Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Kwas propionowy (PPA) jest stosowany do badania roli dysfunkcji mitochondriów w zaburzeniach neurorozwojowych, takich jak zaburzenia ze spektrum autyzmu. Wiadomo, że PPA zaburza biogenezę, metabolizm i obrót mitochondrialny. Jednak wpływ PPA na dynamikę mitochondriów, podział i fuzję pozostaje problematyczny ze względu na złożoną naturę czasową tych mechanizmów. W niniejszym badaniu wykorzystano uzupełniające techniki obrazowania ilościowego do zbadania wpływu PPA na ultrastrukturę, morfologię i dynamikę mitochondriów w neuronopodobnych komórkach SH-SY5Y. PPA (5 mM) spowodował istotne zmniejszenie powierzchni mitochondriów (p < 0,01), średnicy i obwodu Fereta (p < 0,05) oraz powierzchni 2 (p < 0,01). Analiza z użyciem lokalizatora zdarzeń mitochondrialnych wykazała istotny wzrost (p < 0,05) zdarzeń podziałów i fuzji, co pozwoliło na utrzymanie integralności sieci mitochondrialnej w warunkach stresu. Ponadto ekspresja mRNA dla cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) i OPA1 (p < 0,05) uległa istotnemu obniżeniu. 01). Ilustruje to przebudowę morfologii, biogenezy i dynamiki mitochondriów w celu utrzymania ich funkcji w warunkach stresu. Nasze dane dostarczają nowych informacji na temat wpływu PPA na dynamikę mitochondriów i podkreślają przydatność technik obrazowania w badaniu złożonych mechanizmów regulacyjnych zaangażowanych w reakcje mitochondrialne na stres.
Mitochondria są integralnymi uczestnikami wielu funkcji komórkowych, wykraczających poza ich typowe role w produkcji energii i biosyntezie. Metabolizm mitochondrialny jest kluczowym regulatorem sygnalizacji wapniowej, homeostazy metabolicznej i redoks, sygnalizacji zapalnej, modyfikacji epigenetycznych, proliferacji, różnicowania i programowanej śmierci komórek1. W szczególności metabolizm mitochondrialny ma kluczowe znaczenie dla rozwoju, przeżycia i funkcjonowania neuronów oraz jest szeroko powiązany z różnymi objawami neuropatologii2,3,4.
W ciągu ostatniej dekady status metaboliczny stał się centralnym regulatorem neurogenezy, różnicowania, dojrzewania i plastyczności5,6. Ostatnio morfologia i dynamika mitochondriów stały się szczególnie ważnymi elementami mitozy – dynamicznego procesu, który utrzymuje pulę zdrowych mitochondriów w komórkach. Dynamika mitochondriów jest regulowana przez złożone, współzależne szlaki, od biogenezy i bioenergetyki mitochondriów po podział, fuzję, transport i klirens mitochondriów7,8. Zaburzenie któregokolwiek z tych mechanizmów integracyjnych upośledza utrzymanie zdrowych sieci mitochondrialnych i ma głębokie konsekwencje funkcjonalne dla rozwoju neurologicznego9,10. Rzeczywiście, dysregulacja dynamiki mitochondriów jest obserwowana w wielu zaburzeniach psychicznych, neurodegeneracyjnych i neurorozwojowych, w tym w zaburzeniach ze spektrum autyzmu (ASD)11,12.
ASD to heterogeniczne zaburzenie neurorozwojowe o złożonej architekturze genetycznej i epigenetycznej. Dziedziczność ASD jest bezdyskusyjna, ale podstawowa etiologia molekularna pozostaje słabo poznana. Gromadzenie danych z modeli przedklinicznych, badań klinicznych i wielowymiarowych zbiorów danych molekularnych dostarcza coraz więcej dowodów na dysfunkcję mitochondriów w ASD13,14. Wcześniej przeprowadziliśmy badanie przesiewowe metylacji DNA w całym genomie w kohorcie pacjentów z ASD i zidentyfikowaliśmy geny o zróżnicowanej metylacji skupione wzdłuż mitochondrialnych szlaków metabolicznych15. Następnie opisaliśmy zróżnicowaną metylację centralnych regulatorów biogenezy i dynamiki mitochondriów, co wiązało się ze zwiększoną liczbą kopii mtDNA i zmienionym profilem metabolicznym moczu w ASD16. Nasze dane dostarczają coraz więcej dowodów na to, że dynamika i homeostaza mitochondriów odgrywają kluczową rolę w patofizjologii ASD. Dlatego też pogłębienie mechanistycznego zrozumienia zależności między dynamiką mitochondriów, ich morfologią i funkcją stanowi kluczowy cel prowadzonych obecnie badań nad chorobami neurologicznymi charakteryzującymi się wtórną dysfunkcją mitochondriów.
Techniki molekularne są często wykorzystywane do badania roli określonych genów w mitochondrialnych reakcjach stresowych. Jednak podejście to może być ograniczone przez wieloaspektowy i czasowy charakter mechanizmów kontroli mitozy. Ponadto, zróżnicowana ekspresja genów mitochondrialnych jest pośrednim wskaźnikiem zmian funkcjonalnych, zwłaszcza że zazwyczaj analizuje się jedynie ograniczoną liczbę genów. W związku z tym zaproponowano bardziej bezpośrednie metody badania funkcji mitochondriów i bioenergetyki17. Morfologia mitochondriów jest ściśle związana z dynamiką mitochondriów. Kształt, łączność i struktura mitochondriów mają kluczowe znaczenie dla produkcji energii oraz przetrwania mitochondriów i komórek5,18. Co więcej, różne elementy mitozy koncentrują się na zmianach w morfologii mitochondriów, co może służyć jako użyteczne punkty końcowe dysfunkcji mitochondriów i stanowić podstawę do dalszych badań mechanistycznych.
Morfologię mitochondriów można bezpośrednio obserwować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), co pozwala na szczegółowe badanie ultrastruktury komórkowej. TEM bezpośrednio obrazuje morfologię, kształt i strukturę grzebieni mitochondrialnych w rozdzielczości pojedynczych mitochondriów, zamiast polegać wyłącznie na transkrypcji genów, ekspresji białek lub parametrach funkcjonalnych mitochondriów w populacjach komórkowych17,19,20. Ponadto TEM ułatwia badanie interakcji między mitochondriami a innymi organellami, takimi jak siateczka śródplazmatyczna i autofagosomy, które odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu i homeostazie mitochondriów21,22. TEM stanowi zatem dobry punkt wyjścia do badania dysfunkcji mitochondriów przed skupieniem się na konkretnych szlakach lub genach. W miarę jak funkcja mitochondriów staje się coraz istotniejsza dla neuropatologii, istnieje wyraźna potrzeba bezpośredniego i ilościowego badania morfologii i dynamiki mitochondriów w neuronalnych modelach in vitro.
