Obecnie *Aktualny adres: Kolonia 50931, Niemcy, Kolonia Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Neurodegeneracja w chorobach mitochondrialnych jest uważana za nieodwracalną, ponieważ plastyczność metaboliczna neuronów jest ograniczona, a wpływ dysfunkcji mitochondriów na autonomię komórkową metabolizmu neuronalnego w organizmie jest słabo poznany. W niniejszym artykule przedstawiamy komórkowo-specyficzny proteom neuronów Purkinjego z postępującym niedoborem OXPHOS, spowodowanym zaburzoną dynamiką fuzji mitochondriów. Stwierdziliśmy, że dysfunkcja mitochondriów wywołała głęboką zmianę w dziedzinie proteomiki, która ostatecznie doprowadziła do sekwencyjnej aktywacji precyzyjnych programów metabolicznych przed śmiercią komórki. Nieoczekiwanie stwierdziliśmy oczywistą indukcję karboksylazy pirogronianowej (PCx) i innych enzymów przeciwstarzeniowych, które uzupełniają pośrednie produkty cyklu TCA. Hamowanie PCx nasiliło stres oksydacyjny i neurodegenerację, co wskazuje, że miażdżyca ma działanie ochronne na neurony pozbawione OXPHOS. Przywrócenie fuzji mitochondriów w terminalnie zdegenerowanych neuronach całkowicie odwraca te cechy metaboliczne, zapobiegając w ten sposób śmierci komórki. Nasze odkrycia pozwalają zidentyfikować nieznane dotąd ścieżki, które zapewniają odporność na dysfunkcję mitochondriów i pokazują, że neurodegenerację można odwrócić nawet w późnych stadiach choroby.
Centralna rola mitochondriów w utrzymaniu neuronalnego metabolizmu energetycznego jest podkreślana przez rozległe objawy neurologiczne związane z ludzkimi chorobami mitochondrialnymi. Większość tych chorób jest spowodowana mutacjami genów, które regulują ekspresję genów mitochondrialnych (1, 2) lub destrukcją genów związaną z dynamiką mitochondriów, co pośrednio wpływa na stabilność mitochondrialnego DNA (mtDNA) (3, 4). Badania na modelach zwierzęcych wykazały, że w odpowiedzi na dysfunkcję mitochondriów w otaczających tkankach mogą zostać aktywowane konserwatywne szlaki metaboliczne (5-7), co dostarcza ważnych informacji dla dogłębnego zrozumienia patogenezy tych złożonych chorób. W przeciwieństwie do tego, nasza wiedza na temat zmian metabolicznych określonych typów komórek spowodowanych ogólną niewydolnością produkcji adenozynotrifosforanu (ATP) w mitochondriach mózgu jest fundamentalna (8), co podkreśla potrzebę identyfikacji celów terapeutycznych, które można wykorzystać do zapobiegania lub zapobiegania chorobom. Zapobiegaj neurodegeneracji (9). Brak informacji wynika z faktu, że komórki nerwowe są powszechnie uważane za posiadające bardzo ograniczoną elastyczność metaboliczną w porównaniu z typami komórek otaczających tkanek (10). Biorąc pod uwagę, że komórki te odgrywają kluczową rolę w koordynacji dostarczania metabolitów do neuronów w celu promowania transmisji synaptycznej i reagowania na urazy i choroby, zdolność adaptacji metabolizmu komórkowego do trudnych warunków tkanki mózgowej jest niemal ograniczona do komórek glejowych (11-14). Ponadto, wrodzona heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej w znacznym stopniu utrudnia badanie zmian metabolicznych zachodzących w określonych podgrupach neuronów. W rezultacie niewiele wiadomo na temat dokładnych komórkowych i metabolicznych konsekwencji dysfunkcji mitochondriów w neuronach.
Aby zrozumieć metaboliczne konsekwencje dysfunkcji mitochondriów, wyizolowaliśmy neurony Purkinjego (PN) w różnych stadiach neurodegeneracji, spowodowanej zniszczeniem fuzji zewnętrznej błony mitochondrialnej (Mfn2). Chociaż mutacje Mfn2 u ludzi są związane z postacią dziedzicznej neuropatii czuciowo-ruchowej znanej jako zespół Charcota-Mariego-Tootha typu 2A (15), warunkowe zniszczenie Mfn2 u myszy jest dobrze poznaną metodą dysfunkcji indukowanej utlenianiem fosforylacją (OXPHOS). Różnym podtypom neuronów (16-19) i wynikającemu z nich fenotypowi neurodegeneracyjnemu towarzyszą postępujące objawy neurologiczne, takie jak zaburzenia ruchowe (18, 19) lub ataksja móżdżkowa (16). Stosując kombinację bezznacznikowej ilościowej (LFQ) proteomiki, metabolomiki, obrazowania i metod wirusologicznych, wykazaliśmy, że postępująca neurodegeneracja silnie indukuje karboksylazę pirogronianową (PCx) i inne czynniki zaangażowane w miażdżycę PN in vivo Ekspresja enzymów. Aby zweryfikować istotność tego odkrycia, specyficznie obniżyliśmy ekspresję PCx w PN z niedoborem Mfn2 i odkryliśmy, że ta operacja nasiliła stres oksydacyjny i przyspieszyła neurodegenerację, udowadniając w ten sposób, że azoospermia nadaje śmierć komórkową Metaboliczna zdolność adaptacyjna. Ciężka ekspresja MFN2 może całkowicie uratować terminalną degenerację PN z ciężkim niedoborem OXPHOS, masywnym zużyciem mitochondrialnego DNA i najwyraźniej uszkodzoną siecią mitochondrialną, co dodatkowo podkreśla, że ​​ta forma neurodegeneracji może nawet wyzdrowieć w zaawansowanym stadium choroby przed śmiercią komórki.
Aby zwizualizować mitochondria w neuronach PN z wyłączonym genem Mfn2, wykorzystaliśmy szczep myszy, który pozwala mitochondriom zależnym od Cre na ukierunkowanie ekspresji białka żółtej fluorescencji (YFP) (mtYFP) (20) Cre i sprawdziliśmy morfologię mitochondriów in vivo. Stwierdziliśmy, że zniszczenie genu Mfn2 w neuronach PN prowadzi do stopniowego podziału sieci mitochondrialnej (ryc. S1A), a najwcześniejszą zmianę zaobserwowano w wieku 3 tygodni. Natomiast znaczna degeneracja warstwy komórek PN, o czym świadczy utrata immunobarwienia kalbindyną, rozpoczęła się dopiero w wieku 12 tygodni (ryc. 1, A i B). Niedopasowanie czasowe między najwcześniejszymi zmianami w morfologii mitochondriów a widocznym początkiem obumierania neuronów skłoniło nas do zbadania zmian metabolicznych wywołanych dysfunkcją mitochondriów przed śmiercią komórki. Opracowaliśmy strategię sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu wyizolowania komórek PN ekspresujących YFP (YFP+) (Rysunek 1C) oraz u myszy kontrolnych (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), zwanych dalej CTRL (Rysunek S1B). Optymalizacja strategii bramkowania oparta na względnej intensywności sygnału YFP pozwala nam oczyścić ciało YFP+ (YFPhigh) komórek PN z komórek niebędących PN (YFPneg) (Rysunek S1B) lub domniemanych fluorescencyjnych fragmentów aksonów/dendrytów (YFPlow; Rysunek S1D, po lewej), co zostało potwierdzone mikroskopem konfokalnym (Rysunek S1D, po prawej). Aby zweryfikować tożsamość sklasyfikowanej populacji, przeprowadziliśmy proteomikę LFQ, a następnie analizę głównych składowych i stwierdziliśmy wyraźne rozdzielenie komórek YFPhigh i YFPneg (Rysunek S1C). Komórki YFPhigh wykazały wzbogacenie netto znanych markerów PN (tj. Calb1, Pcp2, Grid2 i Itpr3) (21, 22), ale brak wzbogacenia białek powszechnie wyrażanych w neuronach lub innych typach komórek (Rysunek 1D). Porównanie próbek w sklasyfikowanych komórkach YFPhigh zebranych w niezależnych eksperymentach wykazało współczynnik korelacji > 0,9, co dowodzi dobrej powtarzalności między replikatami biologicznymi (Rysunek S1E). Podsumowując, dane te potwierdziły nasz plan ostrej i swoistej izolacji wykonalnego PN. Ponieważ zastosowany system sterownika L7-cre indukuje rekombinację mozaikową w pierwszym tygodniu po porodzie (23), rozpoczęliśmy selekcję myszy z CTRL i warunkowo (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) zbierać neurony. Po zakończeniu rekombinacji, w wieku 4 tygodni nazywa się ją Mfn2cKO. Jako punkt końcowy wybraliśmy 8. tydzień życia, w którym warstwa PN była nienaruszona pomimo widocznej fragmentacji mitochondriów (ryc. 1B i ryc. S1A). Łącznie skwantyfikowaliśmy 3013 białek, z czego około 22% oparto na adnotacjach MitoCarta 2.0 opartych na proteomie mitochondrialnym jako mitochondriach (ryc. 1E) (24). Analiza różnicowej ekspresji genów przeprowadzona w 8. tygodniu wykazała, że ​​tylko 10,5% wszystkich białek wykazywało istotne zmiany (ryc. 1F i ryc. S1F), z czego 195 białek było w dół, a 120 w górę (ryc. 1F). Warto zauważyć, że „innowacyjna analiza szlaków” tego zestawu danych pokazuje, że geny o zróżnicowanej ekspresji należą głównie do ograniczonego zestawu specyficznych szlaków metabolicznych (ryc. 1G). Co ciekawe, chociaż zmniejszenie ekspresji szlaków związanych z OXPHOS i sygnalizacją wapniową potwierdza indukcję dysfunkcji mitochondriów w PN z niedoborem fuzji, inne kategorie, które obejmują głównie metabolizm aminokwasów, są znacząco zwiększone, co jest zgodne z metabolizmem zachodzącym w mitochondrialnych PN. Przeprogramowanie jest spójne.
(A) Typowe fotografie konfokalne przekrojów móżdżku myszy CTRL i Mfn2cKO, ukazujące postępującą utratę neuronów PN (kalbindyna, kolor szary); jądra kontrastowo barwiono DAPI. (B) Kwantyfikacja (A) (jednokierunkowa analiza wariancji, ***P<0,001; n = 4 do 6 kółek od trzech myszy). (C) Przebieg eksperymentu. (D) Rozkład mapy cieplnej markerów specyficznych dla komórek Purkinjego (góra) i innych typów komórek (środek). (E) Diagram Venna przedstawiający liczbę białek mitochondrialnych zidentyfikowanych w sklasyfikowanej neuronze PN. (F) Wykres wulkaniczny różnicowo ekspresjonowanych białek w neuronach Mfn2cKO po 8 tygodniach (istotny próg odcięcia 1,3). (G) Analiza szlaków kreatywności przedstawia pięć najważniejszych szlaków regulacji w górę (czerwony) i regulacji w dół (niebieski) w neuronach Mfn2cKO sklasyfikowanych jako 8-tygodniowe. Przedstawiono średni poziom ekspresji każdego wykrytego białka. Mapa cieplna w skali szarości: skorygowana wartość p. ns, nieistotne.
