przekształcania karbarylu w 1-naftol, zawiera plazmid pAC200, który niesie gen cehA kodujący CH jako część transpozonu Tnceh, otoczony sekwencjami przypominającymi elementy insercyjne (istA i istB) (Hashimoto i in., 2002). Uważa się, że w szczepie Sphingomonas CF06 gen degradacji karbarylu występuje w pięciu plazmidach: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 i pCF05. Homologia DNA tych plazmidów jest wysoka, co wskazuje na występowanie zjawiska duplikacji genu (Feng i in., 1997). W symbioncie degradującym karbaryl, złożonym z dwóch gatunków Pseudomonas, szczep 50581 zawiera sprzężony plazmid pCD1 (50 kb) kodujący gen hydrolazy karbarylu mcd, podczas gdy sprzężony plazmid w szczepie 50552 koduje enzym degradujący 1-naftol (Chapalamadugu i Chaudhry, 1991). W szczepie Achromobacter WM111 gen hydrolazy mcd furadanu znajduje się na plazmidzie o długości 100 kb (pPDL11). Wykazano, że gen ten występuje na różnych plazmidach (100, 105, 115 lub 124 kb) u różnych bakterii z różnych regionów geograficznych (Parekh i in., 1995). U Pseudomonas sp. C5pp wszystkie geny odpowiedzialne za degradację karbarylu znajdują się w genomie o długości sekwencji 76,3 kb (Trivedi i in., 2016). Analiza genomu (6,15 Mb) wykazała obecność 42 MGE i 36 GEI, z których 17 MGE znajdowało się w superkontigu A (76,3 kb) ze średnią asymetryczną zawartością G+C (54–60% mol.), co sugeruje możliwość wystąpienia horyzontalnych zdarzeń transferu genów (Trivedi i in., 2016). U P. putida XWY-1 obserwuje się podobny układ genów degradujących karbaryl, ale geny te są zlokalizowane na plazmidzie (Zhu i in., 2019).
Oprócz wydajności metabolicznej na poziomie biochemicznym i genomicznym, mikroorganizmy wykazują również inne właściwości lub reakcje, takie jak chemotaksja, właściwości modyfikacji powierzchni komórek, kompartmentalizacja, preferencyjne wykorzystanie, produkcja biosurfaktantów itp., które pomagają im skuteczniej metabolizować zanieczyszczenia aromatyczne w zanieczyszczonym środowisku (rysunek 7).
Rysunek 7. Różne strategie reakcji komórkowej idealnych bakterii rozkładających węglowodory aromatyczne w celu efektywnej biodegradacji obcych związków zanieczyszczających.
Reakcje chemotaktyczne są uważane za czynniki zwiększające degradację zanieczyszczeń organicznych w heterogenicznie zanieczyszczonych ekosystemach. (2002) wykazali, że chemotaksja Pseudomonas sp. G7 na naftalen zwiększa tempo degradacji naftalenu w systemach wodnych. Szczep dzikiego typu G7 degradował naftalen znacznie szybciej niż zmutowany szczep z niedoborem chemotaksji. Stwierdzono, że białko NahY (538 aminokwasów o topologii błonowej) jest współtranskrybowane z genami szlaku metarozszczepienia na plazmidzie NAH7 i podobnie jak transduktor chemotaksji, białko to wydaje się działać jako chemoreceptor degradacji naftalenu (Grimm i Harwood 1997). Inne badanie przeprowadzone przez Hansel i in. (2009) wykazało, że białko to jest chemotaktyczne, ale jego tempo degradacji jest wysokie. (2011) zademonstrowali chemotaktyczną odpowiedź Pseudomonas (P. putida) na gazowy naftalen, w której dyfuzja w fazie gazowej powodowała stały przepływ naftalenu do komórek, co kontrolowało chemotaktyczną odpowiedź komórek. Naukowcy wykorzystali to chemotaktyczne zachowanie do skonstruowania mikrobów, które zwiększyłyby tempo degradacji. Badania wykazały, że szlaki