W niniejszym artykule badamy dynamikę mitochondriów w neuronalnym modelu dysfunkcji mitochondriów w zaburzeniach ze spektrum autyzmu. Wcześniej opisywaliśmy różnicową metylację karboksylazy propionylo-CoA beta (PCCB) w ASD15, podjednostki mitochondrialnego enzymu karboksylazy propionylo-CoA PCC. Wiadomo, że dysregulacja PCC powoduje toksyczną akumulację pochodnych propionylu, w tym kwasu propionowego (PPA)23,24,25. Wykazano, że PPA zaburza metabolizm neuronów i zmienia zachowanie in vivo i jest uznanym modelem zwierzęcym do badania mechanizmów neurorozwojowych związanych z ASD26,27,28. Ponadto doniesiono, że PPA zaburza potencjał błony mitochondrialnej, biogenezę i oddychanie in vitro i jest szeroko stosowana do modelowania dysfunkcji mitochondriów w neuronach29,30. Jednak wpływ dysfunkcji mitochondriów indukowanej przez PPA na morfologię i dynamikę mitochondriów pozostaje słabo poznany.
W niniejszym badaniu wykorzystano uzupełniające się techniki obrazowania do ilościowego określenia wpływu PPA na morfologię, dynamikę i funkcję mitochondriów w komórkach SH-SY5Y. Po pierwsze, opracowaliśmy metodę TEM do wizualizacji zmian w morfologii i ultrastrukturze mitochondriów17,31,32. Biorąc pod uwagę dynamiczną naturę mitochondriów33, wykorzystaliśmy również analizę lokalizatora zdarzeń mitochondrialnych (MEL) do ilościowego określenia zmian w równowadze między rozszczepieniem i fuzją, liczbą i objętością mitochondriów pod wpływem stresu PPA. Na koniec zbadaliśmy, czy morfologia i dynamika mitochondriów są powiązane ze zmianami w ekspresji genów zaangażowanych w biogenezę, rozszczepienie i fuzję. Podsumowując, nasze dane ilustrują wyzwanie, jakim jest wyjaśnienie złożoności mechanizmów regulujących dynamikę mitochondriów. Podkreślamy użyteczność TEM w badaniu morfologii mitochondriów jako mierzalnego, zbieżnego punktu końcowego mitozy w komórkach SH-SY5Y. Ponadto podkreślamy, że dane TEM dostarczają najbogatszych informacji w połączeniu z technikami obrazowania, które rejestrują również dynamiczne zdarzenia w odpowiedzi na stres metaboliczny. Dalsza charakterystyka molekularnych mechanizmów regulacyjnych wspierających mitozę komórek neuronalnych może dostarczyć istotnych informacji na temat mitochondrialnego komponentu układu nerwowego i chorób neurodegeneracyjnych.
Aby wywołać stres mitochondrialny, komórki SH-SY5Y poddano działaniu PPA przy użyciu 3 mM i 5 mM propionianu sodu (NaP). Przed TEM próbki poddano kriogenicznemu przygotowaniu próbek poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i zamrażanie (ryc. 1a). Opracowaliśmy zautomatyzowany proces analizy obrazu mitochondrialnego w celu pomiaru ośmiu parametrów morfologicznych populacji mitochondrialnych w trzech powtórzeniach biologicznych. Stwierdziliśmy, że leczenie PPA istotnie zmieniło cztery parametry: pole powierzchni 2, pole powierzchni, obwód i średnicę Fereta (ryc. 1b–e). Pole powierzchni 2 zmniejszyło się istotnie zarówno po zastosowaniu 3 mM, jak i 5 mM PPA (odpowiednio p = 0,0183 i p = 0,002) (ryc. 1b), podczas gdy pole powierzchni (p = 0,003), obwód (p = 0,0106) i średnica Fereta uległy istotnemu zmniejszeniu. W grupie leczonej 5 mM zaobserwowano istotną redukcję (p = 0,0172) w porównaniu z grupą kontrolną (Ryc. 1c–e). Istotne zmniejszenie powierzchni i obwodu wykazało, że komórki leczone 5 mM PPA miały mniejsze, bardziej zaokrąglone mitochondria i że te mitochondria były mniej wydłużone niż w komórkach kontrolnych. Jest to również zgodne ze znacznym zmniejszeniem średnicy Fereta, niezależnego parametru wskazującego na zmniejszenie największej odległości między krawędziami cząstek. Zaobserwowano zmiany w ultrastrukturze grzebieni: grzebienie stały się mniej widoczne pod wpływem stresu PPA (Ryc. 1a, panel B). Jednak nie wszystkie obrazy wyraźnie odzwierciedlały ultrastrukturę grzebieni, dlatego nie przeprowadzono ilościowej analizy tych zmian. Dane TEM mogą odzwierciedlać trzy możliwe scenariusze: (1) PPA nasila podział lub hamuje fuzję, powodując zmniejszenie rozmiaru istniejących mitochondriów; (2) wzmożona biogeneza tworzy nowe, mniejsze mitochondria lub (3) indukuje oba mechanizmy jednocześnie. Chociaż tych stanów nie da się odróżnić za pomocą TEM, istotne zmiany morfologiczne wskazują na zmiany homeostazy i dynamiki mitochondriów pod wpływem stresu PPA. Następnie zbadaliśmy dodatkowe parametry, aby lepiej scharakteryzować tę dynamikę i potencjalne mechanizmy leżące u jej podstaw.
Kwas propionowy (PPA) remodeluje morfologię mitochondriów. (a) Reprezentatywne obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) pokazujące, że rozmiar mitochondriów zmniejsza się, a mitochondria stają się mniejsze i bardziej okrągłe wraz ze wzrostem stężenia PPA; odpowiednio 0 mM (nieleczone), 3 mM i 5 mM. Czerwone strzałki wskazują mitochondria. (b–e) Komórki SH-SY5Y leczone PPA przez 24 godziny przygotowano do TEM, a wyniki przeanalizowano za pomocą oprogramowania Fiji/ImageJ. Cztery z ośmiu parametrów wykazały istotne różnice między komórkami kontrolnymi (nieleczone, 0 mM PPA) a komórkami leczonymi (3 mM i 5 mM PPA). (b) Region 2, (c) Pole powierzchni, (d) Obwód, (e) Średnica Fereta. Do określenia istotnych różnic zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (kontrola vs. leczone) oraz test wielokrotnych porównań Dunnetta (p < 0,05). Punkty danych reprezentują średnią wartość mitochondrialną dla każdej pojedynczej komórki, a słupki błędów reprezentują średnią ± SEM. Przedstawione dane reprezentują n = 3, co najmniej 24 komórki na powtórzenie; przeanalizowano łącznie 266 obrazów; * oznacza p < 0,05, ** oznacza p < 0,01.