Dane proteomiczne wykazały, że ekspresja białka kompleksów I, III i IV stopniowo spadała. Kompleksy I, III i IV zawierały niezbędne podjednostki kodowane przez mtDNA, podczas gdy kompleks II, kodowany jedynie jądrowo, pozostał zasadniczo niezmieniony (Rysunek 2A i Rysunek S2A). Zgodnie z wynikami proteomiki, immunohistochemia skrawków tkanki móżdżku wykazała, że ​​poziom podjednostki MTCO1 (podjednostki 1 mitochondrialnej oksydazy cytochromu C) kompleksu IV w PN stopniowo spadał (Rysunek 2B). Podjednostka Mtatp8 kodowana przez mtDNA była istotnie zmniejszona (Rysunek S2A), podczas gdy poziom stacjonarny kodowanej jądrowo podjednostki syntazy ATP pozostał niezmieniony, co jest zgodne ze znanym stabilnym kompleksem podzespołu syntazy ATP F1, gdy ekspresja mtDNA jest stabilna. Formacja jest spójna. Przerwij (7). Ocena poziomu mtDNA w sortowanych PN Mfn2cKO za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) potwierdziła stopniowy spadek liczby kopii mtDNA. W porównaniu z grupą kontrolną, w wieku 8 tygodni, zachowano jedynie około 20% poziomu mtDNA (Rysunek 2C). Zgodnie z tymi wynikami, barwienie mikroskopem konfokalnym PN Mfn2cKO zostało użyte do wykrycia DNA, pokazując zależne od czasu zużycie nukleotydów mitochondrialnych (Rysunek 2D). Stwierdziliśmy, że tylko niektórzy kandydaci zaangażowani w degradację białek mitochondrialnych i odpowiedź na stres byli regulowani w górę, w tym Lonp1, Afg3l2 i Clpx oraz czynniki składania kompleksu OXPHOS. Nie wykryto istotnych zmian w poziomach białek zaangażowanych w apoptozę (Rysunek S2B). Podobnie stwierdziliśmy, że kanały mitochondrialne i siateczki śródplazmatycznej zaangażowane w transport wapnia uległy jedynie niewielkim zmianom (ryc. S2C). Ponadto, ocena białek związanych z autofagią nie wykazała istotnych zmian, co jest zgodne z widoczną indukcją autofagosomów obserwowaną in vivo za pomocą immunohistochemii i mikroskopii elektronowej (ryc. S3). Jednakże postępującemu zaburzeniu funkcji OXPHOS w neuronach neuronalnych towarzyszą wyraźne zmiany ultrastrukturalne mitochondriów. W ciałach komórek i drzewach dendrytycznych neuronów neuronalnych Mfn2cKO w wieku 5 i 8 tygodni można zaobserwować skupiska mitochondriów, a struktura błony wewnętrznej uległa głębokim zmianom (ryc. S4, A i B). Zgodnie z tymi zmianami ultrastrukturalnymi i istotnym spadkiem mtDNA, analiza ostrych skrawków móżdżku z estrem metylowym tetrametylorodaminy (TMRM) wykazała, że ​​potencjał błony mitochondrialnej w neuronach neuronalnych Mfn2cKO był istotnie zmniejszony (ryc. S4C).
(A) Analiza przebiegu w czasie poziomu ekspresji kompleksu OXPHOS. Rozważ tylko białka z P <0,05 po 8 tygodniach (dwuczynnikowa analiza wariancji). Linia przerywana: Brak korekty w porównaniu z CTRL. (B) Po lewej: Przykład przekroju móżdżku znakowanego przeciwciałem anty-MTCO1 (skala, 20 μm). Obszar zajmowany przez ciała komórek Purkinjego jest zaznaczony na żółto. Po prawej: Kwantyfikacja poziomów MTCO1 (jednoczynnikowa analiza wariancji; n = 7 do 20 komórek analizowanych od trzech myszy). (C) Analiza qPCR liczby kopii mtDNA w posortowanym PN (jednoczynnikowa analiza wariancji; n = 3 do 7 myszy). (D) Po lewej: Przykład przekroju móżdżku znakowanego przeciwciałem anty-DNA (skala, 20 μm). Obszar zajmowany przez ciała komórek Purkinjego jest zaznaczony na żółto. Po prawej: Kwantyfikacja zmian mtDNA (jednokierunkowa analiza wariancji; n = 5 do 9 komórek od trzech myszy). (E) Przykład ostrego przekroju móżdżku przedstawiający komórki Purkinjego mitoYFP + (strzałka) w nagraniu z całokomórkowej metody patch clamp. (F) Kwantyfikacja krzywej IV. (G) Typowe zapisy wstrzyknięcia prądu depolaryzującego do komórek Purkinjego CTRL i Mfn2cKO. Górny ślad: Pierwszy impuls, który wywołał AP. Dolny ślad: Maksymalna częstotliwość AP. (H) Kwantyfikacja postsynaptycznych spontanicznych sygnałów wejściowych (sPSP). Typowy ślad nagrania i jego współczynnik powiększenia przedstawiono w (I). Jednokierunkowa analiza wariancji analizowała n = 5 do 20 komórek od trzech myszy. Dane wyrażono jako średnia ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Typowe ślady spontanicznej AP zarejestrowane przy użyciu trybu perforowanego patch clamp. Górny ślad: Maksymalna częstotliwość AP. Dolny ślad: Powiększenie pojedynczego AP. (K) Określ średnią i maksymalną częstotliwość AP zgodnie z (J). Test Manna-Whitneya; przeanalizowano n = 5 komórek od czterech myszy. Dane wyrażono jako średnia ± SEM; nieistotne.
U 8-tygodniowych neuronów Mfn2cKO PN wykryto wyraźne uszkodzenie OXPHOS, co wskazuje na poważne zaburzenia fizjologiczne funkcji neuronów. Dlatego przeanalizowaliśmy pasywne charakterystyki elektryczne neuronów z niedoborem OXPHOS w wieku 4–5 i 7–8 tygodni, wykonując rejestracje metodą patch clamp całych komórek w ostrych przekrojach móżdżku (ryc. 2E). Nieoczekiwanie średni potencjał błonowy spoczynkowy i oporność wejściowa neuronów Mfn2cKO były podobne do wartości w grupie kontrolnej, chociaż występowały subtelne różnice między komórkami (tab. 1). Podobnie, w wieku 4–5 tygodni nie stwierdzono istotnych zmian w zależności prąd–napięcie (krzywa IV) (ryc. 2F). Jednakże, żaden neuron Mfn2cKO w wieku 7–8 tygodni nie przeżył schematu dożylnego (etap hiperpolaryzacji), co wskazuje na wyraźną wrażliwość na potencjał hiperpolaryzacji na tym późnym etapie. Natomiast w neuronach Mfn2cKO prądy depolaryzujące, które powodują powtarzające się wyładowania potencjału czynnościowego (AP), są dobrze tolerowane, co wskazuje, że ich ogólne wzorce wyładowań nie różnią się istotnie od wzorców 8-tygodniowych neuronów kontrolnych (Tabela 1 i Rycina 2G). Podobnie, częstotliwość i amplituda spontanicznych prądów postsynaptycznych (sPSC) były porównywalne z tymi w grupie kontrolnej, a częstość zdarzeń wzrosła z 4 tygodni do 5 tygodni do 7 tygodni do 8 tygodni z podobnym wzrostem (Rycina 2, H i I). Okres dojrzewania synaptycznego w neuronach postsynaptycznych (PN) (25). Podobne wyniki uzyskano po perforowanych łatkach neuronów postsynaptycznych. Taka konfiguracja zapobiega możliwej kompensacji defektów ATP w komórkach, co mogłoby się zdarzyć w całokomórkowej rejestracji patch clamp. W szczególności, potencjał błonowy spoczynkowy i częstotliwość spontanicznych wyładowań neuronów Mfn2cKO nie zostały naruszone (Rycina 2, J i K). Podsumowując, wyniki te wskazują, że neurony PN z wyraźną dysfunkcją OXPHOS dobrze radzą sobie z wzorcami wyładowań o wysokiej częstotliwości, co wskazuje na istnienie mechanizmu kompensacyjnego, który pozwala im na utrzymanie niemalże normalnych odpowiedzi elektrofizjologicznych.
Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (jednokierunkowa analiza wariancji, test wielokrotnych porównań Holma-Sidaka; *P<0,05). Numer jednostki podano w nawiasach.
Postanowiliśmy zbadać, czy jakakolwiek kategoria w zestawie danych proteomicznych (Rysunek 1G) obejmuje ścieżki, które mogą przeciwdziałać poważnemu niedoborowi OXPHOS, wyjaśniając w ten sposób, dlaczego dotknięte PN może utrzymać prawie normalną elektrofizjologię (Rysunek 2, E do K). . Analiza proteomiczna wykazała, że ​​enzymy biorące udział w katabolizmie aminokwasów rozgałęzionych (BCAA) były znacząco podwyższone (Rysunek 3A i Rysunek S5A), a końcowy produkt acetylo-CoA (CoA) lub sukcynylo-CoA może uzupełniać trikarboksylany w cyklu kwasu miażdżycowego (TCA). Stwierdziliśmy, że wzrosła zawartość aminotransferazy BCAA 1 (BCAT1) i BCAT2. Katalizują one pierwszy etap katabolizmu BCAA poprzez generowanie glutaminianu z α-ketoglutaranu (26). Wszystkie podjednostki tworzące kompleks dehydrogenazy ketokwasów o rozgałęzionych łańcuchach (BCKD) są w stanie podwyższonej ekspresji (kompleks katalizuje późniejszą i nieodwracalną dekarboksylację powstałego szkieletu węglowego BCAA) (ryc. 3A i ryc. S5A). Nie zaobserwowano jednak żadnych widocznych zmian w samym BCAA w posortowanej PN, co może wynikać ze zwiększonego wychwytu komórkowego tych niezbędnych aminokwasów lub wykorzystania innych źródeł (glukozy lub kwasu mlekowego) w celu uzupełnienia cyklu TCA (ryc. S5B). PN pozbawione OXPHOS wykazywały również zwiększoną aktywność rozkładu glutaminy i transaminacji w wieku 8 tygodni, co może być odzwierciedlone w podwyższonej ekspresji enzymów mitochondrialnych glutaminazy (GLS) i transaminazy glutaminopirogronianowej 2 (GPT2) (ryc. 3, A i C). Warto zauważyć, że zwiększenie ekspresji GLS jest ograniczone do izoformy splicingowej glutaminazy C (GLS-GAC) (zmiana Mfn2cKO/CTRL wynosi około 4,5-krotna, P = 0,05), a jego specyficzne zwiększenie ekspresji w tkankach nowotworowych może wspierać bioenergię mitochondrialną. (27).
(A) Mapa cieplna pokazuje zmianę krotności poziomu białka dla określonej drogi po 8 tygodniach. (B) Przykład wycinka móżdżku znakowanego przeciwciałem anty-PCx (podziałka, 20 μm). Żółta strzałka wskazuje na ciało komórki Purkinjego. (C) Analiza ekspresji białka w czasie zidentyfikowana jako ważny kandydat na miażdżycę (wielokrotny test t, *FDR <5%; n = 3-5 myszy). (D) Powyżej: Schematyczny diagram pokazujący różne drogi wprowadzania znakowanego węgla zawartego w znaczniku [1-13C]pirogronianu (tj. poprzez PDH lub drogą przeztętniczą). Dół: Wykres skrzypcowy pokazuje procent pojedynczo znakowanego węgla (M1) przekształconego w kwas asparaginowy, kwas cytrynowy i kwas jabłkowy po znakowaniu ostrych wycinków móżdżku [1-13C]pirogronianu (sparowany test t; **P <0,01). (E) Kompleksowa analiza historii czasowej wskazanej ścieżki. Uwzględniono wyłącznie białka o p < 0,05 po 8 tygodniach. Linia przerywana: brak wartości korekty (dwukierunkowa analiza wariancji; * p < 0,05; *** p < 0,001). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM.
W naszej analizie katabolizm BCAA stał się jedną z kluczowych ścieżek regulacji w górę. Fakt ten silnie sugeruje, że objętość wentylacji wchodząca do cyklu TCA może być zmieniona w PN pozbawionym OXPHOS. Może to stanowić główną formę neuronalnego przeprogramowania metabolicznego, która może mieć bezpośredni wpływ na fizjologię neuronów i przeżycie podczas utrzymywania się ciężkiej dysfunkcji OXPHOS. Zgodnie z tą hipotezą odkryliśmy, że główny enzym przeciwmiażdżycowy PCx jest regulowany w górę (Mfn2cKO/CTRL zmienia się około 1,5 raza; Rycina 3A), co katalizuje przekształcanie pirogronianu w szczawiooctan (28), który uważa się za występujący w tkance mózgowej. Ekspresja w jest ograniczona do astrocytów (29, 30). Zgodnie z wynikami proteomiki, mikroskopia konfokalna wykazała, że ​​ekspresja PCx była specyficznie i istotnie zwiększona w PN z niedoborem OXPHOS, podczas gdy reaktywność PCx była głównie ograniczona do sąsiadujących komórek glejowych Bergmanna kontroli (Rysunek 3B). Aby funkcjonalnie przetestować zaobserwowaną regulację w górę PCx, poddaliśmy ostre plasterki móżdżku działaniu znacznika [1-13C]pirogronianu. Gdy pirogronian został utleniony przez dehydrogenazę pirogronianową (PDH), jego znacznik izotopowy zanikł, ale jest włączany do pośrednich produktów cyklu TCA, gdy pirogronian jest metabolizowany przez reakcje naczyniowe (Rysunek 3D). Na poparcie naszych danych proteomicznych zaobserwowaliśmy dużą liczbę markerów z tego znacznika w kwasie asparaginowym plasterków Mfn2cKO, podczas gdy kwas cytrynowy i kwas jabłkowy również miały umiarkowany trend, choć nieistotny statystycznie (Rysunek 3D).
