Dziękujemy za odwiedzenie witryny Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Tymczasem, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
Nanocząstki insuliny (NP) o wysokiej zawartości ładunku znalazły różne zastosowania w różnych postaciach dawkowania. Niniejsza praca ma na celu ocenę wpływu procesów liofilizacji i suszenia rozpyłowego na strukturę nanocząstek chitozanu obciążonych insuliną, z mannitolem jako krioochronnym środkiem lub bez niego. Oceniliśmy również jakość tych nanocząstek poprzez ich ponowne rozpuszczenie. Przed odwodnieniem zoptymalizowano rozmiar cząstek usieciowanych nanocząstek chitozanu/tripolifosforanu sodu/insuliny do 318 nm, PDI wynosiło 0,18, wydajność enkapsulacji wynosiła 99,4%, a obciążenie wynosiło 25,01%. Po rekonstytucji wszystkie nanocząstki, z wyjątkiem tych wytworzonych metodą liofilizacji bez użycia mannitolu, zachowały swoją kulistą strukturę cząstek. W porównaniu do nanocząstek zawierających mannitol odwodnionych metodą rozpyłową, Suszone rozpyłowo nanocząstki bez mannitolu wykazały również najmniejszy średni rozmiar cząstek (376 nm) i najwyższą zawartość ładunku (25,02%) przy podobnym stopniu enkapsulacji (98,7%) i PDI (0,20) po zastosowaniu technik suszenia lub liofilizacji. Nanocząstki suszone rozpyłowo bez mannitolu skutkowały również najszybszym uwalnianiem insuliny i najwyższą wydajnością wychwytu komórkowego. Niniejsza praca pokazuje, że suszenie rozpyłowe może odwodnić nanocząstki insuliny bez potrzeby stosowania krioochronnych środków w porównaniu z konwencjonalnymi metodami liofilizacji, co zapewnia większą pojemność ładunkową, niższe wymagania dotyczące dodatków i znaczące korzyści w zakresie kosztów operacyjnych.
Od momentu odkrycia w 1922 roku1,2,3 insulina i jej preparaty farmaceutyczne ratowały życie pacjentów z cukrzycą typu 1 (T1DM) i cukrzycą typu 2 (T1DM). Jednak ze względu na swoje właściwości jako białka o dużej masie cząsteczkowej, insulina łatwo się agreguje, rozkłada przez enzymy proteolityczne i eliminowana w efekcie pierwszego przejścia. Osoby, u których zdiagnozowano cukrzycę typu 1, potrzebują zastrzyków z insuliny do końca życia. Wielu pacjentów, u których początkowo zdiagnozowano cukrzycę typu 2, wymaga również długotrwałych zastrzyków z insuliny. Codzienne zastrzyki z insuliny są poważnym źródłem codziennego bólu i dyskomfortu dla tych osób, a także negatywnie wpływają na zdrowie psychiczne. W związku z tym inne formy podawania insuliny, które powodują mniej dyskomfortu, takie jak doustne podawanie insuliny, są szeroko badane5, ponieważ mają potencjał przywrócenia jakości życia około 5 miliardom osób chorych na cukrzycę na całym świecie.
Technologia nanocząsteczek zapewniła znaczący postęp w próbach doustnego podawania insuliny4,6,7. Technologia ta skutecznie otacza i chroni insulinę przed degradacją, umożliwiając jej ukierunkowane dostarczanie do określonych miejsc w organizmie. Jednak stosowanie formulacji nanocząsteczek ma kilka ograniczeń, głównie ze względu na problemy ze stabilnością zawiesin cząstek. Podczas przechowywania może wystąpić pewna agregacja, co zmniejsza biodostępność nanocząsteczek zawierających insulinę8. Ponadto, aby zapewnić stabilność nanocząsteczek insuliny (NP), należy również wziąć pod uwagę stabilność chemiczną matrycy polimerowej nanocząsteczek i insuliny. Obecnie złotym standardem w tworzeniu stabilnych NP przy jednoczesnym zapobieganiu niepożądanym zmianom podczas przechowywania jest technologia liofilizacji9.
Jednakże liofilizacja wymaga dodania krioochronnych substancji, aby zapobiec uszkodzeniu kulistej struktury nanocząstek przez mechaniczne naprężenia kryształków lodu. Znacznie zmniejsza to obciążenie nanocząstek insuliny po liofilizacji, ponieważ krioochronne substancje stanowią większość ich udziału wagowego. W związku z tym wytworzone nanocząstki insuliny często okazują się nieodpowiednie do wytwarzania preparatów w postaci suchego proszku, takich jak tabletki doustne i listki doustne, ze względu na konieczność użycia dużych ilości suchych nanocząstek w celu osiągnięcia terapeutycznego okna działania insuliny.