Aby lepiej scharakteryzować reakcję dynamiki mitochondriów na PPA, barwiliśmy mitochondria estrem etylowym tetrametylorodaminy (TMRE) i wykorzystaliśmy mikroskopię poklatkową oraz analizę MEL do lokalizacji i ilościowego określenia mitochondriów po 24 godzinach w stężeniu 3 i 5 mM PPA. Postępowanie w przypadku rozszczepień i fuzji. ​​(Ryc. 2a). Po analizie MEL, mitochondria poddano dalszej analizie w celu określenia liczby struktur mitochondrialnych i ich średniej objętości. Zaobserwowaliśmy niewielki, ale istotny wzrost liczby zdarzeń rozszczepienia występujących przy stężeniu 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] w porównaniu do rozszczepienia [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] i fuzji [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] i fuzji [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] zdarzenia te były istotnie zwiększone przy stężeniu 5 mM w porównaniu do grupy kontrolnej (Rys. 3b). Liczba mitochondriów istotnie wzrosła zarówno przy stężeniu 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], jak i 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Rys. 3c), podczas gdy średnia objętość każdej struktury mitochondrialnej pozostała niezmieniona (Rys. 3c). 3d). Podsumowując, sugeruje to, że przebudowa dynamiki mitochondriów stanowi reakcję kompensacyjną, która skutecznie utrzymuje integralność sieci mitochondrialnej. Wzrost liczby rozszczepień przy stężeniu 3 mM PPA sugeruje, że wzrost liczby mitochondriów jest częściowo spowodowany rozszczepieniem mitochondriów, ale biorąc pod uwagę, że średnia objętość mitochondriów pozostaje zasadniczo niezmieniona, nie można wykluczyć biogenezy jako dodatkowej reakcji kompensacyjnej. Dane te są jednak zgodne z mniejszymi, okrągłymi strukturami mitochondrialnymi obserwowanymi w mikroskopie TEM i również wykazują istotne zmiany w dynamice mitochondriów indukowane przez PPA.
Kwas propionowy (PPA) indukuje dynamiczną przebudowę mitochondriów, aby utrzymać integralność sieci. Komórki SH-SY5Y hodowano, traktowano 3 i 5 mM PPA przez 24 godziny, barwiono TMRE i Hoechst 33342, a następnie analizowano metodą MEL. (a) Reprezentatywne obrazy mikroskopii poklatkowej przedstawiające kolorowe i binarne projekcje maksymalnej intensywności w czasie 2 (t2) dla każdego warunku. Wybrane obszary oznaczone na każdym obrazie binarnym są wzmocnione i wyświetlane w 3D w trzech różnych przedziałach czasowych (t1-t3), aby zilustrować dynamikę w czasie; zdarzenia fuzji są zaznaczone na zielono; zdarzenia rozszczepienia są zaznaczone na zielono. Wyświetlane na czerwono. (b) Średnia liczba zdarzeń dynamicznych w każdym warunku. (c) Średnia liczba struktur mitochondrialnych na komórkę. (d) Średnia objętość (µm³) każdej struktury mitochondrialnej na komórkę. Przedstawione dane są reprezentatywne dla n = 15 komórek w każdej grupie leczonej. Przedstawione słupki błędów przedstawiają średnią ± SEM, podziałka = 10 μm, * p < 0,05.
Kwas propionowy (PPA) powoduje supresję transkrypcyjną genów związanych z dynamiką mitochondriów. Komórki SH-SY5Y traktowano 3 i 5 mM PPA przez 24 godziny. Względną kwantyfikację genów przeprowadzono przy użyciu RT-qPCR i znormalizowano do B2M. Geny biogenezy mitochondriów (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 i (d) NFE2L2. Geny fuzji i podziału mitochondriów (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 i (i) DRP1. Istotne różnice (p < 0,05) sprawdzono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (kontrola vs. leczenie) i testu wielokrotnych porównań Dunnetta: * oznacza p < 0,05, ** oznacza p < 0,01, a **** oznacza p < 0,0001. Słupki przedstawiają średnią ekspresję ± SEM. Przedstawione dane dotyczą n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) i n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) powtórzeń biologicznych.
Dane z analiz TEM i MEL łącznie wskazują, że PPA zmienia morfologię i dynamikę mitochondriów. Jednak te techniki obrazowania nie dostarczają wglądu w mechanizmy leżące u podstaw tych procesów. Zbadaliśmy zatem ekspresję mRNA dziewięciu kluczowych regulatorów dynamiki mitochondriów, biogenezy i mitozy w odpowiedzi na leczenie PPA. Oznaczyliśmy ilościowo onkogen szpiczaka komórkowego (cMYC), jądrowy czynnik oddechowy (NRF1), mitochondrialny czynnik transkrypcyjny 1 (TFAM), czynnik transkrypcyjny podobny do NFE2 BZIP (NFE2L2), białko podobne do gastryny 2 (STOML2), zanik nerwu wzrokowego 1 (OPA1), mitofuzynę 1 (MFN1), mitofuzynę 2 (MFN2) i białko związane z dynaminą 1 (DRP1) po 24 godzinach leczenia 3 mM i 5 mM PPA. Zaobserwowaliśmy leczenie 3 mM (odpowiednio p = 0,0053, p = 0,0415 i p < 0,0001) i 5 mM (odpowiednio p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA. (Rys. 3a–c). Spadek ekspresji mRNA był zależny od dawki: ekspresja cMYC, NRF1 i TFAM zmniejszyła się odpowiednio o 5,7, 2,6 i 1,9 razy przy stężeniu 3 mM oraz o 11,2, 3 i 2,2 razy przy stężeniu 5 mM. Natomiast centralny gen biogenezy redoks NFE2L2 nie uległ zmianie przy żadnym stężeniu PPA, chociaż zaobserwowano podobny, zależny od dawki trend zmniejszenia ekspresji (Rys. 3d).
Zbadaliśmy również ekspresję klasycznych genów zaangażowanych w regulację rozszczepienia i fuzji. ​​Uważa się, że STOML2 bierze udział w fuzji, mitofagii i biogenezie, a jego ekspresja była istotnie zmniejszona (p < 0,0001) przez 3 mM (2,4-krotna zmiana) i 5 mM (2,8-krotna zmiana) PPA (Rys. 1). 3d). Podobnie, ekspresja genu fuzyjnego OPA1 była zmniejszona przy 3 mM (1,6-krotna zmiana) i 5 mM (1,9-krotna zmiana) PPA (odpowiednio p = 0,006 i p = 0,0024) (Rys. 3f). Jednakże nie znaleźliśmy istotnych różnic w ekspresji genów fuzyjnych MFN1, MFN2 lub genu rozszczepienia DRP1 pod wpływem 24-godzinnego stresu PPA (Rys. 3g–i). Ponadto stwierdziliśmy, że poziomy czterech białek fuzyjnych i rozszczepialnych (OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1) nie zmieniały się w tych samych warunkach (ryc. 4a–d). Należy zauważyć, że dane te odzwierciedlają pojedynczy punkt w czasie i mogą nie odzwierciedlać zmian w ekspresji lub poziomie aktywności białek we wczesnych stadiach stresu PPA. Jednakże istotne zmniejszenie ekspresji cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 i OPA1 wskazuje na istotną dysregulację transkrypcyjną metabolizmu, biogenezy i dynamiki mitochondriów. Ponadto dane te podkreślają użyteczność technik obrazowania w bezpośrednim badaniu zmian stanu końcowego w funkcji mitochondriów.