W neuronach dopaminowych myszy MitoPark z dysfunkcją mitochondriów spowodowaną przez neurony dopaminowe specyficznie niszczące gen mitochondrialnego czynnika transkrypcyjnego A (Tfam) (rycina S6B), ekspresja PCx była również znacząco zwiększona (31), co wskazuje, że miażdżyca kwasem acetonowym Występowanie choroby jest regulowane podczas dysfunkcji neuronalnego OXPHOS w organizmie. Warto zauważyć, że odkryto, że unikalne enzymy (32-34), które mogą być wyrażane w neuronach, które mogą być związane z miażdżycą, są znacząco zwiększone w neuronach PN pozbawionych OXPHOS, takich jak karboksylaza propionylo-CoA (PCC-A), malonylo-CoA przekształcająca propionylo-CoA do sukcynylo-CoA i mitochondrialny enzym jabłkowy 3 (ME3), którego główną rolą jest odzyskiwanie pirogronianu z jabłczanu (rycina 3, A i C) (33, 35). Ponadto zaobserwowaliśmy znaczący wzrost aktywności enzymu Pdk3, który fosforyluje, a tym samym inaktywuje PDH (36), podczas gdy nie zaobserwowano zmian w aktywności enzymu Pdp1, który aktywuje PDH, ani w samym kompleksie enzymatycznym PDH (ryc. 3A). Co więcej, w PN Mern2cKO, fosforylacja podjednostki α1 (PDHE1α) składnika dehydrogenazy pirogronianowej E1 kompleksu PDH w Ser293 (o którym wiadomo, że hamuje aktywność enzymatyczną PDH) była zwiększona (ryc. S6C). Pirowinian nie ma dostępu naczyniowego.
Wreszcie odkryliśmy, że superścieżka biosyntezy seryny i glicyny, powiązany mitochondrialny cykl kwasu foliowego (1C) i biosynteza proliny (Rysunek 1G i Rysunek S5C) są znacząco regulowane w górę, zgodnie z doniesieniami, podczas procesu aktywacji. Otaczające tkanki są aktywowane z dysfunkcją mitochondriów (5-7). Analiza konfokalna potwierdzająca te dane proteomiczne wykazała, że ​​w PN z brakiem OXPHOS, wycinki móżdżku 8-tygodniowych myszy poddano działaniu serynowej hydroksymetylotransferazy 2 (SHMT2), kluczowego enzymu mitochondrialnego cyklu kwasu foliowego. Znacząca odpowiedź immunologiczna (Rysunek S5D). W 13 ostrych wycinkach móżdżku inkubowanych z CU-glukozą, eksperymenty śledzenia metabolizmu dodatkowo potwierdziły regulację w górę biosyntezy seryny i proliny, wskazując na zwiększony przepływ izoform węgla do seryny i proliny (Rysunek S5E). Ponieważ reakcje promowane przez GLS i GPT2 są odpowiedzialne za syntezę glutaminianu z glutaminy i transaminację między glutaminianem a α-ketoglutaranem, ich wzmożona regulacja wskazuje, że neurony z niedoborem OXPHOS mają zwiększone zapotrzebowanie na glutaminian. Może to mieć na celu utrzymanie zwiększonej biosyntezy proliny (ryc. S5C). W przeciwieństwie do tych zmian, analiza proteomiczna astrocytów móżdżku myszy Mfn2cKO specyficznych dla PN wykazała, że ​​te szlaki (w tym wszystkie antyperoksydazy) nie zmieniły się znacząco w ekspresji, co dowodzi, że to przekierowanie metaboliczne jest selektywne dla zdegradowanej PN (ryc. S6, D do G).
Podsumowując, analizy te ujawniły znacząco różne wzorce czasowej aktywacji określonych szlaków metabolicznych w PN. Chociaż nieprawidłowa funkcja neuronalnych mitochondriów może prowadzić do wczesnej miażdżycy i przebudowy 1C (rycina 3E i rycina S5C), a nawet przewidywalnych zmian w ekspresji kompleksów I i IV, zmiany w syntezie seryny de novo są widoczne dopiero w późnych stadiach. Dysfunkcja OXPHOS (rycina 3E i rycina S5C). Odkrycia te definiują sekwencyjny proces, w którym indukowane stresem mitochondria (cykl 1C) i cytoplazmatyczne (biosynteza seryny) reagują synergistycznie ze wzrostem miażdżycy w cyklu TCA, aby przekształcić metabolizm neuronalny.
8-tygodniowe neurony PN z niedoborem OXPHOS mogą utrzymywać aktywność wzbudzenia o wysokiej częstotliwości i ulegać znaczącej rekoneksji metabolicznej, aby kompensować dysfunkcję mitochondriów. To odkrycie stwarza interesującą możliwość, że nawet w tym momencie komórki te mogą również otrzymać interwencję terapeutyczną w celu opóźnienia lub zapobiegania neurodegeneracji. Późno. Rozwiązaliśmy tę możliwość poprzez dwie niezależne interwencje. W pierwszej metodzie zaprojektowaliśmy wektor wirusa adeno-stowarzyszonego zależnego od Cre (AAV), tak aby MFN2 mógł być selektywnie ekspresjonowany w neuronach PN z niedoborem OXPHOS in vivo (Rysunek S7A). AAV kodujący MFN2 i fluorescencyjny gen reporterowy mCherry (Mfn2-AAV) zostały zweryfikowane w pierwotnych hodowlach neuronów in vitro, co spowodowało ekspresję MFN2 w sposób zależny od Cre i przywróciło morfologię mitochondriów, zapobiegając w ten sposób neuromutacji w neuronach Mfn2cKO (Rysunek S7, B, D i E). Następnie przeprowadziliśmy eksperymenty in vivo, aby stereotaktycznie dostarczyć 8-tygodniowy Mfn2-AAV do kory móżdżku myszy Mfn2cKO i kontrolnych, a także przeanalizowaliśmy 12-tygodniowe myszy (rycina 4A). Leczone myszy Mfn2cKO padły (rycina 1, A i B) (16). Transdukcja wirusowa in vivo skutkowała selektywną ekspresją PN w niektórych kręgach móżdżku (rycina S7, G i H). Wstrzyknięcie kontrolnego AAV ekspresującego tylko mCherry (Ctrl-AAV) nie miało istotnego wpływu na stopień neurodegeneracji u zwierząt Mfn2cKO. Natomiast analiza Mfn2cKO transdukowanych Mfn2-AAV wykazała istotny efekt ochronny warstwy komórek PN (rycina 4, B i C). W szczególności gęstość neuronów wydaje się być niemal nieodróżnialna od zwierząt kontrolnych (Rysunek 4, B i C oraz Rysunek S7, H i I). Ekspresja MFN1, ale nie MFN2, jest równie skuteczna w zapobieganiu śmierci neuronów (Rysunek 4C oraz Rysunek S7, C i F), co wskazuje, że ekspresja ektopowego MFN1 może skutecznie uzupełniać brak MFN2. Dalsza analiza na poziomie pojedynczego PN wykazała, że ​​Mfn2-AAV w dużej mierze przywrócił ultrastrukturę mitochondriów, znormalizował poziomy mtDNA i odwrócił wysoką ekspresję markera antyangiogennego PCx (Rysunek 4, C do E). Wizualna inspekcja uratowanych myszy Mfn2cKO w stanie spoczynku wykazała, że ​​ich postawa i objawy motoryczne (ruch S1 do S3) uległy poprawie. Podsumowując, eksperymenty te pokazują, że opóźnione ponowne wprowadzenie MFN2 do neuronów neuronalnych, u których występuje poważny niedobór OXPHOS, wystarcza, aby odwrócić zużycie mtDNA i wywołać miażdżycę, zapobiegając w ten sposób degeneracji aksonów i obumieraniu neuronów in vivo.
(A) Schemat przedstawiający eksperymentalny harmonogram wstrzykiwania AAV kodującego MFN2 po aktywacji wskazanego szlaku metabolicznego. (B) Reprezentatywne obrazy konfokalne 12-tygodniowych skrawków móżdżku transdukowanych w 8. tygodniu u myszy Mfn2cKO i znakowanych przeciwciałem anty-kalbindyna. Po prawej: Skalowanie włókien aksonów. Skala powiększenia aksonu wynosi 450 i 75 μm. (C) Po lewej: Kwantyfikacja gęstości komórek Purkinjego w pętli transdukcji AAV (AAV+) (jednokierunkowa analiza wariancji; n = 3 myszy). Po prawej: Analiza ognisk mtDNA w transdukowanym PN w 12. tygodniu (niesparowany test t; n = 6 komórek od trzech myszy). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Reprezentatywne zdjęcia z mikroskopu elektronowego transmisyjnego PNs w przekrojach móżdżku Mfn2cKO transdukowanych wskazanymi wektorami wirusowymi. Różowa maska ​​ilustruje obszar zajmowany przez dendryty, a żółty przerywany kwadrat ilustruje powiększenie po prawej stronie; n oznacza jądro. Skala: 1 μm. (E) przedstawia przykład barwienia PCx w PN transdukowanym w wieku 12 tygodni. Skala: 20 μm. OE – nadekspresja; FC – krotność zmiany.
Na koniec zbadaliśmy znaczenie przeżycia komórek indukowanego peroksydazą w PN, u których wystąpiła dysfunkcja OXPHOS. Wygenerowaliśmy mCherry kodujący AAV-shRNA (krótkie RNA o strukturze spinki do włosów) specyficznie ukierunkowany na mysi mRNA PCx (AAV-shPCx) i wstrzyknęliśmy wirusa lub jego pomieszaną kontrolę (AAV-scr) do móżdżku myszy Mfn2cKO. Wstrzyknięcie wykonano w czwartym tygodniu życia (ryc. 5A), aby uzyskać skuteczne obniżenie ekspresji PCx w okresie, gdy ekspresja PCx wzrosła (ryc. 3C), a warstwa komórek PN była nadal nienaruszona (ryc. 1A). Warto zauważyć, że obniżenie ekspresji PCx (ryc. S8A) prowadzi do znacznego przyspieszenia obumierania PN, które jest ograniczone do zakażonego pierścienia (ryc. 5, B i C). Aby zrozumieć mechanizm efektów metabolicznych wywołanych przez regulację w górę PCx, zbadaliśmy status redoks PN po wyciszeniu PCx i jednoczesnej ekspresji optycznego biosensora Grx1-roGFP2 pośredniczonego przez AAV (Rysunek S8, B do D), aby ocenić względną zmianę potencjału redoks peptydu glutationu (38). Następnie przeprowadziliśmy mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej (FLIM) w ostrych plasterkach mózgu 7-tygodniowych Mfn2cKO lub kontrolnych miotów, aby wykryć potencjalne zmiany statusu redoks cytoplazmy po zweryfikowaniu warunków FLIM (Rysunek S8, E do G). Analiza wykazała istotny wzrost stopnia utlenienia pojedynczych Mfn2cKO PN bez ekspresji PCx, co różni się od neuronów kontrolnych lub Mfn2cKO PN wyrażających tylko pomieszany shRNA (Rysunek 5, D i E). Gdy obniżono ekspresję PCx, odsetek neuronów Mfn2cKO wykazujących stan silnego utlenienia wzrósł ponad trzykrotnie (ryc. 5E), co wskazuje, że zwiększenie ekspresji PCx utrzymało zdolność redoks zdegenerowanych neuronów.
(A) Schemat przedstawiający eksperymentalny harmonogram wstrzykiwania AAV kodującego shPCx, gdy aktywowany jest wskazany szlak metaboliczny. (B) Reprezentatywne fotografie konfokalne 8-tygodniowych przekrojów móżdżku u myszy Mfn2cKO transdukowanych i znakowanych przeciwciałem przeciwko kalcyneurynie w wieku 4 tygodni. Skala: 450 μm. (C) Kwantyfikacja gęstości komórek Purkinjego w pętlach transdukowanych AAV (jednokierunkowa analiza wariancji; n = 3 do 4 myszy). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM; ***P <0,001. (D) Reprezentatywny obraz FLIM przedstawia średnią długość życia 7-tygodniowego PN ekspresującego czujnik redoks glutationu Grx1-roGFP2 w określonych warunkach eksperymentalnych. Stosunek LUT (tabela przeglądowa): przedział czasu przeżycia (w pikosekundach). Skala: 25 μm. (E) Histogram przedstawia rozkład wartości czasu życia Grx1-roGFP2 w (D) (n = 158 do 368 komórek u dwóch myszy w każdej sytuacji). Wykres kołowy nad każdym histogramem przedstawia liczbę komórek o istotnie dłuższych (czerwone, utlenione) lub krótszych (niebieskie, skrócone) wartościach czasu życia, które przekraczają 1 SD średniej wartości czasu życia w teście CTRL-AAV-scr. (F) Proponowany model pokazuje ochronny efekt regulacji w górę neuronalnego PCx.