Suszenie rozpyłowe jest dobrze znanym i niedrogim procesem na skalę przemysłową służącym do produkcji suchych proszków z faz ciekłych w przemyśle farmaceutycznym10,11. Kontrola nad procesem formowania cząstek umożliwia właściwą enkapsulację kilku związków bioaktywnych12, 13. Ponadto stała się skuteczną techniką przygotowywania kapsułkowanych białek do podawania doustnego. Podczas suszenia rozpyłowego woda bardzo szybko odparowuje, co pomaga utrzymać niską temperaturę rdzenia cząstki11,14, umożliwiając jego zastosowanie do kapsułkowania składników wrażliwych na ciepło. Przed suszeniem rozpyłowym materiał powłoki powinien zostać dokładnie zhomogenizowany z roztworem zawierającym kapsułkowane składniki11,14. W przeciwieństwie do liofilizacji, homogenizacja przed kapsułkowaniem w suszeniu rozpyłowym poprawia wydajność kapsułkowania podczas dehydratacji. Ponieważ proces kapsułkowania z suszeniem rozpyłowym nie wymaga krioochronników, suszenie rozpyłowe może być stosowane do produkcji suszonych nanocząstek o wysokiej zawartości ładunku.
W niniejszym badaniu opisano produkcję nanocząstek z insuliną poprzez sieciowanie chitozanu i tripolifosforanu sodu przy użyciu metody żelu jonowego. Żelowanie jonowe to metoda preparatyki, która umożliwia produkcję nanocząstek poprzez oddziaływania elektrostatyczne między dwoma lub więcej rodzajami jonów w określonych warunkach. Do odwodnienia zoptymalizowanych nanocząstek z usieciowanymi chitozanem/tripolifosforanem sodu/insuliną zastosowano techniki liofilizacji i suszenia rozpyłowego. Po odwodnieniu ich morfologię przeanalizowano za pomocą SEM. Ich zdolność do rekombinacji oceniono, mierząc ich rozkład wielkości, ładunek powierzchniowy, PDI, wydajność enkapsulacji i zawartość ładunku. Jakość ponownie rozpuszczonych nanocząstek wytworzonych różnymi metodami dehydratacji oceniono również poprzez porównanie ich ochrony przed insuliną, zachowania uwalniania i skuteczności wychwytu komórkowego.
pH roztworu mieszanego i stosunek chitozanu do insuliny to dwa kluczowe czynniki wpływające na wielkość cząstek i wydajność enkapsulacji (EE) końcowych NP, ponieważ bezpośrednio wpływają na proces żelowania jonotropowego. Wykazano, że pH roztworu mieszanego jest silnie skorelowane z wielkością cząstek i wydajnością enkapsulacji (rys. 1a). Jak pokazano na rys. 1a, wraz ze wzrostem pH z 4,0 do 6,0, średni rozmiar cząstek (nm) zmniejszył się, a EE znacznie wzrósł, podczas gdy gdy pH wzrosło do 6,5, średni rozmiar cząstek zaczął wzrastać, a EE pozostał niezmieniony. Wraz ze wzrostem stosunku chitozanu do insuliny, średni rozmiar cząstek również wzrósł. Ponadto nie zaobserwowano żadnej zmiany EE, gdy nanocząstki przygotowano przy stosunku masowym chitozanu do insuliny wyższym niż 2,5:1 (w/w) (rys. 1b). Dlatego optymalne warunki przygotowania w tym badaniu (pH 6,0, stosunek masowy chitozanu do insuliny (2,5:1) zostały użyte do przygotowania nanocząstek załadowanych insuliną do dalszych badań. W tych warunkach przygotowania średni rozmiar cząstek nanocząstek insuliny został zoptymalizowany do 318 nm (rys. 1c), PDI wynosiło 0,18, wydajność osadzania wynosiła 99,4%, potencjał zeta wynosił 9,8 mV, a obciążenie insuliną wynosiło 25,01% (m/m). Na podstawie wyników transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) zoptymalizowane nanocząstki były mniej więcej kuliste i dyskretne o stosunkowo jednolitym rozmiarze (rys. 1d).