Poziomy białka czynnika fuzji i rozszczepienia nie uległy zmianie po podaniu kwasu propionowego (PPA). Komórki SH-SY5Y poddano działaniu 3 i 5 mM PPA przez 24 godziny. Poziomy białka oznaczono ilościowo metodą Western blot, a poziomy ekspresji znormalizowano do stężenia białka całkowitego. Przedstawiono średnią ekspresję białka oraz reprezentatywne wyniki Western blot dla białka docelowego i całkowitego. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Słupki oznaczają średnią ± SEM, a przedstawione dane są reprezentatywne dla n = 3 powtórzeń biologicznych. Wielokrotne porównania (p < 0,05) przeprowadzono z użyciem jednokierunkowej analizy wariancji i testu Dunnetta. Oryginalny żel i blot przedstawiono na rysunku S1.
Dysfunkcja mitochondriów jest związana z chorobami wielonarządowymi, od chorób metabolicznych, sercowo-naczyniowych i mięśniowych po choroby neurologiczne1,10. Wiele chorób neurodegeneracyjnych i neurodegeneracyjnych jest związanych z dysfunkcją mitochondriów, co podkreśla znaczenie tych organelli w całym okresie życia mózgu. Choroby te obejmują chorobę Parkinsona, chorobę Alzheimera i ASD3,4,18. Jednak dostęp do tkanki mózgowej w celu badania tych chorób jest utrudniony, zwłaszcza na poziomie mechanistycznym, co sprawia, że ​​systemy modeli komórkowych stanowią niezbędną alternatywę. W niniejszym badaniu wykorzystano system modeli komórkowych z komórkami SH-SY5Y poddanymi działaniu PPA, aby odtworzyć dysfunkcję mitochondriów obserwowaną w chorobach neuronalnych, w szczególności w zaburzeniach ze spektrum autyzmu. Wykorzystanie tego modelu PPA do badania dynamiki mitochondriów w neuronach może dostarczyć informacji na temat etiologii ASD.
Zbadaliśmy możliwość wykorzystania TEM do obserwacji zmian w morfologii mitochondriów. Należy zauważyć, że TEM musi być stosowany prawidłowo, aby zmaksymalizować jego skuteczność. Przygotowanie preparatów kriogenicznych pozwala na lepsze zachowanie struktur neuronalnych poprzez jednoczesne utrwalenie składników komórkowych i ograniczenie powstawania artefaktów34. Zgodnie z tym zaobserwowaliśmy, że neuronopodobne komórki SH-SY5Y miały nienaruszone organelle subkomórkowe i wydłużone mitochondria (ryc. 1a). Podkreśla to użyteczność technik kriogenicznej preparacji w badaniu morfologii mitochondriów w modelach komórek neuronalnych. Chociaż pomiary ilościowe mają kluczowe znaczenie dla obiektywnej analizy danych TEM, nadal nie ma konsensusu co do tego, jakie konkretne parametry powinny być mierzone w celu potwierdzenia zmian morfologicznych mitochondriów. Na podstawie dużej liczby badań, w których ilościowo badano morfologię mitochondriów17,31,32, opracowaliśmy zautomatyzowany proces analizy obrazu mitochondrialnego, który mierzy osiem parametrów morfologicznych, a mianowicie: pole powierzchni, pole powierzchni2, współczynnik kształtu, obwód, kołowość, stopień, średnicę Fereta i okrągłość.
Wśród nich, PPA znacząco zmniejszyło pole powierzchni 2, pole powierzchni, obwód i średnicę Fereta (ryc. 1b–e). Wykazało to, że mitochondria stały się mniejsze i bardziej zaokrąglone, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami wykazującymi zmniejszenie powierzchni mitochondrialnej po 72 godzinach stresu mitochondrialnego wywołanego PPA30. Te cechy morfologiczne mogą wskazywać na podział mitochondriów, proces niezbędny do sekwestracji uszkodzonych składników sieci mitochondrialnej i promowania ich degradacji poprzez mitofagię35,36,37. Z drugiej strony, zmniejszenie średniej wielkości mitochondriów może być związane ze zwiększoną biogenezą, która prowadzi do powstawania małych, nowo powstających mitochondriów. Zwiększony podział lub biogeneza stanowi odpowiedź kompensacyjną mającą na celu utrzymanie mitozy w obliczu stresu mitochondrialnego. Nie można jednak wykluczyć zmniejszonego wzrostu mitochondriów, upośledzonej fuzji lub innych stanów.
Chociaż obrazy o wysokiej rozdzielczości tworzone przez TEM umożliwiają określenie cech morfologicznych na poziomie pojedynczych mitochondriów, metoda ta generuje dwuwymiarowe migawki w jednym punkcie czasowym. Aby zbadać dynamiczne odpowiedzi na stres metaboliczny, barwiliśmy mitochondria za pomocą TMRE i użyliśmy mikroskopii poklatkowej z analizą MEL, która umożliwia wysokoprzepustową wizualizację 3D zmian w sieci mitochondrialnej w czasie33,38. Zaobserwowaliśmy subtelne, ale istotne zmiany w dynamice mitochondriów pod wpływem stresu PPA (rys. 2). Przy stężeniu 3 mM liczba zdarzeń rozszczepienia znacznie wzrosła, podczas gdy liczba zdarzeń fuzji pozostała taka sama jak w próbie kontrolnej. Wzrost liczby zarówno zdarzeń rozszczepienia, jak i fuzji zaobserwowano przy stężeniu 5 mM PPA, ale zmiany te były w przybliżeniu proporcjonalne, co sugeruje, że kinetyka rozszczepienia i fuzji osiąga równowagę przy wyższych stężeniach (rys. 2b). Średnia objętość mitochondriów pozostała niezmieniona zarówno przy stężeniu 3, jak i 5 mM PPA, co wskazuje na zachowanie integralności sieci mitochondrialnej (ryc. 2d). Odzwierciedla to zdolność dynamicznych sieci mitochondrialnych do reagowania na łagodny stres metaboliczny i skutecznego utrzymywania homeostazy bez powodowania fragmentacji sieci. Przy stężeniu 3 mM PPA wzrost rozszczepienia jest wystarczający, aby promować przejście do nowej równowagi, ale w odpowiedzi na stres wywołany wyższym stężeniem PPA konieczna jest głębsza przebudowa kinetyczna.