Podsumowując, przedstawione przez nas dane pokazują, że reekspresja MFN2 może całkowicie uratować zaawansowaną neuropatię neuralgiczną (PN) z ciężkim niedoborem OXPHOS, znacznym ubytkiem mtDNA i skrajnie nieprawidłową morfologią przypominającą Ista, zapewniając tym samym ciągły postęp nawet w zaawansowanych chorobach. Neurodegeneracja dostarcza odwracalnych dowodów na stadium poprzedzające śmierć komórki. Ten stopień elastyczności metabolicznej jest dodatkowo podkreślany przez zdolność neuronów do indukowania miażdżycy (przeprogramowania cyklu TCA), co hamuje ekspresję PCx w neuropatiach neuralgicznych (PN) pozbawionych OXPHOS i nasila śmierć komórek, pełniąc w ten sposób rolę ochronną (ryc. 5F).
W tym badaniu dostarczyliśmy dowodów, że odpowiedzią neuronów neuronalnych (PN) na dysfunkcję OXPHOS jest stopniowa zbieżność do miażdżycy cyklu TCA poprzez różnicową ścieżkę aktywacji aktywowaną przez programy metaboliczne. Potwierdziliśmy analizę proteomiczną wieloma uzupełniającymi się metodami i ujawniliśmy, że neurony poddane wyzwaniu ciężkiej dysfunkcji mitochondriów mają nieznaną wcześniej formę elastyczności metabolicznej. Ku naszemu zaskoczeniu, cały proces przeprogramowania niekoniecznie oznacza końcowy stan metaboliczny, który towarzyszy neurodegeneracji stopniowo i nieodwracalnie, ale nasze dane sugerują, że może on stanowić neuron podtrzymujący nawet na etapie przed śmiercią komórki Mechanizm kompensacji funkcjonalnej. To odkrycie wskazuje, że neurony mają znaczny stopień plastyczności metabolicznej w organizmie. Fakt ten dowodzi, że późniejsze ponowne wprowadzenie MFN2 może odwrócić ekspresję kluczowych markerów metabolicznych i zapobiec degeneracji neuronów neuronalnych. Wręcz przeciwnie, hamuje miażdżycę i przyspiesza nerwy. transseksualny.
Jednym z najbardziej fascynujących odkryć naszych badań jest to, że PN pozbawione OXPHOS mogą modyfikować metabolizm cyklu TCA poprzez regulację w górę enzymów, które specyficznie stymulują miażdżycę. Przegrupowanie metaboliczne jest wspólną cechą komórek nowotworowych, z których niektóre polegają na glutaminie w celu uzupełnienia pośrednich produktów cyklu TCA w celu wytworzenia ekwiwalentów redukujących, które napędzają łańcuch oddechowy i podtrzymują produkcję prekursorów biosyntezy lipidów i nukleotydów (39, 40). Niedawne badanie wykazało, że w tkankach obwodowych doświadczających dysfunkcji OXPHOS, ponowne połączenie metabolizmu glutaminy/glutaminianu jest również ważną cechą (5, 41), gdzie kierunek wejścia glutaminy do cyklu TCA zależy od Ze względu na ciężkość uszkodzenia OXPHOS (41). ). Jednakże brak jest wyraźnych dowodów na jakiekolwiek podobieństwo neuronalnej plastyczności metabolicznej w organizmie i jej możliwego znaczenia w kontekście choroby. W niedawnym badaniu in vitro wykazano, że pierwotne neurony korowe mobilizują pule glutaminianu do neurotransmisji, promując w ten sposób metabolizm oksydacyjny i miażdżycę w warunkach stresu metabolicznego (42). Warto zauważyć, że w warunkach farmakologicznego hamowania enzymu cyklu kwasu trójkarboksylowego (TCA), dehydrogenazy bursztynianowej, karboksylacja pirogronianu uważa się za czynnik podtrzymujący syntezę szczawiooctanu w hodowanych neuronach ziarnistych móżdżku (34). Jednakże fizjologiczne znaczenie tych mechanizmów dla tkanki mózgowej (gdzie uważa się, że miażdżyca jest ograniczona głównie do astrocytów) nadal ma istotne znaczenie fizjologiczne (43). W tym przypadku nasze dane pokazują, że neurony PN uszkodzone przez OXPHOS w organizmie mogą zostać przełączone na degradację BCAA i karboksylację pirogronianu, które są dwoma głównymi źródłami suplementacji pośrednich puli TCA. Chociaż zaproponowano domniemany udział katabolizmu BCAA w metabolizmie energetycznym neuronów, oprócz roli glutaminianu i GABA w neurotransmisji (44), nadal nie ma dowodów na te mechanizmy in vivo. Dlatego łatwo jest spekulować, że dysfunkcyjne neurony PN mogą automatycznie kompensować zużycie pośrednich produktów TCA napędzanych procesem asymilacji poprzez zwiększenie miażdżycy. W szczególności regulacja w górę PCx może być wymagana do utrzymania zwiększonego zapotrzebowania na kwas asparaginowy, co jest sugerowane w proliferujących komórkach z dysfunkcją mitochondriów (45). Jednak nasza analiza metabolomiczna nie ujawniła żadnych istotnych zmian w stanie stacjonarnym poziomu kwasu asparaginowego w neuronach PN Mfn2cKO (Rysunek S6A), co prawdopodobnie odzwierciedla różne metaboliczne wykorzystanie kwasu asparaginowego między komórkami proliferującymi i neuronami postmitotycznymi. Chociaż dokładny mechanizm regulacji PCx w dysfunkcyjnych neuronach in vivo pozostaje niejasny, wykazaliśmy, że ta przedwczesna reakcja odgrywa istotną rolę w utrzymaniu stanu redoks neuronów, co zostało wykazane w eksperymentach FLIM na skrawkach móżdżku. W szczególności, zapobieganie regulacji PCx przez neurony neuronów neuronalnych może prowadzić do bardziej utlenionego stanu i przyspieszenia obumierania komórek. Aktywacja degradacji BCAA i karboksylacja pirogronianu nie są metodami charakteryzowania tkanek obwodowych w dysfunkcji mitochondriów (7). Dlatego też wydają się one być priorytetową cechą neuronów z niedoborem OXPHOS, nawet jeśli nie jedyną, istotną dla neurodegeneracji.
Choroba móżdżku to heterogenny rodzaj choroby neurodegeneracyjnej, która zazwyczaj objawia się ataksją i często uszkadza neurony rdzeniowo-móżdżkowe (PNPH) (46). Ta populacja neuronów jest szczególnie podatna na dysfunkcję mitochondriów, ponieważ ich selektywna degeneracja u myszy jest wystarczająca do odtworzenia wielu objawów motorycznych charakterystycznych dla ludzkiej ataksji rdzeniowo-móżdżkowej (16, 47, 48). Według doniesień, transgeniczny model myszy ze zmutowanym genem jest powiązany z ludzką ataksją rdzeniowo-móżdżkową i ma dysfunkcję mitochondriów (49, 50), co podkreśla znaczenie badania konsekwencji niedoboru OXPHOS w PNPH. Dlatego też szczególnie odpowiednia jest skuteczna izolacja i badanie tej unikalnej populacji neuronów. Jednakże, biorąc pod uwagę, że neurony rdzeniowo-móżdżkowe są bardzo wrażliwe na nacisk i stanowią niewielki odsetek całej populacji komórek móżdżku, w przypadku wielu badań opartych na modelach omikowych, selektywna separacja ich jako całych komórek nadal stanowi wyzwanie. Chociaż osiągnięcie absolutnego braku zanieczyszczeń innymi typami komórek (zwłaszcza tkanek dorosłych) jest prawie niemożliwe, połączyliśmy skuteczny etap dysocjacji z FACS, aby uzyskać wystarczającą liczbę żywych neuronów do dalszej analizy proteomicznej i mamy dość wysokie pokrycie białkowe (około 3000 białek) w porównaniu z istniejącym zestawem danych dla całego móżdżku (51). Dzięki zachowaniu żywotności całych komórek, metoda, którą tutaj przedstawiamy, pozwala nam nie tylko sprawdzić zmiany w szlakach metabolicznych w mitochondriach, ale także sprawdzić zmiany w ich cytoplazmatycznych odpowiednikach, co uzupełnia wykorzystanie znaczników błony mitochondrialnej w celu wzbogacenia typu komórek Nowa metoda liczby mitochondriów w złożonych tkankach (52, 53). Opisywana przez nas metoda jest nie tylko związana z badaniem komórek Purkinjego, ale może być łatwo zastosowana do dowolnego typu komórek w celu zajęcia się zmianami metabolicznymi w chorych mózgach, w tym innymi modelami dysfunkcji mitochondriów.
Wreszcie, zidentyfikowaliśmy okno terapeutyczne w trakcie tego procesu przegrupowania metabolicznego, które może całkowicie odwrócić kluczowe objawy stresu komórkowego i zapobiec degeneracji neuronów. Dlatego zrozumienie funkcjonalnych implikacji opisanej tutaj reorganizacji może dostarczyć fundamentalnych informacji na temat możliwych metod leczenia, mających na celu utrzymanie żywotności neuronów podczas dysfunkcji mitochondriów. Konieczne są dalsze badania mające na celu analizę zmian w metabolizmie energetycznym innych typów komórek mózgowych, aby w pełni odkryć zastosowanie tej zasady w innych chorobach neurologicznych.
Myszy MitoPark zostały opisane wcześniej (31). Myszy C57BL/6N z loxP flankującym geny Mfn2 zostały opisane wcześniej (18) i skrzyżowane z myszami L7-Cre (23). Powstałe podwójnie heterozygotyczne potomstwo skrzyżowano następnie z homozygotycznymi myszami Mfn2loxP/Mfn2loxP w celu uzyskania specyficznych dla Purkinjego wycięć genu Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). W podgrupie krzyżowań, allel Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) został wprowadzony poprzez dodatkowe krzyżowania (20). Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzono zgodnie z wytycznymi europejskimi, krajowymi i instytucjonalnymi oraz zatwierdzono przez LandesamtfürNatur z Umwelt i Verbraucherschutz, Nadrenia Północna-Westfalia, Niemcy. Praca ze zwierzętami podlega również wytycznym Europejskiej Federacji Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych.
Po znieczuleniu kobiety ciężarnej, u której wykonano zabieg przemieszczenia szyjki macicy, izolowano zarodek myszy (E13). Korę mózgową rozcięto w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) z dodatkiem 10 mM Hepes i przepuszczono przez podłoże Dulbecco's Modified Eagle's Medium zawierające papainę (20 U/ml) i cysteinę (1 μg/ml). Tkankę inkubowano w DMEM i poddano trawieniu enzymatycznemu. Ml) w temperaturze 37°C przez 20 minut, a następnie zmielono mechanicznie w DMEM z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej. Komórki wysiano na szkiełka nakrywkowe pokryte polilizyną w gęstości 2×106 na płytkę hodowlaną o średnicy 6 cm lub w gęstości 0,5×105 komórek/cm² do analizy obrazowej. Po 4 godzinach podłoże zastąpiono podłożem Neurobasal bez surowicy, zawierającym 1% suplementu B27 i 0,5 mM GlutaMax. Neurony utrzymywano w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez cały okres eksperymentu, karmiąc je raz w tygodniu. W celu indukcji rekombinacji in vitro, drugiego dnia in vitro do neuronów użyto 3 μl (płytka hodowlana 24-dołkowa) lub 0,5 μl (płytka 24-dołkowa) następującego wektora wirusa AAV9: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, numer katalogowy 105530-AAV9) i AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, numer katalogowy 105545-AAV9).