Optymalizacja parametrów nanocząstek insuliny: (a) wpływ pH na średnią średnicę i wydajność enkapsulacji (EE) nanocząstek insuliny (przygotowanych przy stosunku masowym chitozanu do insuliny 5:1); (b) chitozan i wpływ stosunku masowego insuliny na średnią średnicę i wydajność enkapsulacji (EE) cząstek nanocząsteczek insuliny (przygotowanych przy pH 6); (c) rozkład wielkości cząstek zoptymalizowanych nanocząstek insuliny; (d) mikroskopowa fotografia TEM zoptymalizowanych cząstek nanocząsteczek insuliny.
Wiadomo, że chitozan jest słabym polielektrolitem o pKa równym 6,5. W środowisku kwaśnym ma ładunek dodatni, ponieważ jego główna grupa aminowa jest protonowana przez jony wodoru15. Dlatego też często jest stosowany jako nośnik do kapsułkowania ujemnie naładowanych makrocząsteczek. W tym badaniu chitozan został użyty do kapsułkowania insuliny o punkcie izoelektrycznym 5,3. Ponieważ chitozan jest stosowany jako materiał powłokowy, wraz ze wzrostem jego proporcji odpowiednio wzrasta grubość zewnętrznej warstwy nanocząstek, co skutkuje większym średnim rozmiarem cząstek. Ponadto wyższe poziomy chitozanu mogą kapsułkować więcej insuliny. W naszym przypadku EE było najwyższe, gdy stosunek chitozanu do insuliny osiągnął 2,5:1, i nie było znaczącej zmiany w EE, gdy stosunek ten stale wzrastał.
Oprócz stosunku chitozanu do insuliny, pH również odgrywało kluczową rolę w przygotowaniu nanocząstek. Gan i in. 17 badali wpływ pH na wielkość cząstek nanocząstek chitozanu. Stwierdzili ciągły spadek wielkości cząstek, aż do osiągnięcia pH 6,0, a znaczący wzrost wielkości cząstek zaobserwowano przy pH > 6,0, co jest zgodne z naszymi obserwacjami. Zjawisko to wynika z faktu, że wraz ze wzrostem pH cząsteczka insuliny nabywa ujemny ładunek powierzchniowy, sprzyjając w ten sposób oddziaływaniom elektrostatycznym z kompleksem chitozanu/tripolifosforanu sodu (TPP), co skutkuje małymi rozmiarami cząstek i wysoką EE. Jednak po dostosowaniu pH do 6,5 grupy aminowe chitozanu uległy deprotonacji, co skutkowało fałdowaniem chitozanu. Zatem wysokie pH skutkuje mniejszą ekspozycją jonów aminowych na TPP i insulinę, co skutkuje niższym usieciowaniem, większym końcowym średnim rozmiarem cząstek i niższą EE.
Analiza właściwości morfologicznych liofilizowanych i suszonych rozpyłowo nanocząstek może pomóc w wyborze lepszych technik dehydratacji i formowania proszku. Preferowana metoda powinna zapewniać stabilność leku, jednolity kształt cząstek, wysokie stężenie leku i dobrą rozpuszczalność w oryginalnym roztworze. W tym badaniu, aby lepiej porównać dwie techniki, podczas dehydratacji użyto nanocząstek insuliny z 1% mannitolem lub bez niego. Mannitol jest stosowany jako substancja wypełniająca lub krioochronna w różnych formulacjach suchego proszku do liofilizacji i suszenia rozpyłowego. W przypadku liofilizowanych nanocząstek insuliny bez mannitolu, jak pokazano na rysunku 2a, pod mikroskopem skaningowym elektronowym (SEM) zaobserwowano wysoce porowatą strukturę proszku o dużych, nieregularnych i chropowatych powierzchniach. Po dehydratacji w proszku wykryto niewiele oddzielnych cząstek (rys. 2e). Wyniki te wskazują, że większość nanocząstek uległa rozkładowi podczas liofilizacji bez krioochrony. W przypadku liofilizowanych i suszonych rozpyłowo nanocząstek insuliny zawierających 1% mannitolu, zaobserwowano kuliste nanocząstki o gładkich powierzchniach (rys. 2b, d, f, h). Nanocząstki insuliny suszone rozpyłowo bez mannitolu pozostały kuliste, ale pomarszczone na powierzchni (rys. 2c). Powierzchnie kuliste i pomarszczone omówiono szerzej w poniższych testach zachowania uwalniania i wychwytu komórkowego. Na podstawie widocznego wyglądu wysuszonych NP, zarówno suszone rozpyłowo NP bez mannitolu, jak i NP liofilizowane i suszone rozpyłowo z mannitolem dały drobne proszki NP (rys. 2f, g, h). Im większa powierzchnia między powierzchniami cząstek, tym większa rozpuszczalność, a zatem i większa szybkość uwalniania.