Liczba mitochondriów wzrosła przy obu stężeniach stresu PPA, ale średnia objętość mitochondriów nie zmieniła się istotnie (ryc. 2c). Może to być spowodowane wzmożoną biogenezą lub wzmożonym podziałem; jednak przy braku istotnego spadku średniej objętości mitochondriów bardziej prawdopodobne jest, że biosynteza wzrasta. Dane na ryc. 2 potwierdzają jednak istnienie dwóch mechanizmów kompensacyjnych: wzrostu liczby zdarzeń rozszczepienia, zgodnego ze wzmożoną ekspresją rozszczepienia mitochondriów, oraz wzrostu liczby zdarzeń, zgodnego z biogenezą mitochondriów. Ostatecznie dynamiczna kompensacja łagodnego stresu może składać się z jednoczesnych procesów obejmujących rozszczepienie, fuzję, biogenezę i mitofagię. Chociaż poprzedni autorzy wykazali, że PPA nasila mitozę30,39 i mitofagię29, my dostarczamy dowodów na przebudowę dynamiki rozszczepienia i fuzji mitochondriów w odpowiedzi na PPA. Dane te potwierdzają zmiany morfologiczne zaobserwowane za pomocą TEM i dostarczają dalszych informacji na temat mechanizmów związanych z dysfunkcją mitochondriów wywołaną przez PPA.
Ponieważ ani analiza TEM, ani analiza MEL nie dostarczyły bezpośrednich dowodów na mechanizmy regulacji genów leżące u podstaw obserwowanych zmian morfologicznych, zbadaliśmy ekspresję RNA genów zaangażowanych w metabolizm, biogenezę i dynamikę mitochondriów. Protoonkogen cMYC jest czynnikiem transkrypcyjnym zaangażowanym w regulację mitochondriów, glikolizę oraz metabolizm aminokwasów i kwasów tłuszczowych40. Ponadto wiadomo, że cMYC reguluje ekspresję prawie 600 genów mitochondrialnych zaangażowanych w transkrypcję, translację i kompleksowanie mitochondriów, w tym NRF1 i TFAM41. NRF1 i TFAM to dwa centralne regulatory mitozy, działające poniżej PGC-1α, aktywując replikację mtDNA. Szlak ten jest aktywowany przez sygnalizację cAMP i AMPK i jest wrażliwy na wydatek energetyczny i stres metaboliczny. Zbadaliśmy również NFE2L2, regulator redoks biogenezy mitochondriów, aby określić, czy wpływ PPA może być mediowany przez stres oksydacyjny.
Chociaż ekspresja NFE2L2 pozostała niezmieniona, zaobserwowaliśmy stały, zależny od dawki spadek ekspresji cMYC, NRF1 i TFAM po 24 godzinach leczenia 3 mM i 5 mM PPA (ryc. 3a–c). Zmniejszenie ekspresji cMYC było wcześniej zgłaszane jako odpowiedź na stres mitochondrialny42 i odwrotnie, zmniejszenie ekspresji cMYC może powodować dysfunkcję mitochondriów poprzez przebudowę metabolizmu mitochondrialnego, łączności sieciowej i polaryzacji błony komórkowej43. Co ciekawe, cMYC bierze również udział w regulacji podziału i fuzji mitochondriów42,43 i wiadomo, że zwiększa fosforylację DRP1 i lokalizację mitochondriów podczas podziału komórki44, a także pośredniczy w przebudowie morfologicznej mitochondriów w neuronalnych komórkach macierzystych45. Rzeczywiście, fibroblasty z niedoborem cMYC wykazują zmniejszony rozmiar mitochondriów, co jest zgodne ze zmianami indukowanymi przez stres PPA43. Dane te ilustrują interesującą, choć jak dotąd niejasną zależność między cMYC a dynamiką mitochondriów, co stanowi interesujący cel przyszłych badań nad przebudową wywołaną stresem PPA.
Redukcja NRF1 i TFAM jest zgodna z rolą cMYC jako ważnego aktywatora transkrypcyjnego. Dane te są również zgodne z wcześniejszymi badaniami na ludzkich komórkach raka jelita grubego, które wykazały, że PPA zmniejszyło ekspresję mRNA NRF1 po 22 godzinach, co było związane z wyczerpaniem ATP i zwiększeniem ROS46. Ci autorzy donieśli również, że ekspresja TFAM wzrosła po 8,5 godzinie, ale powróciła do poziomów wyjściowych po 22 godzinach. Z kolei Kim i in. (2019) wykazali, że ekspresja mRNA TFAM była istotnie zmniejszona po 4 godzinach stresu PPA w komórkach SH-SY5Y; jednak po 72 godzinach ekspresja białka TFAM była istotnie zwiększona, a liczba kopii mtDNA istotnie wzrosła. Zatem zmniejszenie liczby genów biogenezy mitochondriów, które obserwowaliśmy po 24 godzinach, nie wyklucza możliwości, że wzrost liczby mitochondriów jest związany z aktywacją biogenezy we wcześniejszych punktach czasowych. Poprzednie badania wykazały, że PPA znacząco zwiększa ekspresję mRNA i białka PGC-1α w komórkach SH-SY5Y po ​​4 godzinach i 30 minutach, podczas gdy kwas propionowy nasila biogenezę mitochondriów w hepatocytach cielęcych poprzez PGC-1α po 12 godzinach i 39 minutach. Co ciekawe, PGC-1α nie tylko bezpośrednio reguluje transkrypcję NRF1 i TFAM, ale wykazano również, że reguluje aktywność MFN2 i DRP1 poprzez regulację rozszczepienia i fuzji47. Podsumowując, podkreśla to ścisłe powiązanie mechanizmów regulujących kompensacyjne reakcje mitochondriów indukowane przez PPA. Co więcej, nasze dane odzwierciedlają istotną dysregulację regulacji transkrypcyjnej biogenezy i metabolizmu pod wpływem stresu PPA.
Geny STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1 należą do głównych regulatorów podziału, fuzji i dynamiki mitochondriów37,48,49. Istnieje wiele innych genów zaangażowanych w dynamikę mitochondriów, jednak wcześniej wykazano, że STOML2, OPA1 i MFN2 są różnicowo metylowane w kohortach z ASD16, a kilka niezależnych badań wykazało zmiany w tych czynnikach transkrypcyjnych w odpowiedzi na stres mitochondrialny50,51.52. Ekspresja zarówno OPA1, jak i STOML2 została istotnie zmniejszona po zastosowaniu 3 mM i 5 mM PPA (ryc. 3e, f). OPA1 jest jednym z klasycznych regulatorów fuzji mitochondriów poprzez bezpośrednią interakcję z MFN1 i 2 i odgrywa rolę w przebudowie grzebieni i morfologii mitochondriów53. Dokładna rola STOML2 w dynamice mitochondriów pozostaje niejasna, jednak dowody wskazują, że odgrywa ona rolę w fuzji mitochondriów, biogenezie i mitofagii.