Komplementarne DNA myszy Mfn1 i Mfn2 (pobrane odpowiednio z plazmidów Addgene nr 23212 i 23213) jest oznaczone sekwencją V5 (GKPIPNPLLGLDST) na C-końcu i połączone z mCherry w ramce do sekwencji T2A. Grx1-roGFP2 jest podarunkiem od Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Po zastąpieniu kasety tdTomato konwencjonalnymi metodami klonowania, kaseta została subklonowana do szkieletu pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (numer referencyjny Addgene 28306), aby wygenerować wektory pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 i pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Podobną strategię zastosowano do wygenerowania wektora kontrolnego pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Do wygenerowania konstruktu AAV-shPCx wymagany jest wektor plazmidowy AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), który zawiera sekwencję DNA kodującą shRNA ukierunkowane na mysie PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Pod kontrolą promotora U6, wykorzystano mCherry pod kontrolą promotora CMV. Produkcja pomocniczych wektorów AAV została przeprowadzona zgodnie z instrukcją producenta (Cell Biolabs). Krótko mówiąc, należy użyć plazmidu transferowego zawierającego gen kodujący mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) lub Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) oraz białko kapsydu AAV1 i białko dodatkowe (PBP) plazmidu pakującego, stosując metodę z fosforanem wapnia. Surowy supernatant wirusa uzyskano poprzez cykle zamrażania i rozmrażania w kąpieli z suchego lodu i etanolu, a komórki lizowano w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (PBS). Wektor AAV oczyszczono metodą ultracentrifugacji w gradiencie jodiksanolu (24 godziny przy 32 000 obr./min i 4°C) z nieciągłym wirowaniem (24 godziny przy 32 000 obr./min i 4°C) i zagęszczono przy użyciu filtra wirówkowego Amicon Ultra-15. Miano genomu AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 kopii genomu (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX zmierzono metodą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×1013 GC/ml) i AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 GC/ml), jak opisano wcześniej (54).
Neurony pierwotne zeskrobano w lodowatym roztworze 1x PBS, oddzielono od reszty białkowej, a następnie zhomogenizowano w buforze lizującym 0,5% Triton X-100 / 0,5% deoksycholan sodu/PBS, zawierającym inhibitor fosfatazy i proteazy (Roche). Kwantyfikację białka przeprowadzono za pomocą testu z kwasem bicynchoninowym (Thermo Fisher Scientific). Białka rozdzielono następnie metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS, a następnie przeniesiono na membranę z fluorku poliwinylidenu (GE Healthcare). Zablokować miejsca niespecyficzne i inkubować z przeciwciałem pierwotnym (szczegóły w Tabeli S1) w 5% mleku w TBST (sól fizjologiczna buforowana Tris z Tween), etapami płukania i przeciwciałem wtórnym w TBST. Inkubacja. Inkubować z przeciwciałem pierwotnym przez noc w temperaturze +4°C. Po przemyciu nanieść przeciwciało wtórne na 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie, inkubując ten sam blot z przeciwciałem przeciwko β-aktynie, potwierdzono to samo obciążenie. Detekcja poprzez konwersję do chemiluminescencji i wzmocnienie chemiluminescencji (GE Healthcare).
Neurony uprzednio zasiane na szkiełkach nakrywkowych utrwalano w 4% paraformaldehydu (PFA)/PBS w określonym punkcie czasowym w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Szkiełka nakrywkowe najpierw przesączono 0,1% Tritonem X-100/PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie w buforze blokującym [3% albumina surowicy bydlęcej (BSA)/PBS]. Drugiego dnia szkiełka nakrywkowe przemyto buforem blokującym i inkubowano z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; na koniec próbki dokładnie przemyto w PBS z kontrastującym barwnikiem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolowym (DAPI), a następnie utrwalono na szkiełku mikroskopowym za pomocą Aqua-Poly/Mount.
Myszy (samce i samice) znieczulono dootrzewnowo ketaminą (130 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) oraz podskórnie podano im karprofen (5 mg/kg) jako środek przeciwbólowy. Następnie umieszczono je w instrumencie stereotaktycznym (Kopf) wyposażonym w ciepłą matę. Odsłonięto czaszkę i wiertłem dentystycznym rozrzedzono część kory móżdżku odpowiadającą kości mizdrzy (od lambda: ogon 1,8, boczny 1, odpowiadający zrazikom IV i V). Za pomocą zakrzywionej igły strzykawki ostrożnie wytworzono mały otwór w czaszce, aby uniknąć przerwania naczyń krwionośnych poniżej. Następnie cienką, ciągnioną szklaną kapilarę powoli wprowadza się do mikrootworu (od -1,3 do -1 po stronie brzusznej opony twardej), a 200 do 300 nl AAV wstrzykuje się do mikrowstrzykiwacza (Narishige) za pomocą ręcznych strzykawek (Narishige) kilkakrotnie pod niskim ciśnieniem w ciągu 10 do 20 minut. Po infuzji należy umieścić kapilarę na kolejne 10 minut, aby umożliwić wirusowi całkowite rozprzestrzenienie się. Po usunięciu kapilar skóra jest starannie zszywana, aby zminimalizować stan zapalny rany i umożliwić zwierzęciu powrót do zdrowia. Zwierzęta leczono środkami przeciwbólowymi (kaspofen) przez kilka dni po operacji, w tym czasie uważnie monitorowano ich stan fizyczny, a następnie uśpiono je w określonym punkcie czasowym. Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z europejskimi, krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi i zostały zatwierdzone przez LandesamtfürNatur of Umwelt i Verbraucherschutz, Nadrenia Północna-Westfalia, Niemcy.
Zwierzęta znieczulono ketaminą (100 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg), a serce perfundowano najpierw 0,1 M PBS, a następnie 4% PFA w PBS. Tkankę wypreparowano i utrwalono w 4% PFA/PBS przez noc w temperaturze 4°C. Do przygotowania przekrojów strzałkowych (o grubości 50 μm) z utrwalonego mózgu w PBS użyto wibrującego noża (Leica Microsystems GmbH, Wiedeń, Austria). O ile nie określono inaczej, barwienie swobodnie pływających przekrojów przeprowadzono zgodnie z opisem powyżej (13) w temperaturze pokojowej i mieszając. W skrócie, najpierw uzyskane plasterki permeabilizowano 0,5% Triton X-100/PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej; W przypadku niektórych epitopów (Pcx i Shmt2), w buforze Tris-EDTA w temperaturze 80°C (PH 9), zamiast tego kroku, podgrzać plasterki przez 25 minut. Następnie, sekcje inkubowano z przeciwciałem pierwszorzędowym (patrz Tabela S1) w buforze blokującym (3% BSA/PBS) w temperaturze 4°C przez noc, mieszając. Następnego dnia, sekcje przemyto buforem blokującym i inkubowano z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; na koniec, sekcje dokładnie przemyto w PBS, kontrastowano DAPI, a następnie utrwalono AquaPolymount na szkiełku mikroskopowym.
Do obrazowania próbki użyto konfokalnego mikroskopu skaningowego (TCS SP8-X lub TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) wyposażonego w laser emitujący białe światło oraz diodę ultrafioletową 405. Poprzez wzbudzenie fluoroforu i zebranie sygnału za pomocą detektora hybrydowego (HyDs), oprogramowanie LAS-X zebrało obrazy warstwowe zgodne z próbkowaniem Nyquista w trybie sekwencyjnym: w przypadku paneli nieilościowych sygnały są bardzo dynamiczne (na przykład w komórkach somatycznych i dendrytach). (mtYFP) Użyj HyD do określenia liczby PN w trybie BrightR). Bramkowanie od 0,3 do 6 ns zastosowano w celu zmniejszenia tła.
Obrazowanie sortowanych komórek w czasie rzeczywistym. Po sortowaniu w podłożu Neurobasal-A zawierającym 1% suplementu B27 i 0,5 mM GlutaMax, komórki natychmiast wysiano na szkiełka mikroskopowe pokryte poli-L-lizyną (μ-Slide8 Well, Ibidi, numer katalogowy 80826). Następnie utrzymywano je w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 1 godzinę, aby umożliwić komórkom osiadanie. Obrazowanie w czasie rzeczywistym przeprowadzono za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego Leica SP8, wyposażonego w biały laser, HyD, obiektyw olejowy 63×[1,4 apertura numeryczna (NA)] i stolik grzejny.
Myszkę szybko znieczulono dwutlenkiem węgla i dekapitowano, mózg szybko wyjęto z czaszki i pocięto na skrawki strzałkowe o grubości 200 μm (do eksperymentów ze znakowaniem 13C) lub 275 μm (do eksperymentów z dwoma fotonami) wypełnione następującymi materiałami Lody (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Niemcy) wypełnione są następującymi substancjami: 125 mM lodowatego, nasyconego węglem (95% O2 i 5% CO2) płynu mózgowo-rdzeniowego o niskiej zawartości Ca2 + sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buforu fosforanu sodu, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukozy, 0,5 mM CaCl2 i 3,5 mM MgCl2 (ciśnienie osmotyczne od 310 do 330 mmol). Uzyskane wycinki mózgu należy przenieść do komory wstępnej inkubacji zawierającej wyższe stężenie Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buforu fosforanu sodu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukozy, 1,0 mM CaCl2 i 2,0 mM MgCl2) pH 7,4 i 310 do 320 mmol).
W trakcie obrazowania warstwy przeniesiono do dedykowanego pomieszczenia do obrazowania, a eksperyment przeprowadzono w warunkach ciągłej perfuzji ACSF w stałej temperaturze od 32°C do 33°C. Do obrazowania warstw użyto wielofotonowego mikroskopu skaningowego z laserem wielofotonowym (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) wyposażonego w obiektyw Leica 25x (NA 0,95, wodny) z laserem Ti:Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent). Moduł FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Zmiany cytoplazmatycznego stanu redoks neuronów PN mierzono metodą dwufotonowego FLIM w strzałkowych przekrojach mózgu, gdzie biosensor Grx1-roGFP2 celował w neurony PN. W warstwie neuronów PN pole akwizycji jest wybierane około 50 do 80 μm poniżej powierzchni przekroju, aby upewnić się, że występuje żywotna neuron PN (tj. brak struktury koralikowej lub zmian morfologicznych neuronów wzdłuż dendrytów) oraz podwójnie dodatni czujnik roGFP2 i AAV kodujący shRNA PCx lub jego sekwencję kontrolną (każdy z nich współekspresjonujący mCherry). Rejestruj obrazy w układzie pojedynczego stosu z dwukrotnym zoomem cyfrowym [długość fali wzbudzenia: 890 nm; 512 nm 512 pikseli]. Detekcja: wewnętrzna grupa filtrów HyD, izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) i uśrednianie obrazu w ciągu 2 do 3 minut są stosowane w celu zapewnienia zebrania wystarczającej liczby fotonów (łącznie 1000 fotonów) do dopasowania krzywej. Czułość sondy Grx1-roGFP2 i weryfikacja warunków FLIM zostały przeprowadzone poprzez monitorowanie wartości żywotności roGFP2 po dodaniu egzogennego 10 mM H2O2 do perfuzyjnego ACSF (w celu maksymalizacji utleniania, co skutkuje wydłużeniem żywotności), a następnie dodaniu 2 mM ditiotreitolu (minimalizuje stopień redukcji, co skutkuje skróceniem żywotności) (Rysunek S8, D do G). Do analizy uzyskanych wyników należy użyć oprogramowania FLIMfit 5.1.1, dopasować pojedynczą krzywą zaniku wykładniczego całego obrazu do zmierzonej funkcji odpowiedzi urządzenia (IRF), a χ2 wyniesie w przybliżeniu 1. Aby obliczyć czas życia pojedynczego nerwu nerwowego, ręcznie narysowano maskę wokół ciała nerwu, a do kwantyfikacji wykorzystano średni czas życia każdej maski.
Analiza potencjału mitochondrialnego. Po inkubacji ostrego odcinka z 100 nM TMRM dodanym bezpośrednio do perfundowanego ACSF przez 30 minut, zmiany potencjału mitochondrialnego komórek macierzystych (PN) mierzono za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Obrazowanie TMRM przeprowadzono wzbudzając sondę przy 920 nm i używając wewnętrznego HyD (izotiocyjanianu tetrametylorodaminy: 585/40 nm) do zbierania sygnałów; używając tej samej długości fali wzbudzenia, ale używając innego wewnętrznego HyD (FITC :525/50) do obrazowania mtYFP. Użyj wtyczki Image Calculator programu ImageJ do oceny potencjału mitochondrialnego na poziomie pojedynczej komórki. W skrócie, równanie wtyczki: sygnał = min (mtYFP, TMRM) służy do identyfikacji regionu mitochondrialnego, który wykazuje sygnał TMRM w Purkinjego Somali na pojedynczym obrazie konfokalnym odpowiedniego kanału. Następnie obszar pikseli w powstałej masce jest kwantyfikowany i normalizowany do odpowiadającego mu obrazu progowego pojedynczego stosu kanału mtYFP, aby uzyskać frakcję mitochondrialną pokazującą potencjał mitochondrialny.
Obraz został poddany dekonwolucji za pomocą oprogramowania Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). W przypadku zeskanowanych zdjęć kafelków, montaż pojedynczego kafelka odbywa się za pomocą automatycznego algorytmu łączenia, dostarczanego przez oprogramowanie LAS-X. Po kalibracji obrazu, użyj ImageJ i Adobe Photoshop, aby go dalej przetworzyć i równomiernie wyregulować jasność i kontrast. Do przygotowania grafiki użyj programu Adobe Illustrator.