Morfologia różnych odwodnionych NP insuliny: (a) obraz SEM liofilizowanych NP insuliny bez mannitolu; (b) obraz SEM liofilizowanych NP insuliny z mannitolem; (c) rozpyłowo suszonych NP insuliny bez mannitolu Obraz SEM; (d) obraz SEM NP insuliny suszonej rozpyłowo z mannitolem; (e) obraz liofilizowanego proszku NP insuliny bez mannitolu; (f) obraz liofilizowanego proszku NP insuliny z mannitolem; (g) obraz rozpyłowo suszonego proszku NP insuliny bez mannitolu; (h) obraz rozpyłowo suszonego proszku NP insuliny z mannitolem.
Podczas liofilizacji mannitol działa jako krioochronny, utrzymując NP w formie amorficznej i zapobiegając uszkodzeniom wywoływanym przez kryształki lodu19. Natomiast podczas suszenia rozpyłowego nie występuje etap zamrażania. Dlatego w tej metodzie mannitol nie jest wymagany. W rzeczywistości NP suszone rozpyłowo bez mannitolu dawały drobniejsze NP, jak opisano wcześniej. Jednak mannitol może nadal działać jako wypełniacz w procesie suszenia rozpyłowego, nadając NP bardziej kulistą strukturę20 (rys. 2d), co pomaga uzyskać równomierne uwalnianie takich kapsułkowanych NP. Ponadto jest oczywiste, że pewne duże cząstki można wykryć zarówno w liofilizowanych, jak i suszonych rozpyłowo NP insuliny zawierających mannitol (rys. 2b,d), co może być spowodowane gromadzeniem się mannitolu w rdzeniu cząstki wraz z kapsułkowaną insuliną. Do.Warstwa chitozanu.Warto zauważyć, że w tym badaniu, aby mieć pewność, że struktura kulista pozostanie nienaruszona po odwodnieniu, stosunek mannitolu do chitozanu utrzymywano na poziomie 5:1, tak aby duża ilość wypełniacza mogła również zwiększyć rozmiar cząstek wysuszonych nanocząstek.
Spektroskopia w podczerwieni z całkowitym osłabionym odbiciem i transformacją Fouriera (FTIR-ATR) scharakteryzowała mieszaninę fizyczną wolnej insuliny, chitozanu, chitozanu, TPP i insuliny. Wszystkie odwodnione NP scharakteryzowano za pomocą spektroskopii FTIR-ATR. Warto zauważyć, że intensywności pasm wynoszące 1641, 1543 i 1412 cm-1 zaobserwowano w przypadku NP liofilizowanych z mannitolem oraz w przypadku NP suszonych rozpyłowo z mannitolem i bez niego (rys. 3). Jak wcześniej zgłaszano, te wzrosty wytrzymałości były związane z sieciowaniem chitozanu, TPP i insuliny. Badanie interakcji chitozanu i insuliny wykazało, że w widmach FTIR nanocząstek chitozanu obciążonych insuliną pasmo chitozanu nakładało się na pasmo insuliny, zwiększając intensywność karbonylową (1641 cm-1) i pasmo aminowe (1543 cm-1). Grupy tripolifosforanowe TPP są połączone do grup amonowych w chitozanie, tworząc pasmo przy 1412 cm-1.
Widma FTIR-ATR wolnej insuliny, chitozanu, mieszanin fizycznych chitozanu/TPP/insuliny i nanocząstek odwodnionych różnymi metodami.