STOML2 uczestniczy w utrzymaniu sprzężenia oddechowego mitochondriów i tworzeniu kompleksów łańcucha oddechowego54,55 i wykazano, że znacząco zmienia charakterystykę metaboliczną komórek nowotworowych56. Badania wykazały, że STOML2 promuje potencjał błony mitochondrialnej i biogenezę poprzez interakcję z BAN i kardiolipiną55,57,58. Ponadto, niezależne badania wykazały, że interakcja między STOML2 i PINK1 reguluje mitofagię59,60. Co istotne, doniesiono, że STOML2 bezpośrednio oddziałuje z MFN2 i stabilizuje go, a także odgrywa ważną rolę w stabilizacji długich izoform OPA1 poprzez hamowanie proteazy odpowiedzialnej za degradację OPA153,61,62. Zmniejszenie ekspresji STOML2 obserwowane w reakcjach PPA może sprawić, że te białka fuzyjne będą bardziej podatne na degradację poprzez szlaki zależne od ubikwityny i proteasomu48. Chociaż dokładna rola STOML2 i OPA1 w dynamicznej odpowiedzi na PPA nie jest jasna, zmniejszona ekspresja tych genów fuzyjnych (ryc. 3) może zaburzyć równowagę między podziałem a fuzją i prowadzić do zmniejszenia rozmiaru mitochondriów (ryc. 3). 1).
Z drugiej strony, ekspresja białka OPA1 pozostała niezmieniona po 24 godzinach, podczas gdy poziomy mRNA i białka MFN1, MFN2 lub DRP1 nie zmieniły się znacząco po leczeniu PPA (ryc. 3g-i, ryc. 4). Może to wskazywać, że nie ma zmian w regulacji tych czynników zaangażowanych w fuzję i podział mitochondriów. Warto jednak zauważyć, że każdy z tych czterech genów jest również regulowany przez modyfikacje potranskrypcyjne (PTM), które kontrolują aktywność białka. OPA1 ma osiem alternatywnych wariantów splicingu, które są rozszczepiane proteolitycznie w mitochondriach, tworząc dwie odrębne izoformy63. Równowaga między długimi i krótkimi izoformami ostatecznie determinuje rolę OPA1 w fuzji mitochondriów i utrzymaniu sieci mitochondrialnej64. Aktywność DRP1 jest regulowana przez fosforylację kinazy białkowej II zależnej od wapnia/kalmoduliny (CaMKII), podczas gdy degradacja DRP1 jest regulowana przez ubikwitynację i sumoylację65. Wreszcie, zarówno DRP1, jak i MFN1/2 są GTPazami, więc na aktywność może wpływać tempo produkcji GTP w mitochondriach66. Dlatego, chociaż ekspresja tych białek pozostaje stała, może to nie odzwierciedlać niezmienionej aktywności lub lokalizacji białek67,68. Rzeczywiście, istniejące repertuary białek PTM często służą jako pierwsza linia obrony odpowiedzialna za mediację ostrych reakcji stresowych. W obecności umiarkowanego stresu metabolicznego w naszym modelu prawdopodobne jest, że PTM promuje zwiększoną aktywność białek fuzyjnych i rozszczepialnych, aby wystarczająco przywrócić integralność mitochondriów bez konieczności dodatkowej aktywacji tych genów na poziomie mRNA lub białka.
Podsumowując, powyższe dane podkreślają złożoną i zależną od czasu regulację morfologii mitochondriów oraz wyzwania związane z wyjaśnieniem tych mechanizmów. Aby zbadać ekspresję genów, należy najpierw zidentyfikować konkretne geny docelowe w danym szlaku. Jednak nasze dane pokazują, że geny w tym samym szlaku nie reagują w ten sam sposób na ten sam stres. W rzeczywistości, wcześniejsze badania wykazały, że różne geny w tym samym szlaku mogą wykazywać różne profile odpowiedzi czasowej30,46. Ponadto istnieją złożone mechanizmy potranskrypcyjne, które zakłócają związek między transkrypcją a funkcją genu. Badania proteomiczne mogą dostarczyć informacji na temat wpływu PTM na funkcję białek, ale stanowią również wyzwania, takie jak metody o niskiej przepustowości, wysoki stosunek sygnału do szumu i słaba rozdzielczość.
W tym kontekście badanie morfologii mitochondriów za pomocą TEM i MEL ma ogromny potencjał, aby odpowiedzieć na fundamentalne pytania dotyczące związku między dynamiką i funkcją mitochondriów oraz ich wpływu na choroby. Co najważniejsze, TEM zapewnia bezpośrednią metodę pomiaru morfologii mitochondriów jako zbieżnego punktu końcowego dysfunkcji i dynamiki mitochondriów51. MEL zapewnia również bezpośrednią metodę wizualizacji procesów rozszczepienia i fuzji w trójwymiarowym środowisku komórkowym, umożliwiając kwantyfikację dynamicznej przebudowy mitochondriów nawet przy braku zmian w ekspresji genów33. W niniejszym artykule podkreślamy użyteczność technik obrazowania mitochondriów we wtórnych chorobach mitochondrialnych. Choroby te zazwyczaj charakteryzują się przewlekłym, łagodnym stresem metabolicznym, charakteryzującym się subtelną przebudową sieci mitochondrialnych, a nie ostrym uszkodzeniem mitochondriów. Jednakże kompensacja mitochondrialna niezbędna do utrzymania mitozy w warunkach przewlekłego stresu ma głębokie konsekwencje funkcjonalne. W kontekście neuronauki lepsze zrozumienie tych mechanizmów kompensacyjnych może dostarczyć ważnych informacji na temat plejotropowej neuropatologii związanej z dysfunkcją mitochondriów.