Analiza ognisk mtDNA. Liczbę zmian mtDNA określono ilościowo na skrawkach móżdżku znakowanych przeciwciałami przeciwko DNA za pomocą mikroskopu konfokalnego. Każdy obszar docelowy utworzono dla ciała komórki i jądra komórkowego każdej komórki, a odpowiedni obszar obliczono za pomocą wtyczki Multi Measure (oprogramowanie ImageJ). Odejmij obszar jądra od obszaru ciała komórki, aby uzyskać obszar cytoplazmatyczny. Na koniec, za pomocą wtyczki Analyze Particles (oprogramowanie ImageJ) automatycznie zmierzono punkty cytoplazmatycznego DNA wskazujące na obecność mtDNA na obrazie progowym, a uzyskane wyniki znormalizowano do średniej PN myszy CTRL. Wyniki wyrażono jako średnią liczbę nukleozydów na komórkę.
Analiza ekspresji białek. Użyj wtyczki Image Calculator programu ImageJ, aby ocenić ekspresję białek w PN na poziomie pojedynczej komórki. Krótko mówiąc, na jednowarstwowym obrazie konfokalnym odpowiedniego kanału, za pomocą równania: sygnał = min (mtYFP, przeciwciało), identyfikuje się region mitochondrialny wykazujący immunoreaktywność z określonym przeciwciałem w Purkinie. Następnie obszar pikseli w powstałej masce jest kwantyfikowany, a następnie normalizowany do odpowiedniego, progowego obrazu jednowarstwowego kanału mtYFP, aby uzyskać frakcję mitochondrialną wyświetlanego białka.
Analiza gęstości komórek Purkinjego. Do oceny gęstości komórek Purkinjego wykorzystano wtyczkę Cell Counter programu ImageJ, dzieląc liczbę policzonych komórek Purkinjego przez długość pierścienia móżdżku zajmowanego przez policzone komórki.
Przygotowanie i pobieranie próbek. Mózgi myszy z grupy kontrolnej i Mfn2cKO utrwalono w 2% PFA/2,5% glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (PB), a następnie przygotowano skrawki koronalne przy użyciu orzęsków (Leica Mikrosysteme GmbH, Wiedeń, Austria) (grubość 50 do 60 μm). Następnie utrwalono w buforze PB w 1% tetratlenku os i 1,5% żelazocyjanku potasu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Skrawki przemyto trzykrotnie wodą destylowaną, a następnie barwiono 70% etanolem zawierającym 1% octanu uranylu przez 20 minut. Następnie skrawki odwodniono w gradiencie alkoholu i zatopiono w żywicy epoksydowej Durcupan ACM (żywica odlewnicza Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, numer katalogowy 14040) pomiędzy szkiełkami mikroskopowymi pokrytymi silikonem, a na koniec w temperaturze 60°C polimeryzowano w piecu przez 48 godzin. Wybrano obszar kory móżdżku i pocięto ultracienkie skrawki o grubości 50 nm na urządzeniu Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wiedeń, Austria), a następnie naniesiono je na miedzianą siatkę szczelinową o wymiarach 2×1 mm pokrytą folią polistyrenową. Skrawki barwiono roztworem 4% octanu uranylu w H2O przez 10 minut, przemywano kilkakrotnie H2O, a następnie cytrynianem ołowiu Reynoldsa w H2O przez 10 minut, po czym przemywano go kilkakrotnie H2O. Zdjęcia mikroskopowe wykonano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) z użyciem kamery cyfrowej TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Niemcy).
W przypadku myszy zakażonych wirusem AAV mózg oddzielono i pocięto na 1 mm grubości przekrój strzałkowy, a móżdżek zbadano pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu zidentyfikowania pierścienia zakażonego wirusem AAV (tj. wyrażającego mCherry). Wykorzystywano jedynie eksperymenty, w których wstrzyknięcie AAV skutkowało bardzo wysoką wydajnością transdukcji warstwy komórek Purkinjego (tj. prawie całej warstwy) w co najmniej dwóch kolejnych pierścieniach móżdżku. Pętlę transdukowaną wirusem AAV poddano mikrorozcinaniu w celu późniejszego utrwalenia przez noc (4% PFA i 2,5% glutaraldehydu w 0,1 M buforze kokosowym) i poddano dalszej obróbce. W celu zatopienia w EPON, utrwaloną tkankę przemyto 0,1 M buforem kokosowym sodu (Applichem) i inkubowano z 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) w 0,1 M buforze kokosowym sodu (Applichem) przez 4 godziny, a następnie przemyto przez 2 godziny. Powtórzyć 3 razy z 0,1 M buforem kokamidowym. Następnie, inkubując każdy roztwór etanolu w rosnącej serii w temperaturze 4°C przez 15 minut, odwodnić tkankę. Tkankę przeniesiono do tlenku propylenu i inkubowano przez noc w EPON (Sigma-Aldrich) w temperaturze 4°C. Umieścić tkankę w świeżym EPON w temperaturze pokojowej na 2 godziny, a następnie zatopić ją w temperaturze 62°C na 72 godziny. Użyć ultramikrotomu (Leica Microsystems, UC6) i noża diamentowego (Diatome, Biel, Szwajcaria) do pocięcia ultracienkich skrawków o grubości 70 nm i barwić 1,5% octanem uranylu przez 15 minut w temperaturze 37°C, a następnie barwić roztworem cytrynianu ołowiu przez 4 minuty. Zdjęcia mikroskopowe elektronowe wykonano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEM-2100 Plus (JEOL) wyposażonego w kamerę OneView 4K 16-bit (Gatan) i oprogramowanie DigitalMicrograph (Gatan). Do analizy zdjęcia mikroskopowe elektronowe wykonano z zoomem cyfrowym 5000× lub 10 000×.
Analiza morfologiczna mitochondriów. We wszystkich analizach kontury poszczególnych mitochondriów zostały ręcznie naniesione na obrazy cyfrowe za pomocą oprogramowania ImageJ. Analizowano różne parametry morfologiczne. Gęstość mitochondriów wyrażono jako wartość procentową, uzyskaną poprzez podzielenie całkowitej powierzchni mitochondriów każdej komórki przez powierzchnię cytoplazmy (powierzchnia cytoplazmy = powierzchnia komórki – powierzchnia jądra komórkowego) × 100. Kulistość mitochondriów oblicza się za pomocą wzoru [4π∙(powierzchnia/obwód 2)]. Przeanalizowano morfologię mitochondriów i podzielono je na dwie kategorie („cewkowe” i „pęcherzykowe”) w zależności od ich głównych kształtów.
Analiza liczby i gęstości autofagosomów/lizosomów. Użyj oprogramowania ImageJ do ręcznego obrysowania konturów każdego autofagosomu/lizosomu na obrazie cyfrowym. Powierzchnia autofagosomu/lizosomu jest wyrażona w procentach, dzieląc całkowitą powierzchnię struktury autofagosomu/lizosomu każdej komórki przez powierzchnię cytoplazmy (powierzchnia cytoplazmy = powierzchnia komórki - powierzchnia jądra komórkowego) × 100. Gęstość autofagosomów/lizosomów jest obliczana poprzez podzielenie całkowitej liczby przez liczbę struktur autofagosomu/lizosomu w komórce (w przeliczeniu na powierzchnię cytoplazmy) (powierzchnia cytoplazmy = powierzchnia komórki - powierzchnia jądra komórkowego).
Znakowanie do ostrego cięcia i przygotowania próbek. W przypadku eksperymentów wymagających znakowania glukozą, ostre wycinki mózgu należy przenieść do komory wstępnej inkubacji, która zawiera nasycony węgiel (95% O2 i 5% CO2), bufor o wysokim stężeniu Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM bufor fosforanowo-sodowy, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoza, 1,0 mM CaCl2 i 2,0 mM MgCl2, doprowadzony do pH 7,4 i 310–320 mOsm), w którym glukoza jest podstawiona 13C6-glukozą (Eurisotop, numer katalogowy CLM-1396). W przypadku eksperymentów wymagających znakowania pirogronianem, przenieś ostre wycinki mózgu do buforu o wyższym stężeniu Ca2+ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buforu fosforanowo-sodowego, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukozy, 1,0 mM CaCl2 i dodaj 2,0 mM MgCl2, dostosuj pH do 7,4 i 310 do 320 mOsm) i dodaj 1 mM 1-[1-13C]pirogronianu (Eurisotop, numer katalogowy CLM-1082). Inkubuj wycinki przez 90 minut w temperaturze 37°C. Po zakończeniu eksperymentu skrawki szybko przemyto roztworem wodnym (pH 7,4) zawierającym 75 mM węglanu amonu, a następnie zhomogenizowano w mieszaninie acetonitrylu (ACN): metanolu: wody w stosunku 40:40:20 (v:v:v). Po inkubacji skrawków na lodzie przez 30 minut, próbki wirowano z prędkością 21 000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a klarowny supernatant wysuszono w koncentratorze SpeedVac. Otrzymany wysuszony osad metabolitów przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy.
Analiza aminokwasów znakowanych 13C metodą chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas. Do analizy metodą chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas (LC-MS), osad metabolitu zawieszono w 75 μl wody o jakości LC-MS (Honeywell). Po wirowaniu z przyspieszeniem 21 000 g przez 5 minut w temperaturze 4°C, 20 μl sklarowanego supernatantu wykorzystano do analizy przepływu aminokwasów, a pozostałą część ekstraktu natychmiast użyto do analizy anionów (patrz poniżej). Analizę aminokwasów przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanym protokołem derywatyzacji chlorkiem benzoilu (55, 56). W pierwszym etapie do 20 μl ekstraktu metabolitu dodano 10 μl 100 mM węglanu sodu (Sigma-Aldrich), a następnie do ACN o jakości LC dodano 10 μl 2% chlorku benzoilu (Sigma-Aldrich). Próbkę krótko zawirowano, a następnie wirowano z prędkością 21 000 g przez 5 minut w temperaturze 20°C. Przeniesiono klarowny supernatant do 2 ml fiolki autosamplera ze stożkową wkładką szklaną (objętość 200 μl). Próbki analizowano za pomocą systemu chromatografii cieczowej o ultrawysokiej wydajności Acquity iClass (Waters) podłączonego do precyzyjnego spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Do analizy 2 μl derywatyzowanej próbki wstrzyknięto do kolumny T3 z wysokowytrzymałej krzemionki o wymiarach 100 × 1,0 mm (Waters) zawierającej cząstki o wielkości 1,8 μm. Szybkość przepływu wynosi 100 μl/min, a układ buforowy składa się z buforu A (10 mM mrówczanu amonu i 0,15% kwasu mrówkowego w wodzie) oraz buforu B (ACN). Gradient jest następujący: 0%B po 0 minutach; 0%B, 0 do 15% B po 0 do 0,1 minuty; 15 do 17% B po 0,1 do 0,5 minuty; B po 17 do 55% po 0,5 do 14 minut; B po 55 do 70% po 14 do 14,5 minuty; po 14,5 do 70 do 100% B po 18 minutach; 100% B po 18 do 19 minut; 100 do 0% B po 19 do 19,1 minuty; 0% B po 19,1 do 28 minut (55, 56). Spektrometr mas QE-HF pracuje w trybie jonizacji dodatniej z zakresem mas od 50 do 750 m/z (stosunek masy do ładunku). Zastosowana rozdzielczość wynosi 60 000, a uzyskany cel jonowy z kontrolą wzmocnienia (AGC) wynosi 3×106, a maksymalny czas jonizacji wynosi 100 milisekund. Źródło jonizacji metodą elektrorozpylania (ESI) z podgrzewaniem pracuje przy napięciu rozpylania 3,5 kV, temperaturze kapilary 250°C, przepływie powietrza w osłonie 60 AU (jednostek arbitralnych) i pomocniczym przepływie powietrza 20 AU. 250°C. Soczewka S jest ustawiona na 60 AU.
Chromatografia anionowa z analizą MS kwasów organicznych znakowanych 13C. Pozostały osad metabolitu (55 μl) analizowano za pomocą systemu chromatografii jonowej Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) połączonego ze spektrometrem mas QE-HF (Thermo Fisher Scientific). W skrócie, 5 μl ekstraktu metabolitu wstrzyknięto do kolumny Dionex IonPac AS11-HC wyposażonej w chromatografię HPLC (2 mm x 250 mm, rozmiar cząstek 4 μm, Thermo Fisher Scientific) w trybie pętli częściowej z wciskanym filtrem o współczynniku wypełnienia 1. Kolumna ochronna Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Temperaturę kolumny utrzymywano na poziomie 30°C, a autosampler ustawiono na 6°C. Użyj wkładu z wodorotlenkiem potasu, zaopatrzonego w wodę dejonizowaną, aby wygenerować gradient wodorotlenku potasu w generatorze eluentu. Separację metabolitów należy przeprowadzić z szybkością przepływu 380 μl/min, stosując następujący gradient: 0–3 minuty, 10 mM KOH; 3–12 minut, 10–50 mM KOH; 12–19 minut, 50–100 mM KOH; 19–21 minut, 100 mM KOH; 21–21,5 minuty, 100–10 mM KOH. Kolumnę ponownie zrównoważono w 10 mM KOH przez 8,5 minuty.