Ponadto wyniki te są zgodne z wynikami uzyskanymi w SEM, które wykazały, że otoczone kapsułkami NP pozostały nienaruszone zarówno po rozpyleniu, jak i liofilizacji z mannitolem, ale w nieobecności mannitolu, jedynie suszenie rozpyłowe wytworzyło otoczone kapsułkami cząstki. Natomiast wyniki widm FTIR-ATR NP liofilizowanych bez mannitolu były bardzo podobne do fizycznej mieszaniny chitozanu, TPP i insuliny. Wynik ten wskazuje, że wiązania poprzeczne między chitozanem, TPP i insuliną nie występują już w NP liofilizowanych bez mannitolu. Struktura NP została zniszczona podczas liofilizacji bez krioochronnego środka, co można zobaczyć w wynikach SEM (rys. 2a). Na podstawie morfologii i wyników FTIR odwodnionych NP insuliny, do eksperymentów rekonstytucji użyto wyłącznie NP liofilizowanych, rozpyłowo suszonych i wolnych od mannitolu oraz NP wolnych od mannitolu ze względu na Omówić rozkład nanocząstek wolnych od mannitolu podczas odwodnienia.
Dehydratacja jest stosowana do długoterminowego przechowywania i ponownego przetwarzania w inne formulacje. Zdolność suchych NP do rekonstytucji po przechowywaniu jest krytyczna dla ich wykorzystania w różnych formulacjach, takich jak tabletki i folie. Zauważyliśmy, że średnia wielkość cząstek suszonych rozpyłowo NP insuliny w nieobecności mannitolu wzrosła tylko nieznacznie po rekonstytucji. Z drugiej strony, wielkość cząstek suszonych rozpyłowo i liofilizowanych nanocząstek insuliny z mannitolem wzrosła znacząco (Tabela 1). PDI i EE nie uległy znaczącej zmianie (p > 0,05) po rekombinacji wszystkich NP w tym badaniu (Tabela 1). Wynik ten wskazuje, że większość cząstek pozostała nienaruszona po ponownym rozpuszczeniu. Jednak dodanie mannitolu spowodowało znaczne zmniejszenie ładunku insuliny w liofilizowanych i suszonych rozpyłowo nanocząstkach mannitolu (Tabela 1). Natomiast zawartość ładunku insuliny w suszonych rozpyłowo bez mannitolu NP pozostała taka sama jak wcześniej (Tabela 1).
Wiadomo, że obciążenie nanocząstkami ma kluczowe znaczenie w przypadku stosowania ich w celach dostarczania leków. W przypadku nanocząstek o niskim obciążeniu, do osiągnięcia progu terapeutycznego wymagane są bardzo duże ilości materiału. Jednak wysoka lepkość tak wysokich stężeń nanocząstek prowadzi do niedogodności i trudności odpowiednio w podawaniu doustnym i w formulacjach do wstrzykiwań22. Ponadto nanocząstki insuliny można również stosować do wytwarzania tabletek i lepkich biofilmów23, 24, co wymaga stosowania dużych ilości nanocząstek przy niskim poziomie obciążenia, co skutkuje dużymi tabletkami i grubymi biofilmami, które nie nadają się do zastosowań doustnych. Dlatego odwodnione nanocząstki o wysokim obciążeniu insuliną są bardzo pożądane. Nasze wyniki sugerują, że wysokie obciążenie insuliną w rozpyłowo suszonych nanocząstkach bez mannitolu może zapewnić wiele atrakcyjnych zalet w przypadku tych alternatywnych metod dostarczania.
Wszystkie odwodnione NP przechowywano w lodówce przez trzy miesiące. Wyniki SEM wykazały, że morfologia wszystkich odwodnionych NP nie zmieniła się znacząco podczas trzymiesięcznego przechowywania (rys. 4). Po rekonstytucji w wodzie wszystkie NP wykazały niewielki spadek EE i uwolniły około niewielką ilość (~5%) insuliny podczas trzymiesięcznego okresu przechowywania (tabela 2). Jednak średni rozmiar cząstek wszystkich nanocząstek wzrósł. Rozmiar cząstek NP suszonych rozpyłowo bez mannitolu wzrósł do 525 nm, podczas gdy rozmiar cząstek NP suszonych rozpyłowo i liofilizowanych z mannitolem wzrósł odpowiednio do 872 i 921 nm (tabela 2).
Morfologia różnych odwodnionych cząstek insuliny przechowywanych przez trzy miesiące: (a) obraz SEM liofilizowanych cząstek insuliny z mannitolem; (b) obraz SEM rozpyłowo suszonych nanocząsteczek insuliny bez mannitolu; (c) obrazy SEM rozpyłowo suszonych nanocząsteczek insuliny bez mannitolu.