chemosensoryczne regulują również inne funkcje komórkowe, takie jak podział komórek, regulacja cyklu komórkowego i tworzenie biofilmu, pomagając w ten sposób kontrolować tempo degradacji. Jednak wykorzystanie tej właściwości (chemotaksji) do wydajnej degradacji jest utrudnione przez kilka wąskich gardeł. Główne przeszkody to: (a) różne receptory paralogiczne rozpoznają te same związki/ligandy; (b) istnienie alternatywnych receptorów, tj. tropizmu energetycznego; (c) znaczące różnice sekwencji w domenach sensorycznych tej samej rodziny receptorów; oraz (d) brak informacji na temat głównych białek sensorycznych bakterii (Ortega i in., 2017; Martin-Mora i in., 2018). Czasami biodegradacja węglowodorów aromatycznych prowadzi do powstania wielu metabolitów/produktów pośrednich, które mogą być chemotaktyczne dla jednej grupy bakterii, ale odpychające dla innych, co dodatkowo komplikuje proces. Aby zidentyfikować interakcje ligandów (węglowodorów aromatycznych) z receptorami chemicznymi, skonstruowaliśmy hybrydowe białka sensoryczne (PcaY, McfR i NahY) poprzez fuzję domen sensorycznej i sygnałowej Pseudomonas putida i Escherichia coli, które celują odpowiednio w receptory kwasów aromatycznych, produktów pośrednich TCA i naftalenu (Luu i in., 2019).
Pod wpływem naftalenu i innych wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) struktura błony komórkowej bakterii i integralność mikroorganizmów ulegają istotnym zmianom. Badania wykazały, że naftalen zakłóca interakcje łańcucha acylowego poprzez oddziaływania hydrofobowe, zwiększając w ten sposób pęcznienie i płynność błony (Sikkema i in., 1995). Aby przeciwdziałać temu szkodliwemu efektowi, bakterie regulują płynność błony komórkowej poprzez zmianę stosunku i składu kwasów tłuszczowych między izo/anteizo rozgałęzionymi kwasami tłuszczowymi oraz izomeryzację cis-nienasyconych kwasów tłuszczowych do odpowiednich izomerów trans (Heipieper i de Bont, 1994). W przypadku Pseudomonas stutzeri hodowanych na naftalenie stosunek kwasów tłuszczowych nasyconych do nienasyconych wzrósł z 1,1 do 2,1, podczas gdy w przypadku Pseudomonas JS150 stosunek ten wzrósł z 7,5 do 12,0 (Mrozik i in., 2004). Komórki Achromobacter KAs 3–5 hodowane na naftalenie wykazywały agregację wokół kryształów naftalenu i spadek ładunku powierzchniowego (z -22,5 do -2,5 mV), czemu towarzyszyła kondensacja cytoplazmy i wakuolizacja, co wskazuje na zmiany w strukturze i właściwościach powierzchni komórki (Mohapatra i in., 2019). Chociaż zmiany komórkowe/powierzchniowe są bezpośrednio związane z lepszym wychwytem zanieczyszczeń aromatycznych, odpowiednie strategie bioinżynieryjne nie zostały jeszcze dokładnie zoptymalizowane. Manipulacja kształtem komórki była rzadko wykorzystywana do optymalizacji procesów biologicznych (Volke i Nikel, 2018). Usunięcie genów wpływających na podział komórek powoduje zmiany w ich morfologii. Usunięcie genów wpływających na podział komórek powoduje zmiany w ich morfologii. Wykazano, że w Bacillus subtilis białko SepF, będące przegrodą komórkową, bierze udział w tworzeniu przegrody i jest niezbędne do kolejnych etapów podziału komórki, ale nie jest genem niezbędnym. Usunięcie genów kodujących hydrolazy peptydoglikanów w Bacillus subtilis spowodowało wydłużenie komórek, zwiększenie swoistego tempa wzrostu i poprawę zdolności produkcji enzymów (Cui i in., 2018).