Wyeluowane metabolity są łączone ze strumieniem izopropanolu o przepływie 150 μl/min za kolumną, a następnie kierowane do spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości, pracującego w trybie ujemnej jonizacji. MS monitoruje zakres mas od m/z 50 do 750 z rozdzielczością 60 000. Automatyczna regulacja wzmocnienia (AGC) jest ustawiona na 1×106, a maksymalny czas jonizacji wynosi 100 ms. Podgrzewane źródło ESI pracuje przy napięciu natrysku 3,5 kV. Pozostałe ustawienia źródła jonów są następujące: temperatura kapilary 275°C; przepływ gazu osłonowego 60 AU; przepływ gazu pomocniczego 20 AU w temperaturze 300°C oraz ustawienie soczewki S na 60 AU.
Analiza danych metabolitów znakowanych 13C. Do analizy danych stosunku izotopów należy użyć oprogramowania TraceFinder (wersja 4.2, Thermo Fisher Scientific). Tożsamość każdego związku została zweryfikowana za pomocą wiarygodnego związku odniesienia i niezależnie przeanalizowana. W celu wykonania analizy wzbogacenia izotopowego, obszar chromatogramu wyekstrahowanych jonów (XIC) każdego izotopu 13C (Mn) został wyekstrahowany z [M + H] +, gdzie n jest liczbą atomów węgla związku docelowego, używanego do analizy aminokwasów lub [ MH] + jest używane do analizy anionów. Dokładność masowa XIC wynosi mniej niż pięć części na milion, a dokładność RT wynosi 0,05 minuty. Analizę wzbogacenia przeprowadza się, obliczając stosunek każdego wykrytego izotopu do sumy wszystkich izotopów odpowiadającego mu związku. Stosunki te podano jako wartości procentowe dla każdego izotopu, a wyniki wyrażono jako molowe wzbogacenie procentowe (MPE), jak opisano wcześniej (42).
Zamrożony osad neuronów zhomogenizowano w lodowatym 80% metanolu (v/v), zworteksowano i inkubowano w temperaturze -20°C przez 30 minut. Ponownie zworteksowano próbkę i mieszano w temperaturze +4°C przez 30 minut. Próbkę wirowano z prędkością 21 000 g przez 5 minut w temperaturze 4°C, a następnie zebrano powstały supernatant i wysuszono go za pomocą koncentratora SpeedVac w temperaturze 25°C w celu dalszej analizy. Jak opisano powyżej, przeprowadzono analizę LC-MS aminokwasów z sortowanych komórek. Korzystając z oprogramowania TraceFinder (wersja 4.2, Thermo Fisher Scientific), przeprowadzono analizę danych z wykorzystaniem masy monoizotopowej każdego związku. Normalizację kwantylową danych dotyczących metabolitów przeprowadzono za pomocą pakietu oprogramowania preprocessCore (57).
Przygotowanie plastra. Mysz szybko znieczulono dwutlenkiem węgla i dekapitowano. Mózg szybko wyjęto z czaszki, a następnie wypełniono lodem wibrującym nożem (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Niemcy) i pocięto na sekcje strzałkowe o grubości od 300 do 375 μm. Zimne zgazowanie węglem (95% O2 i 5% CO2). Niskie stężenie Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM bufor fosforanowo-sodowy, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukoza, 1,0 mM CaCl2 i 6,0 mM MgCl2). Dostosowano do pH 7,4 i 310–330 mOsm. Przenieś uzyskane wycinki mózgu do komory zawierającej wyższe stężenie Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM buforu fosforanu sodu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukozy, 4,0 mM CaCl2 i mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 i 310–320 mOsm). Przechowuj wycinki przez 20–30 minut, aby można je było odtworzyć przed wykonaniem pomiaru.
Rejestracja. Do wszystkich rejestracji wykorzystano stolik mikroskopowy wyposażony w stałą komorę rejestrującą i obiektyw z 20-krotnym powiększeniem wodnym (Scientifica). Domniemane komórki Purkinjego zidentyfikowano na podstawie (i) wielkości ciała, (ii) anatomicznego położenia móżdżku oraz (iii) ekspresji fluorescencyjnego genu reporterowego mtYFP. Pipeta typu patch o rezystancji końcówki od 5 do 11 megaomów jest wyciągana przez kapilarę ze szkła borokrzemianowego (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Niemcy) i pipetę poziomą Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kalifornia). Wszystkie rejestracje przeprowadzono za pomocą wzmacniacza ELC-03XS typu npi patch clamp (npi electronic GmbH, Tam, Niemcy), sterowanego przez oprogramowanie Signal (wersja 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Wielka Brytania). Eksperyment zarejestrowano z częstotliwością próbkowania 12,5 kHz. Sygnał filtrowano dwoma filtrami Bessela o krótkich przepustach i częstotliwościach odcięcia odpowiednio 1,3 i 10 kHz. Pojemność membrany i pipety jest kompensowana przez układ kompensacyjny z wykorzystaniem wzmacniacza. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono pod kontrolą kamery Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Niemcy), sterowanej oprogramowaniem Hokawo (wersja 2.8, Hamamatsu, Gerden, Niemcy).
Rutynowa konfiguracja i analiza całej komórki. Bezpośrednio przed rejestracją napełnić pipetę roztworem wewnętrznym zawierającym następujące substancje: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM glukonian potasu, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanozynotrifosforanu (GTP) (Na) i 10,0 mM fosforanu kreatyniny. pH roztworu doprowadzono do 7,25, a ciśnienie osmotyczne wynosiło 290 mOsm (sacharoza). Bezpośrednio po przyłożeniu siły 0 pA w celu rozerwania błony komórkowej zmierzono potencjał spoczynkowy błony. Rezystancję wejściową mierzy się, przykładając prądy hiperpolaryzowane o natężeniu -40, -30, -20 i -10 pA. Zmierzyć amplitudę odpowiedzi napięciowej i obliczyć rezystancję wejściową, korzystając z prawa Ohma. Spontaniczną aktywność rejestrowano w zacisku napięciowym przez 5 minut, a sPSC identyfikowano i mierzono w Igor Pro (wersja 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) przy użyciu półautomatycznego skryptu rozpoznającego. Krzywa IV i prąd w stanie ustalonym są mierzone poprzez zaciskanie baterii przy różnych potencjałach (rozpoczynając od -110 mV) i zwiększanie napięcia w krokach co 5 mV. Produkcja AP została przetestowana poprzez przyłożenie prądu depolaryzującego. Zamocuj baterię przy -70 mV, jednocześnie przykładając impuls prądu depolaryzującego. Dostosuj rozmiar kroku każdej jednostki rejestrującej oddzielnie (od 10 do 60 pA). Oblicz maksymalną częstotliwość AP, ręcznie licząc impulsy impulsowe, które powodują najwyższą częstotliwość AP. Próg AP jest analizowany przy użyciu drugiej pochodnej impulsu depolaryzującego, który jako pierwszy wyzwala jeden lub więcej AP.
Konfiguracja i analiza perforowanego łata. Przeprowadź rejestrację perforowanego łata zgodnie ze standardowymi protokołami. Użyj pipety wolnej od ATP i GTP, która nie zawiera następujących składników: 128 mM glukonianu K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA i 2 mM MgCl2, i doprowadź pH do 7,2 (za pomocą KOH). ATP i GTP są pomijane w roztworze wewnątrzkomórkowym, aby zapobiec niekontrolowanej przepuszczalności błony komórkowej. Pipetę z łatą wypełnia się roztworem wewnętrznym zawierającym amfoterycynę (około 200 do 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich), aby uzyskać perforowany zapis łaty. Amfoterycynę rozpuszczono w dimetylosulfotlenku (stężenie końcowe: 0,1 do 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Stężenie użytego DMSO nie miało istotnego wpływu na badane neurony. Podczas procesu dziurkowania stale monitorowano opór kanału (Ra), a eksperyment rozpoczęto po ustabilizowaniu się amplitudy Ra i AP (20–40 minut). Spontaniczną aktywność mierzono za pomocą cęgów napięciowych i/lub prądowych przez 2 do 5 minut. Analizę danych przeprowadzono przy użyciu Igor Pro (wersja 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (wersja 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) i GraphPad Prism (wersja 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornia). Stany Zjednoczone). W celu identyfikacji spontanicznych AP używana jest wtyczka NeuroMatic v3.0c firmy IgorPro. Automatyczna identyfikacja AP przy użyciu danego progu, który jest dostosowywany indywidualnie dla każdego rekordu. Używając interwału pików, określ częstotliwość pików z maksymalną chwilową częstotliwością pików i średnią częstotliwością pików.
Izolacja PN. Zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem, PN oczyszczono z móżdżku myszy na określonym etapie (58). W skrócie, móżdżek rozcięto i zmielono w lodowatym medium dysocjacyjnym [bez Ca2+ i Mg2+ z HBSS, uzupełnionym 20 mM glukozy, penicyliną (50 U/ml) i streptomycyną (0,05 mg/ml)], a następnie strawiono medium papainą [HBSS, uzupełniony 1-cysteiną·HCl (1 mg/ml), papainą (16 U/ml) i deoksyrybonukleazą I (DNazą I; 0,1 mg/ml)]. Poddano obróbce przez 30 minut w temperaturze 30°C. Najpierw przemyj tkanki w podłożu HBSS zawierającym śluz jaja (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) i DNazę (0,1 mg/ml) w temperaturze pokojowej, aby zapobiec trawieniu enzymatycznemu, a następnie w podłożu HBSS zawierającym 20 mM glukozy Delikatne mielenie w HBSS, penicylina (50 U/ml), streptomycyna (0,05 mg/ml) i DNaza (0,1 mg/ml) uwalniają pojedyncze komórki. Powstałą zawiesinę komórek przefiltrowano przez sito 70 μm, następnie komórki zebrano w postaci osadu przez wirowanie (1110 obr./min, 5 minut, 4°C) i zawieszono w podłożu sortującym [HBSS, uzupełnionym 20 mM glukozy, 20% surowicy płodowej bydlęcej, penicylina (50 U/ml) i streptomycyna (0,05 mg/ml)]; Ocenić żywotność komórek za pomocą jodku propidyny i dostosować gęstość komórek do 1×106 do 2×106 komórek/ml. Przed cytometrią przepływową zawiesinę przefiltrowano przez sito do komórek o średnicy porów 50 μm.
Cytometr przepływowy. Sortowanie komórek przeprowadzono w temperaturze 4°C przy użyciu aparatu FACSAria III (BD Biosciences) i oprogramowania FACSDiva (BD Biosciences, wersja 8.0.1). Zawiesinę komórek sortowano za pomocą dyszy 100 μm pod ciśnieniem 20 psi z szybkością ~2800 zdarzeń/s. Ponieważ tradycyjne kryteria bramkowania (rozmiar komórki, dyskryminacja bimodalna i charakterystyka rozpraszania) nie mogą zapewnić prawidłowej izolacji PN od innych typów komórek, strategia bramkowania została ustalona na podstawie bezpośredniego porównania intensywności i autofluorescencji YFP u myszy mitoYFP+ ​​i kontrolnej mitoYFP−. YFP jest wzbudzany poprzez napromieniowanie próbki linią laserową o długości fali 488 nm, a sygnał jest wykrywany za pomocą filtru pasmowo-przepustowego 530/30 nm. U myszy mitoYFP+ ​​względna siła genu reporterowego Rosa26-mitoYFP jest również wykorzystywana do rozróżniania fragmentów ciał neuronów i aksonów. 7-AAD jest wzbudzany żółtym laserem o długości fali 561 nm i wykrywany filtrem pasmowo-przepustowym 675/20 nm w celu wykluczenia martwych komórek. Aby jednocześnie oddzielić astrocyty, zawiesinę komórek barwiono ACSA-2-APC, a następnie próbkę napromieniowano linią laserową o długości fali 640 nm, a do detekcji sygnału użyto filtra pasmowo-przepustowego 660/20 nm.