Ponadto zaobserwowano osady w odtworzonych nanocząsteczkach insuliny suszonych rozpyłowo z mannitolem i liofilizowanych (rys. S2). Może to być spowodowane tym, że duże cząsteczki nie są prawidłowo zawieszone w wodzie. Wszystkie powyższe wyniki pokazują, że technika suszenia rozpyłowego może chronić nanocząsteczki insuliny przed odwodnieniem i że można uzyskać duże ilości nanocząsteczek insuliny bez żadnych wypełniaczy ani krioochronników.
Retencję insuliny testowano w środowisku o pH = 2,5 z pepsyną, trypsyną i α-chymotrypsyną, aby wykazać zdolność ochronną NP przed trawieniem enzymatycznym po odwodnieniu. Retencję insuliny w odwodnionych NP porównano z retencją w świeżo przygotowanych NP, a wolną insulinę zastosowano jako kontrolę negatywną. W tym badaniu wolna insulina wykazała szybką eliminację insuliny w ciągu 4 godzin we wszystkich trzech rodzajach obróbki enzymatycznej (ryc. 5a–c). Natomiast test eliminacji insuliny z NP liofilizowanych z mannitolem i NP suszonych rozpyłowo z mannitolem lub bez niego wykazał znacznie wyższą ochronę tych NP przed trawieniem enzymatycznym, która była podobna do świeżo przygotowanych NP insuliny (ryc. 1).5a–c). Z pomocą nanocząsteczek w pepsynie, trypsynie i α-chymotrypsynie, ponad 50%, 60% i 75% insuliny mogło być chronionych odpowiednio w ciągu 4 godzin (Ryc. 5a–c). Ta zdolność ochronna wobec insuliny może zwiększać szansę na wyższą absorpcję insuliny do krwiobiegu25. Wyniki te sugerują, że suszenie rozpyłowe z mannitolem lub bez niego oraz liofilizacja z mannitolem może zachować zdolność ochronną wobec insuliny NP po odwodnieniu.
Ochrona i uwalnianie odwodnionych NP insuliny: (a) ochrona insuliny w roztworze pepsyny; (b) ochrona insuliny w roztworze trypsyny; (c) ochrona insuliny przez roztwór α-chymotrypsyny; (d) Zachowanie uwalniania odwodnionych NP w roztworze o pH = 2,5; (e) zachowanie uwalniania odwodnionych NP w roztworze o pH = 6,6; (f) zachowanie uwalniania odwodnionych NP w roztworze o pH = 7,0.
Świeżo przygotowane i zrekonstruowane suche NP insuliny inkubowano w różnych buforach (pH = 2,5, 6,6, 7,0) w temperaturze 37 °C, symulując środowisko pH żołądka, dwunastnicy i górnej części jelita cienkiego, aby zbadać wpływ insuliny na insulinooporność. Zachowanie uwalniania w różnych środowiskach. Fragment przewodu pokarmowego. Przy pH = 2,5 naładowane insuliną NP i resolubilizowane suche NP insuliny wykazały początkowe gwałtowne uwalnianie w ciągu pierwszej godziny, a następnie powolne uwalnianie w ciągu następnych 5 godzin (rys. 5d). To szybkie uwalnianie na początku jest najprawdopodobniej wynikiem szybkiej desorpcji powierzchni cząsteczek białka, które nie są całkowicie unieruchomione w wewnętrznej strukturze cząstki. Przy pH = 6,5 naładowane insuliną NP i zrekonstruowane suche NP insuliny wykazały gładkie i powolne uwalnianie w ciągu 6 godzin, ponieważ pH roztworu testowego było podobne do pH roztworu przygotowanego z NP (rys. 5e). Przy pH = 7 NP były niestabilne i prawie całkowicie rozłożyły się w ciągu pierwszych dwóch godzin (rys. 5f). Dzieje się tak, ponieważ deprotonacja chitozanu zachodzi przy wyższym pH, co skutkuje mniej zwartą siecią polimerową i uwolnieniem naładowanej insuliny.
Co więcej, rozpyłowo suszone NP-y insuliny bez mannitolu wykazały szybszy profil uwalniania niż inne odwodnione NP-y (ryc. 5d–f). Jak opisano wcześniej, odtworzone NP-y insuliny suszone bez mannitolu wykazały najmniejszy rozmiar cząsteczek. Małe cząsteczki zapewniają większą powierzchnię, więc większość odpowiedniego leku będzie znajdować się na powierzchni cząsteczki lub w jej pobliżu, co skutkuje szybkim uwalnianiem leku26.