Zaproponowano kompartmentalizację szlaku degradacji karbarylu w celu osiągnięcia wydajnej degradacji szczepów Pseudomonas C5pp i C7 (Kamini i in., 2018). Sugeruje się, że karbaryl jest transportowany do przestrzeni peryplazmatycznej przez przegrodę błony zewnętrznej i/lub przez dyfuzyjne poryny. CH to enzym peryplazmatyczny, który katalizuje hydrolizę karbarylu do 1-naftolu, który jest bardziej stabilny, hydrofobowy i toksyczny. CH jest zlokalizowany w peryplazmie i charakteryzuje się niskim powinowactwem do karbarylu, kontrolując w ten sposób powstawanie 1-naftolu, zapobiegając jego akumulacji w komórkach i zmniejszając jego toksyczność dla komórek (Kamini i in., 2018). Powstały 1-naftol transportowany jest do cytoplazmy przez błonę wewnętrzną poprzez podział i/lub dyfuzję, a następnie ulega hydroksylacji do 1,2-dihydroksynaftalenu przez enzym o wysokim powinowactwie 1NH w celu dalszego metabolizmu w centralnym szlaku węglowym.
Chociaż mikroorganizmy posiadają genetyczne i metaboliczne zdolności do degradacji ksenobiotycznych źródeł węgla, hierarchiczna struktura ich wykorzystania (tj. preferencyjne wykorzystanie prostych źródeł węgla w stosunku do złożonych) stanowi główną przeszkodę dla biodegradacji. Obecność i wykorzystanie prostych źródeł węgla obniża ekspresję genów kodujących enzymy degradujące złożone/niepreferowane źródła węgla, takie jak WWA. Dobrze zbadanym przykładem jest to, że gdy Escherichia coli jest jednocześnie karmiona glukozą i laktozą, glukoza jest wykorzystywana wydajniej niż laktoza (Jacob i Monod, 1965). Donoszono, że Pseudomonas degraduje różnorodne WWA i związki ksenobiotyczne jako źródła węgla. Hierarchia wykorzystania źródeł węgla u Pseudomonas jest następująca: kwasy organiczne > glukoza > związki aromatyczne (Hylemon i Phibbs, 1972; Collier i in., 1996). Istnieje jednak wyjątek. Co ciekawe, Pseudomonas sp. Bakteria CSV86 charakteryzuje się unikalną strukturą hierarchiczną, która preferencyjnie wykorzystuje węglowodory aromatyczne (kwas benzoesowy, naftalen itp.) zamiast glukozy i współmetabolizuje węglowodory aromatyczne z kwasami organicznymi (Basu i in., 2006). U tej bakterii geny odpowiedzialne za degradację i transport węglowodorów aromatycznych nie ulegają obniżeniu ekspresji, nawet w obecności drugiego źródła węgla, takiego jak glukoza lub kwasy organiczne. Podczas hodowli w podłożu z glukozą i węglowodorami aromatycznymi zaobserwowano obniżoną ekspresję genów odpowiedzialnych za transport i metabolizm glukozy, węglowodory aromatyczne były wykorzystywane w pierwszej fazie logarytmicznej, a glukoza w drugiej fazie logarytmicznej (Basu i in., 2006; Choudhary i in., 2017). Z drugiej strony, obecność kwasów organicznych nie wpływała na ekspresję metabolizmu węglowodorów aromatycznych, dlatego oczekuje się, że bakteria ta będzie szczepem kandydackim do badań nad biodegradacją (Phale i in., 2020).