Zebrane komórki odwirowano (1110 obr./min, 5 minut, 4°C) i przechowywano w temperaturze -80°C do momentu użycia. Myszy Mfn2cKO i ich szczenięta z miotu są klasyfikowane tego samego dnia, aby zminimalizować zmienność proceduralną. Prezentację i analizę danych FACS przeprowadzono za pomocą oprogramowania FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Jak wspomniano powyżej (59), PCR w czasie rzeczywistym służy do izolacji DNA z posortowanych neuronów w celu późniejszej kwantyfikacji mtDNA. Liniowość i czułość progową wstępnie przetestowano, przeprowadzając qPCR na różnej liczbie komórek. W skrócie, zebrano 300 PN w buforze lizy składającym się z 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 i proteinazy K (200 ng/ml) i inkubowano w temperaturze 55°C przez 120 minut. Komórki następnie inkubowano w temperaturze 95°C przez 10 minut, aby zapewnić całkowitą inaktywację proteinazy K. Używając sondy TaqMan (Thermo Fisher) specyficznej dla mt-Nd1, mtDNA zmierzono metodą półilościowej PCR w systemie 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Science, numer katalogowy Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numer katalogowy AIVI3E8) i genów 18S (Thermo Fisher Scientific, numer katalogowy Hs99999901_s1).
Przygotowanie próbki proteomu. Roztwór ogrzewano w temperaturze 95°C przez 10 minut i poddano działaniu ultradźwięków w buforze lizy [6 M chlorek guanidyny, 10 mM chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny, 10 mM chloroacetamid i 100 mM tris-Lise – zamrożone peletki neuronów w HCl]. Na urządzeniu Bioruptor (Diagenode) przez 10 minut (30 sekund impulsu / 30 sekund pauzy). Próbkę rozcieńczono w stosunku 1:10 w 20 mM tris-HCl (pH 8,0), zmieszano z 300 ng trypsyny-złota (Promega) i inkubowano przez noc w temperaturze 37°C w celu całkowitego strawienia. Drugiego dnia próbkę wirowano przy 20 000 g przez 20 minut. Supernatant rozcieńczono 0,1% kwasem mrówkowym, a roztwór odsolono za pomocą samodzielnie wykonanych końcówek StageTips. Próbkę wysuszono w urządzeniu SpeedVac (Eppendorf Concentrator Plus 5305) w temperaturze 45°C, a następnie peptyd zawieszono w 0,1% kwasie mrówkowym. Wszystkie próbki przygotowywała jednocześnie ta sama osoba. W celu analizy próbek astrocytów, 4 μg odsolonych peptydów oznaczono tandemowym znacznikiem masowym (TMT10plex, numer katalogowy 90110, Thermo Fisher Scientific) w stosunku peptydu do odczynnika TMT wynoszącym 1:20. Do znakowania TMT, 0,8 mg odczynnika TMT zawieszono w 70 μl bezwodnego ACN, a wysuszony peptyd rozpuszczono w 9 μl 0,1 M TEAB (wodorowęglanu trietyloamoniowego), do którego dodano 7 μl odczynnika TMT w ACN. Stężenie wynosiło 43,75%. Po 60 minutach inkubacji reakcję przerwano 2 μl 5% hydroksyloaminy. Znakowane peptydy zebrano, wysuszono, zawieszono w 200 μl 0,1% kwasu mrówkowego (FA), podzielono na dwie części, a następnie odsolono za pomocą samodzielnie wykonanych końcówek StageTips. Używając ultrawysokowydajnego chromatografu cieczowego UltiMate 3000 (UltiMate 3000 ultrawysokowydajny chromatograf cieczowy), jedną z dwóch połówek frakcjonowano na kolumnie chromatograficznej Acquity o wymiarach 1 mm x 150 mm wypełnionej cząsteczkami C18 o średnicy 130 Å1,7 μm (Waters, nr katalogowy SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Rozdzielenie peptydów przy szybkości przepływu 30 μl/min, rozdzielenie od 1% do 50% buforu B przez 85 minut ze stopniowym gradientem 96 minut, od 50% do 95% buforu B przez 3 minuty, następnie 8 minut dla 95% buforu B; bufor A to 5% ACN i 10 mM wodorowęglanu amonu (ABC), a bufor B to 80% ACN i 10 mM ABC. Zbieraj frakcje co 3 minuty i łącz je w dwie grupy (1 + 17, 2 + 18 itd.), a następnie susz je w wirówce próżniowej.
Analiza LC-MS/MS. Do spektrometrii masowej peptydy (numer r119.aq) rozdzielono na kolumnie analitycznej PicoFrit o średnicy wewnętrznej 75 μm i średnicy 25 cm (nowy obiektyw, numer katalogowy PF7508250) wyposażonej w medium ReproSil-Pur 120 C18-AQ o średnicy 1,9 μm (Dr. Maisch, mat.), EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Niemcy). Kolumnę utrzymywano w temperaturze 50°C. Bufory A i B to odpowiednio 0,1% kwas mrówkowy w wodzie i 0,1% kwas mrówkowy w 80% ACN. Peptydy rozdzielano z 6% do 31% buforu B przez 65 minut i z 31% do 50% buforu B przez 5 minut z gradientem 200 nl/min. Eluowane peptydy analizowano za pomocą spektrometru mas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Pomiar m/z prekursora peptydu wykonano z rozdzielczością 120 000 w zakresie od 350 do 1500 m/z. Przy znormalizowanej energii zderzenia wynoszącej 27%, najsilniejszy prekursor o stanie ładunku od 2 do 6 został wybrany do rozszczepienia wysokoenergetycznej pułapki C (HCD). Czas cyklu ustawiono na 1 s. Wartość m/z fragmentu peptydu zmierzono w pułapce jonowej, stosując najmniejszą tarczę AGC 5×104 i maksymalny czas iniekcji 86 ms. Po fragmentacji prekursor umieszczono na dynamicznej liście wykluczeń na 45 s. Peptydy znakowane TMT rozdzielono na kolumnie Acclaim PepMap o średnicy 50 cm i średnicy 75 μm (Thermo Fisher Scientific, numer katalogowy 164942), a widma migracji przeanalizowano na spektrometrze mas Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) wyposażonym w urządzenie do pomiaru jonów o asymetrycznym kształcie fali (FAIMS) o wysokim polu magnetycznym (Thermo Fisher Scientific), które pracuje przy dwóch napięciach kompensacyjnych: −50 i −70 V. Do pomiaru sygnału jonów raportowanych przez TMT użyto MS3 wybranego na podstawie prekursora synchronizacji. Rozdział peptydów przeprowadzono na EASY-nLC 1200, stosując elucję gradientem liniowym 90%, ze stężeniem buforu od 6% do 31%; bufor A zawierał 0,1% FA, bufor B 0,1% FA i 80% ACN. Kolumna analityczna pracuje w temperaturze 50°C. Użyj programu FreeStyle (wersja 1.6, Thermo Fisher Scientific), aby podzielić oryginalny plik zgodnie z napięciem kompensacji FAIMS.
Identyfikacja i kwantyfikacja białek. Wykorzystując zintegrowaną wyszukiwarkę Andromeda, oryginalne dane przeanalizowano przy użyciu oprogramowania MaxQuant w wersji 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Oprócz sekwencji rekombinazy Cre i YFP uzyskanych z Aequorea victoria, przeszukano widma fragmentów peptydowych pod kątem sekwencji kanonicznej i sekwencji izoform referencyjnego proteomu myszy (identyfikator proteomu UP000000589, pobrany z UniProt w maju 2017 r.). Utlenianie metioniny i acetylację N-końcową białka ustawiono jako modyfikacje zmienne; karbamoilometylacja cysteiny ustawiono jako modyfikacje stałe. Parametry trawienia ustawiono na „specyficzność” i „trypsyna/P”. Minimalna liczba peptydów i peptydów razor użytych do identyfikacji białka wynosi 1; minimalna liczba unikalnych peptydów wynosi 0. W warunkach dopasowania mapy peptydowej wskaźnik identyfikacji białka wyniósł 0,01. Opcja „Drugi peptyd” jest włączona. Użyj opcji „Dopasuj między przebiegami”, aby przenieść pomyślne identyfikacje między różnymi oryginalnymi plikami. Użyj minimalnego współczynnika LFQ o wartości 1 do kwantyfikacji bez znaczników (LFQ) (60). Intensywność LFQ jest filtrowana dla co najmniej dwóch prawidłowych wartości w co najmniej jednej grupie genotypowej w każdym punkcie czasowym i jest ekstrapolowana z rozkładu normalnego o szerokości 0,3 i ruchu w dół 1,8. Użyj platformy obliczeniowej Perseus (https://maxquant.net/perseus/) i R (https://r-project.org/) do analizy wyników LFQ. Dwukierunkowy test t o umiarkowanej czułości z pakietu oprogramowania Limma został użyty do analizy ekspresji różnicowej (61). Eksploracyjna analiza danych została przeprowadzona przy użyciu ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally i pheatmap. Dane proteomiczne oparte na TMT zostały przeanalizowane przy użyciu MaxQuant w wersji 1.6.10.43. Wyszukaj surowe dane proteomiczne z bazy danych proteomiki człowieka UniProt, która została pobrana we wrześniu 2018 roku. Analiza obejmuje współczynnik korekcji czystości izotopowej podany przez producenta. Do analizy ekspresji różnicowej użyj programu Limma w R. Oryginalne dane, wyniki przeszukiwania bazy danych oraz przepływ pracy i wyniki analizy danych są przechowywane w sojuszu ProteomeXchange za pośrednictwem repozytorium partnerów PRIDE z identyfikatorem zestawu danych PXD019690.
Adnotacje funkcjonalne wzbogacają analizę. Narzędzie Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) zostało użyte do określenia bogactwa terminów adnotacji funkcjonalnych zestawu danych po 8 tygodniach (Rysunek 1). Krótko mówiąc, ilościowa lista białek uzyskana z analizy danych LC-MS/MS (tandemowa spektrometria mas) jest używana z następującymi kryteriami filtrowania: Mus musculus jest wybrany jako gatunek i tło, a kategoria pokazuje wartość P skorygowaną przez Benjaminiego dla wzbogacenia 0,05 lub niższego, które jest uważane za istotne. Na tym wykresie pokazano pięć największych kategorii nadmiarowych w każdym klastrze na podstawie skorygowanej wartości P. Za pomocą wielokrotnego testu t, z wykorzystaniem dwuetapowego liniowego programu wzmacniającego Benjaminiego, Kriegera i Yekutieli (Q = 5%), przeprowadzono analizę ekspresji białek w czasie dla ważnych kandydatów zidentyfikowanych w każdej kategorii, a każdy wiersz analizowano oddzielnie. Nie ma potrzeby stosowania spójnego odchylenia standardowego (SD).
Aby porównać wyniki tego badania z opublikowanymi bazami danych i wygenerować diagram Venna przedstawiony na rysunku 1, połączyliśmy ilościową listę białek z adnotacjami MitoCarta 2.0 (24). Do wygenerowania diagramu skorzystaj z narzędzia online „Draw Venn Diagram” (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Szczegółowe informacje na temat procedur statystycznych stosowanych w analizie proteomicznej znajdują się w odpowiedniej sekcji „Materiały i metody”. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich pozostałych eksperymentów znajdują się w odpowiedniej legendzie. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie dane wyrażono jako średnią ± SEM, a wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 8.1.2.
Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć na stronie http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Niniejszy artykuł jest udostępniany w otwartym dostępie na warunkach licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne, która zezwala na używanie, rozpowszechnianie i reprodukcję w dowolnym medium, pod warunkiem, że ostateczne wykorzystanie nie ma na celu osiągnięcia korzyści komercyjnych, a założeniem jest, że oryginalne dzieło jest poprawne. Źródło.
Uwaga: Prosimy o podanie adresu e-mail tylko po to, aby osoba, którą polecasz na stronie, wiedziała, że ​​chcesz, aby otrzymała wiadomość e-mail i że nie jest to spam. Nie będziemy przechwytywać żadnych adresów e-mail.
To pytanie służy do sprawdzenia, czy jesteś gościem, i zapobiegania automatycznemu wysyłaniu spamu.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larsona
Analiza proteomiczna dysfunkcyjnych neuronów wykazała, że ​​w celu przeciwdziałania neurodegeneracji aktywowane są programy metaboliczne.
E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larsona
Analiza proteomiczna dysfunkcyjnych neuronów wykazała, że ​​w celu przeciwdziałania neurodegeneracji aktywowane są programy metaboliczne.
©2020 Amerykańskie Stowarzyszenie na rzecz Postępu Nauki. wszelkie prawa zastrzeżone. AAAS jest partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.