Ostatecznie nasze dane podkreślają użyteczność technik obrazowania w zrozumieniu funkcjonalnych konsekwencji złożonych interakcji między ekspresją genów, modyfikacjami białek i aktywnością białek, które kontrolują dynamikę neuronów w mitochondriach. Wykorzystaliśmy PPA do modelowania dysfunkcji mitochondriów w modelu komórki neuronalnej, aby uzyskać wgląd w mitochondrialny komponent ASD. Komórki SH-SY5Y poddane działaniu PPA wykazały zmiany w morfologii mitochondriów: mitochondria stały się małe i okrągłe, a grzebienie były słabo widoczne podczas obserwacji w mikroskopie TEM. Analiza MEL pokazuje, że zmiany te zachodzą jednocześnie ze wzrostem liczby zdarzeń rozszczepienia i fuzji, co utrzymuje sieć mitochondrialną w odpowiedzi na łagodny stres metaboliczny. Ponadto PPA znacząco zaburza regulację transkrypcyjną metabolizmu i homeostazy mitochondriów. Zidentyfikowaliśmy cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 i OPA1 jako kluczowe regulatory mitochondrialne zaburzone przez stres PPA i mogą one odgrywać rolę w mediacji indukowanych przez PPA zmian w morfologii i funkcji mitochondriów. Potrzebne są dalsze badania, aby lepiej scharakteryzować indukowane przez PPA zmiany w ekspresji genów, aktywności białek, lokalizacji i modyfikacjach potranslacyjnych. Nasze dane podkreślają złożoność i współzależność mechanizmów regulacyjnych pośredniczących w reakcji na stres mitochondrialny oraz dowodzą przydatności TEM i innych technik obrazowania w bardziej ukierunkowanych badaniach mechanistycznych.
Linię komórkową SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) zakupiono od firmy Sigma-Aldrich. Komórki SH-SY5Y hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle'a firmy Dulbecco z mieszanką składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12) i L-glutaminą (SC09411, ScienCell) w kolbach o pojemności 25 cm², uzupełnionych 20% surowicą płodową bydlęcą (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) i 1% penicyliną i streptomycyną (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) w temperaturze 37°C, w atmosferze 5% CO2. Komórki poddano subkulturze do 80% zbieżności, używając 0,05% trypsyny-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), odwirowano przy 300 g i posiewano z gęstością około 7 × 105 komórek/ml. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na niezróżnicowanych komórkach SH-SY5Y pomiędzy pasażami 19–22. PPA podawano jako NaP. Rozpuścić proszek NaP (nr CAS 137-40-6, wzór chemiczny C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) w ciepłej wodzie MilliQ do stężenia 1 M i przechowywać w temperaturze 4°C. W dniu zabiegu rozcieńczyć ten roztwór 1 M PPA do 3 mM i 5 mM PPA w podłożu bez surowicy (DMEM/F-12 z L-glutaminą). Stężenia preparatu we wszystkich eksperymentach wynosiły: brak PPA (0 mM, kontrola), 3 mM i 5 mM PPA. Eksperymenty przeprowadzono w co najmniej trzech powtórzeniach biologicznych.
Komórki SH-SY5Y wysiano do kolb o pojemności 25 cm³ w gęstości 5,5 × 105 komórek/ml i hodowano przez 24 godziny. Przed 24 godzinami inkubacji do kolb dodano PPA. Zebrać peletki komórek zgodnie z protokołami podhodowli tkanek ssaków (opisanymi powyżej). Zawiesić peletki komórek w 100 µl 2,5% glutaraldehydu, 1× PBS i przechowywać w temperaturze 4°C do momentu obróbki. Komórki SH-SY5Y krótko wirowano w celu osadzenia komórek i usunięcia roztworu 2,5% glutaraldehydu, 1× PBS. Zawiesić osad w 4% żelu agarozowym przygotowanym w wodzie destylowanej (stosunek objętości agarozy do osadu wynosi 1:1). Fragmenty agarozy umieszczono na siatkach na płaskich płytkach i pokryto 1-heksadecenem przed zamrożeniem pod wysokim ciśnieniem. Próbki zamrożono w 100% suchym acetonie w temperaturze -90°C na 24 godziny. Następnie temperaturę podniesiono do -80°C i dodano roztwór 1% tetratlenku osmu i 0,1% glutaraldehydu. Próbki przechowywano w temperaturze -80°C przez 24 godziny. Następnie temperaturę stopniowo podwyższano do temperatury pokojowej przez kilka dni: od -80°C do -50°C na 24 godziny, do -30°C na 24 godziny, do -10°C na 24 godziny, a ostatecznie do temperatury pokojowej.
Po kriogenicznym przygotowaniu próbki impregnowano żywicą i wykonano ultracienkie skrawki (∼100 nm) za pomocą ultramikrotomu Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Skrawki barwiono 2% octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Próbki obserwowano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (dawniej FEI), Eindhoven, Holandia) pracującego przy napięciu 200 kV (nadajnik Lab6) i kamery Gatan CCD (Gatan, Wielka Brytania) wyposażonej w filtr energetyczny Tridiem.
W każdej technicznej replikacji uzyskano co najmniej 24 obrazy pojedynczych komórek, co daje łącznie 266 obrazów. Wszystkie obrazy analizowano przy użyciu makra Region of Interest (ROI) i makra Mitochondria. Makro mitochondrialne opiera się na opublikowanych metodach17,31,32 i umożliwia półautomatyczne przetwarzanie wsadowe obrazów TEM w Fiji/ImageJ69. W skrócie: obraz jest odwracany i odwracany za pomocą odejmowania tła metodą rolling ball (promień 60 pikseli) i filtru pasmowo-przepustowego FFT (używającego odpowiednio górnej i dolnej granicy 60 i 8 pikseli) oraz tłumienia linii pionowych z tolerancją orientacji 5%. Przetworzony obraz jest automatycznie progowany przy użyciu algorytmu maksymalnej entropii, a następnie generowana jest maska ​​binarna. Wyekstrahowano obszary obrazu powiązane z ręcznie wybranymi obszarami ROI w surowych obrazach TEM, charakteryzując mitochondria i wykluczając błonę plazmatyczną i inne obszary o wysokim kontraście. Dla każdego wyodrębnionego obszaru zainteresowania (ROI) analizowano cząstki binarne większe niż 600 pikseli, a powierzchnię cząstki, obwód, osie główną i małą, średnicę Fereta, okrągłość i kolistość zmierzono za pomocą wbudowanych funkcji pomiarowych Fiji/ImageJ. Zgodnie z Merrill, Flippo i Strack (2017), powierzchnia 2, współczynnik kształtu cząstki (stosunek osi głównej do małej) i współczynnik kształtu (FF) obliczono na podstawie tych danych, gdzie FF = obwód 2/4pi x powierzchnia. Definicję wzoru parametrycznego można znaleźć w Merrill, Flippo i Strack (2017). Wymienione makra są dostępne w serwisie GitHub (patrz Oświadczenie o dostępności danych). Średnio analizowano około 5600 cząstek na zabieg PPA, co daje łącznie około 17 000 cząstek (dane nie pokazano).