Powszechnie wiadomo, że biotransformacja węglowodorów może powodować stres oksydacyjny i wzmożoną ekspresję enzymów antyoksydacyjnych w mikroorganizmach. Nieefektywna biodegradacja naftalenu, zarówno w komórkach fazy stacjonarnej, jak i w obecności związków toksycznych, prowadzi do powstawania reaktywnych form tlenu (RFT) (Kang i in. 2006). Ponieważ enzymy degradujące naftalen zawierają klastry żelazowo-siarkowe, w warunkach stresu oksydacyjnego żelazo w hemie i białkach żelazowo-siarkowych ulega utlenieniu, co prowadzi do inaktywacji białek. Reduktaza ferredoksyny-NADP+ (Fpr), wraz z dysmutazą ponadtlenkową (SOD), pośredniczy w odwracalnej reakcji redoks pomiędzy NADP+/NADPH a dwiema cząsteczkami ferredoksyny lub flawodoksyny, usuwając w ten sposób RFT i przywracając centrum żelazowo-siarkowe w warunkach stresu oksydacyjnego (Li i in. 2006). Donoszono, że zarówno Fpr, jak i SodA (SOD) w Pseudomonas mogą być indukowane przez stres oksydacyjny, a zwiększoną aktywność SOD i katalazy zaobserwowano u czterech szczepów Pseudomonas (O1, W1, As1 i G1) podczas wzrostu w warunkach z dodatkiem naftalenu (Kang i in., 2006). Badania wykazały, że dodatek przeciwutleniaczy, takich jak kwas askorbinowy lub żelazo(II) (Fe2+), może zwiększyć tempo wzrostu naftalenu. Podczas wzrostu Rhodococcus erythropolis w podłożu naftalowym, transkrypcja genów cytochromu P450 związanych ze stresem oksydacyjnym, w tym sodA (dysmutaza ponadtlenkowa Fe/Mn), sodC (dysmutaza ponadtlenkowa Cu/Zn) i recA, uległa zwiększeniu (Sazykin i in., 2019). Porównawcza ilościowa analiza proteomiczna komórek Pseudomonas hodowanych w naftalenie wykazała, że ​​zwiększenie ekspresji różnych białek związanych z reakcją na stres oksydacyjny jest strategią radzenia sobie ze stresem (Herbst i in., 2013).
Donoszono, że mikroorganizmy wytwarzają biosurfaktanty pod wpływem hydrofobowych źródeł węgla. Surfaktanty te to amfifilowe związki powierzchniowo czynne, które mogą tworzyć agregaty na granicy faz olej-woda lub powietrze-woda. Sprzyja to pseudo-solubilizacji i ułatwia adsorpcję węglowodorów aromatycznych, co skutkuje wydajną biodegradacją (Rahman i in., 2002). Ze względu na te właściwości biosurfaktanty są szeroko stosowane w różnych gałęziach przemysłu. Dodatek chemicznych surfaktantów lub biosurfaktantów do kultur bakteryjnych może zwiększyć wydajność i szybkość degradacji węglowodorów. Spośród biosurfaktantów, ramnolipidy wytwarzane przez Pseudomonas aeruginosa zostały dogłębnie przebadane i scharakteryzowane (Hisatsuka i in., 1971; Rahman i in., 2002). Ponadto, inne rodzaje biosurfaktantów obejmują lipopeptydy (mucyny z Pseudomonas fluorescens), emulgator 378 (z Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg i Ron, 1999), lipidy disacharydowe trehalozy z Rhodococcus (Ramdahl, 1985), licheninę z Bacillus (Saraswathy i Hallberg, 2002) oraz surfaktant z Bacillus subtilis (Siegmund i Wagner, 1991) i Bacillus amyloliquefaciens (Zhi i in., 2017). Wykazano, że te silne surfaktanty obniżają napięcie powierzchniowe z 72 dyn/cm do mniej niż 30 dyn/cm, umożliwiając lepszą absorpcję węglowodorów. Donoszono, że Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia i inne gatunki bakterii mogą wytwarzać różne biosurfaktanty na bazie ramnolipidów i glikolipidów podczas wzrostu w środowisku naftalenu i metylonaftalenu (Kanga i in., 1997; Puntus i in., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 może wytwarzać pozakomórkowy biosurfaktant Biosur-Pm podczas wzrostu na związkach aromatycznych, takich jak kwas naftoesowy (Phale i in., 1995). Kinetyka tworzenia Biosur-Pm wykazała, że ​​jego synteza jest procesem zależnym od wzrostu i pH. Stwierdzono, że ilość Biosur-Pm wytwarzana przez komórki przy pH obojętnym była wyższa niż przy pH 8,5. Komórki hodowane