Cytotoksyczność nanocząstek badano za pomocą testu MTT. Jak pokazano na rysunku S4, stwierdzono, że wszystkie odwodnione nanocząstki nie mają istotnego wpływu na żywotność komórek przy stężeniach 50–500 μg/ml, co sugeruje, że wszystkie odwodnione nanocząstki można bezpiecznie stosować w celu osiągnięcia okna terapeutycznego.
Wątroba jest głównym narządem, przez który insulina wykonuje swoje funkcje fizjologiczne. Komórki HepG2 to linia komórek ludzkiego wątrobiaka powszechnie stosowana jako model wychwytu hepatocytów in vitro. W tym przypadku komórki HepG2 zostały użyte do oceny wychwytu komórkowego nanocząstek odwodnionych metodą liofilizacji i suszenia rozpyłowego. Wychwyt komórkowy metodą konfokalnego skanowania laserowego z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i wizji po kilku godzinach inkubacji z wolną insuliną FITC o stężeniu 25 μg/ml, świeżo przygotowanymi nanocząstkami obciążonymi insuliną FITC i odwodnionymi nanocząstkami obciążonymi insuliną FITC o równych stężeniach insuliny. Przeprowadzono obserwacje mikroskopii ilościowej (CLSM). Liofilizowane nanocząstki bez mannitolu uległy zniszczeniu podczas odwodnienia i nie były oceniane w tym teście. Intensywność fluorescencji wewnątrzkomórkowej świeżo przygotowanych nanocząstek obciążonych insuliną, liofilizowanych nanocząstek obciążonych mannitolem oraz suszonych rozpyłowo nanocząstek z mannitolem i bez mannitolu (Rys. 6a) były odpowiednio 4,3, 2,6, 2,4 i 4,1 razy wyższe niż w grupie insuliny wolnej.FITC-insulina (Rys. 6b). Wyniki te sugerują, że insulina w kapsułkach jest skuteczniejsza w wychwycie komórkowym niż insulina wolna, głównie ze względu na mniejszy rozmiar nanocząsteczek zawierających insulinę wytworzonych w badaniu.
Wychwytywanie insuliny przez komórki HepG2 po 4 godzinach inkubacji ze świeżo przygotowanymi NP i odwodnionymi NP: (a) Dystrybucja wychwytu insuliny FITC przez komórki HepG2.(b) Średnia geometryczna intensywności fluorescencji analizowanej metodą cytometrii przepływowej (n = 3), *P < 0,05 w porównaniu z insuliną wolną.
Podobnie obrazy CLSM wykazały, że intensywność fluorescencji FITC świeżo przygotowanych nanocząstek naładowanych insuliną FITC i nanocząstek suszonych rozpyłowo nanocząstek naładowanych insuliną FITC (bez mannitolu) była znacznie wyższa niż w przypadku pozostałych próbek (ryc. 6a). Ponadto, wraz z dodatkiem mannitolu, wyższa lepkość roztworu zwiększyła odporność na wychwyt komórkowy, co skutkowało zmniejszeniem proliferacji insuliny. Wyniki te sugerują, że nanocząstki suszone rozpyłowo bez mannitolu wykazywały najwyższą wydajność wychwytu komórkowego, ponieważ ich rozmiar cząsteczek był mniejszy niż w przypadku nanocząstek liofilizowanych po ponownym rozpuszczeniu.
Chitozan (średnia masa cząsteczkowa 100 kDa, deacetylowany w 75–85%) zakupiono w firmie Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Trójpolifosforan sodu (TPP) zakupiono w firmie VWR (Radnor, Pensylwania, USA). Rekombinowaną insulinę ludzką użytą w tym badaniu otrzymano w firmie Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Insulinę ludzką znakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) oraz dwuchlorowodorek 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) zakupiono w firmie Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanada). Linię komórkową HepG2 uzyskano z ATCC (Manassas, Wirginia, USA). Wszystkie pozostałe odczynniki były klasy analitycznej lub chromatograficznej.