Komórki SH-SH5Y umieszczono w 8-komorowych naczyniach hodowlanych (ThermoFisher, #155411), aby umożliwić adhezję przez noc, a następnie inkubowano z TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) i Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). barwienie. Obrazy uzyskano za pomocą laserów 405 nm i 561 nm w środowisku 10 min, a surowe obrazy uzyskano jako stosy Z zawierające 10 mikrofotografii obrazu z krokiem az 0,2 μm między klatkami obrazu w 12 kolejnych punktach czasowych. Obrazy zebrano za pomocą platformy superrozdzielczej Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Niemcy) z użyciem obiektywu LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Analizę obrazów przeprowadzono w programie ImageJ, wykorzystując wcześniej opisaną metodę i wtyczkę ImageJ do pomiaru zdarzeń fuzji i rozszczepienia, średniej liczby struktur mitochondrialnych oraz średniej objętości mitochondriów na komórkę33. Makra MEL są dostępne w serwisie GitHub (patrz Oświadczenie o dostępności danych).
Komórki SH-SY5Y hodowano na płytkach sześciodołkowych w gęstości 0,3 × 106 komórek/ml przez 24 godziny przed rozpoczęciem leczenia. Ekstrakcję RNA przeprowadzono przy użyciu protokołu Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) z niewielkimi modyfikacjami: do każdego dołka dodano 300 μl buforu do lizy RNA przed usunięciem, a następnie lizowano każdą próbkę na ostatnim etapie 30 μl wody elucyjnej wolnej od deoksyrybonukleazy/rybonukleazy. Wszystkie próbki sprawdzono pod kątem ilości i jakości za pomocą spektrofotometru UV-Vis NanoDrop ND-1000. Całkowite białko z lizatów komórkowych uzyskano za pomocą 200 μl buforu do lizy RIPA, a stężenie białka oznaczono ilościowo za pomocą testu Bradforda70.
Syntezę cDNA przeprowadzono za pomocą zestawu Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) zgodnie z instrukcją producenta, z pewnymi modyfikacjami. cDNA syntezowano w reakcjach o objętości 20 μl, stosując od 0,7 do 1 μg całkowitego RNA. Startery wybrano z wcześniej opublikowanych artykułów 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabela S1), a towarzyszące im sondy zaprojektowano za pomocą narzędzia PrimerQuest firmy Integrated DNA Technologies. Wszystkie interesujące geny znormalizowano do jądrowego genu B2M. Ekspresję genów STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC i OPA1 mierzono metodą RT-qPCR. Mieszanina mastermiksowa zawierała polimerazę LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), 10 μM starterów forward i reverse, cDNA oraz wodę klasy PCR, co dało objętość końcową 10 μl dla każdej reakcji. Ekspresję genów podziału i rozszczepienia (DRP1, MFN1/2) mierzono za pomocą multipleksowych testów TaqMan. Mieszaninę mastermiksową Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) stosowano zgodnie z instrukcją producenta z niewielkimi modyfikacjami. Multipleksowa mieszanka mastermiksowa RT-qPCR zawiera 1X polimerazę LUNA Taq, 10 μM starterów forward i reverse, 10 μM sondy, cDNA oraz wodę klasy PCR, co dało objętość końcową 20 μl dla każdej reakcji. RT-qPCR wykonano przy użyciu Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG — numer seryjny: R0618110). Warunki cykli przedstawiono w tabeli S1. Wszystkie próbki cDNA amplifikowano w trzech powtórzeniach, a krzywą standardową wygenerowano, stosując serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń. W celu zapewnienia powtarzalności danych z analizy usunięto wartości odstające w próbkach z trzech powtórzeń, w których odchylenie standardowe progu cyklu (Ct) przekraczało 0,530,72. Względną ekspresję genów obliczono metodą 2-ΔΔCt79.
Próbki białka (60 μg) zmieszano z buforem Laemmli w stosunku 2:1 i naniesiono na 12% bezbarwny żel białkowy (Bio-Rad nr 1610184). Białka przeniesiono na membranę PVDF (fluorek poliwinylidenu) (nr 170-84156, Bio-Rad) za pomocą systemu Trans-Blot Turbo (nr 170-4155, Bio-Rad). Membranę zablokowano i inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi (OPA1, MFN1, MFN2 i DRP1) (rozcieńczonymi 1:1000) przez 48 godzin, a następnie inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi (1:10 000) przez 1 godzinę. Następnie membrany zobrazowano za pomocą substratu Clarity Western ECL (nr 170-5061, Bio-Rad) i zarejestrowano za pomocą systemu Bio-Rad ChemiDoc MP. Do analizy Western blot użyto oprogramowania ImageLab w wersji 6.1. Oryginalny żel i blot przedstawiono na rysunku S1. Informacje o przeciwciałach przedstawiono w tabeli S2.
Zbiory danych przedstawiono jako średnią i błąd standardowy średniej (SEM) z co najmniej trzech niezależnych prób. Zbiory danych przetestowano pod kątem normalności rozkładu za pomocą testu Shapiro-Wilksa (o ile nie zaznaczono inaczej) przed przyjęciem rozkładu Gaussa i równych odchyleń standardowych oraz przystąpieniem do analiz. Oprócz analizy zbioru danych za pomocą Fisher's MEL LSD (p < 0,05), jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) (średnia grupy leczonej vs. kontrolnej) oraz testu wielokrotnych porównań Dunnetta w celu określenia istotności statystycznej (p < 0,05). Istotne wartości p przedstawiono na wykresie jako *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Wszystkie analizy statystyczne i wykresy przeprowadzono i wygenerowano za pomocą GraphPad Prism 9.4.0.
Makra Fiji/ImageJ do analizy obrazów TEM są publicznie dostępne na GitHubie: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro Mitochondrial Event Locator (MEL) jest publicznie dostępne na GitHubie: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM i Vijaya A. Mitochondria: główne regulatory metabolizmu, homeostazy, stresu, starzenia się i epigenetyki. Indonezyjski. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Wielopłaszczyznowa dysfunkcja mitochondriów w schizofrenii, kompleks I jako możliwy cel patologiczny. Schizofrenia. Zasób. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. i Beal, MF Dysfunkcja mitochondriów w chorobie Parkinsona. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG i Mehta V. Stresowane mitochondria: cele inwazji w chorobie Alzheimera. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF i Ferreira GK Mitochondria i mózg: bioenergetyka i więcej. Neurotoksyny. Zasób. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. i in. Mitochondria plejotropowe: wpływ mitochondriów na rozwój neuronów i choroby. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. i Morais, VA Biogeneza mitochondriów w neuronach: jak i gdzie. Międzynarodowość. J. Mohr. nauka. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. i Zhao, J. Regulacja dynamiki mitochondriów ssaków: szanse i wyzwania. front. endokrynologiczny. (Lozanna) 11, 374 (2020).
Khacho, M. i Slack, RS Dynamika mitochondriów w regulacji neurogenezy: od rozwijającego się do dorosłego mózgu. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).