przy pH 8,5 były bardziej hydrofobowe i miały większe powinowactwo do związków aromatycznych i alifatycznych niż komórki hodowane przy pH 7,0. W przypadku Rhodococcus spp. N6, wyższy stosunek węgla do azotu (C:N) i ograniczenie żelaza stanowią optymalne warunki do produkcji pozakomórkowych biosurfaktantów (Mutalik i in., 2008). Podejmowano próby usprawnienia biosyntezy biosurfaktantów (surfaktantów) poprzez optymalizację szczepów i fermentacji. Jednak miano surfaktantu w podłożu hodowlanym jest niskie (1,0 g/l), co stanowi wyzwanie dla produkcji na dużą skalę (Jiao i in., 2017; Wu i in., 2019). Dlatego też, w celu usprawnienia jego biosyntezy, zastosowano metody inżynierii genetycznej. Jednak jego modyfikacja inżynieryjna jest trudna ze względu na duży rozmiar operonu (∼25 kb) i złożoną regulację biosyntezy układu wykrywania kworum (Jiao i in., 2017; Wu i in., 2019). W bakteriach Bacillus przeprowadzono szereg modyfikacji genetycznych, których głównym celem było zwiększenie produkcji surfaktyny poprzez zastąpienie promotora (operonu srfA), nadekspresję białka eksportującego surfaktynę YerP oraz czynników regulacyjnych ComX i PhrC (Jiao i in., 2017). Jednakże te metody inżynierii genetycznej pozwoliły na uzyskanie tylko jednej lub kilku modyfikacji genetycznych i nie zostały jeszcze wprowadzone do produkcji komercyjnej. Dlatego konieczne są dalsze badania nad metodami optymalizacji opartymi na wiedzy.
Badania biodegradacji WWA są prowadzone głównie w standardowych warunkach laboratoryjnych. Jednakże w miejscach zanieczyszczonych lub w środowisku zanieczyszczonym wykazano, że wiele czynników abiotycznych i biotycznych (temperatura, pH, tlen, dostępność składników odżywczych, biodostępność substratów, inne ksenobiotyki, hamowanie produktów końcowych itp.) zmienia i wpływa na zdolność mikroorganizmów do degradacji.
Temperatura ma istotny wpływ na biodegradację WWA. Wraz ze wzrostem temperatury spada stężenie tlenu rozpuszczonego, co wpływa na metabolizm mikroorganizmów tlenowych, ponieważ wymagają one tlenu cząsteczkowego jako jednego z substratów dla oksygenaz przeprowadzających reakcje hydroksylacji lub rozszczepiania pierścienia. Często zauważa się, że podwyższona temperatura przekształca macierzyste WWA w związki bardziej toksyczne, hamując tym samym biodegradację (Muller i in., 1998).
Zauważono, że wiele miejsc zanieczyszczonych WWA charakteryzuje się ekstremalnymi wartościami pH, takimi jak miejsca skażone kwaśnymi odwodnieniami kopalni (pH 1–4) oraz miejsca zgazowania gazu ziemnego/węgla zanieczyszczone alkalicznymi odciekami (pH 8–12). Warunki te mogą poważnie wpłynąć na proces biodegradacji. Dlatego przed zastosowaniem mikroorganizmów do bioremediacji zaleca się dostosowanie pH poprzez dodanie odpowiednich substancji chemicznych (o umiarkowanym lub bardzo niskim potencjale utleniająco-redukcyjnym), takich jak siarczan amonu lub azotan amonu w przypadku gleb zasadowych, lub wapnowanie węglanem wapnia lub węglanem magnezu w przypadku gleb kwaśnych (Bowlen i in. 1995; Gupta i Sar 2020).
Dopływ tlenu do dotkniętego obszaru jest czynnikiem ograniczającym tempo biodegradacji WWA. Ze względu na warunki redoks środowiska, procesy bioremediacji in situ zazwyczaj wymagają wprowadzenia tlenu ze źródeł zewnętrznych (uprawa roli, napowietrzanie i dodawanie chemikaliów) (Pardieck i in., 1992). Odenkranz i in. (1996) wykazali, że dodanie nadtlenku magnezu (związku uwalniającego tlen) do zanieczyszczonego poziomu wodonośnego może skutecznie doprowadzić do bioremediacji związków BTEX. W innym badaniu zbadano degradację in situ fenolu i BTEX w zanieczyszczonym poziomie wodonośnym poprzez wstrzykiwanie azotanu sodu i budowę studni ekstrakcyjnych w celu osiągnięcia skutecznej bioremediacji (Bewley i Webb, 2001).