Przygotuj roztwór CS o stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając go w podwójnie destylowanej wodzie (DD wodzie) zawierającej 0,1% kwasu octowego. Przygotuj roztwory TPP i insuliny o stężeniu 1 mg/ml, rozpuszczając je odpowiednio w wodzie DD i 0,1% kwasie octowym. Wstępną emulsję przygotowano za pomocą homogenizatora wysokoobrotowego Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Proces przygotowania jest następujący: najpierw 2 ml roztworu TPP dodano do 4 ml roztworu insuliny i mieszaninę mieszano przez 30 minut, aż do całkowitego wymieszania. Następnie zmieszany roztwór dodano kroplami do roztworu CS za pomocą strzykawki, mieszając z dużą prędkością (10 000 obr./min). Mieszaninę mieszano z dużą prędkością (15 000 obr./min) w łaźni lodowej przez 30 minut, a następnie doprowadzono jej pH do określonego poziomu, aby uzyskać usieciowane cząsteczki insuliny. Aby dalej homogenizować i zmniejszyć wielkość cząstek insuliny Nanocząstki poddano działaniu ultradźwięków przez dodatkowe 30 minut w kąpieli lodowej przy użyciu ultradźwiękowego urządzenia sondującego (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Niemcy).
NPS insuliny badano pod kątem średniej średnicy Z, indeksu polidyspersyjności (PDI) i potencjału zeta, stosując pomiary dynamicznego rozpraszania światła (DLS) przy użyciu Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) poprzez rozcieńczenie ich w wodzie DD w temperaturze 25°C. Morfologię i rozkład wielkości scharakteryzowano za pomocą mikroskopu elektronowego transmisyjnego (TEM) Hitachi H7600 (Hitachi, Tokio, Japonia), a obrazy następnie analizowano za pomocą oprogramowania do obrazowania Hitachi (Hitachi, Tokio, Japonia). Aby ocenić wydajność enkapsulacji (EE) i pojemność ładowania (LC) NP insuliny, NP pipetowano do probówek ultrafiltracyjnych o odcięciu masy cząsteczkowej 100 kDa i wirowano przy 500 x g przez 30 min. Niekapsułkowaną insulinę w filtracie ilościowo oznaczano przy użyciu systemu Agilent 1100 Series HPLC (Agilent, Santa Clara, Kalifornia, USA) składającego się z pompa czwartorzędowa, autosampler, grzałka kolumny i detektor DAD.Insulinę analizowano za pomocą kolumny C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) i wykrywano przy 214 nm.Fazę ruchomą stanowił acetonitryl i woda, zawierające 0,1% TFA, gradient od 10/90 do 100/0, a urządzenie pracowało przez 10 minut.Fazę ruchomą pompowano z szybkością przepływu 1,0 ml/min.Temperaturę kolumny ustawiono na 20 °C.Oblicz procenty EE i LC, korzystając z równań.(1) i równania(2).
W celu optymalizacji NP insuliny przetestowano różne stosunki CS/insulina w zakresie od 2,0 do 4,0. Podczas przygotowywania dodawano różne ilości roztworu CS, utrzymując stałą mieszaninę insuliny/TPP. NP insuliny przygotowywano w zakresie pH od 4,0 do 6,5, starannie kontrolując pH mieszaniny po dodaniu wszystkich roztworów (insuliny, TPP i CS). EE i wielkość cząstek nanocząsteczek insuliny oceniano przy różnych wartościach pH i stosunkach masy CS/insuliny w celu optymalizacji tworzenia NP insuliny.
Zoptymalizowane NP insuliny umieszczono na aluminiowym pojemniku i przykryto bibułką przymocowaną taśmą. Następnie zakręcone pojemniki umieszczono w liofilizatorze Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) wyposażonym w suszarkę tacową. Temperaturę i ciśnienie próżni ustawiono na -10°C, 0,350 Torr przez pierwsze 2 godziny i 0°C i 0,120 Torr przez pozostałe 22 godziny z 24 godzin, aby uzyskać suche NP insuliny.
Do wytworzenia insuliny w kapsułkach użyto suszarki rozpyłowej Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Szwajcaria). Wybrane parametry suszenia to: temperatura 100 °C, przepływ wsadu 3 l/min i przepływ gazu 4 l/min.
Cząsteczki insuliny przed i po odwodnieniu scharakteryzowano przy użyciu spektroskopii FTIR-ATR. Odwodnione nanocząsteczki, a także wolną insulinę i chitozan analizowano przy użyciu spektrofotometru Spectrum 100 FTIR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) wyposażonego w uniwersalny zestaw do pobierania próbek ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Średnie sygnały uzyskano z 16 skanów o rozdzielczości 4 cm2 w zakresie częstotliwości 4000–600 cm2.
Morfologię suchych cząstek insuliny oceniano na podstawie obrazów SEM liofilizowanych i suszonych rozpyłowo cząstek insuliny, uzyskanych za pomocą mikroskopu elektronowego skaningowego z wiązką jonów (FIB-SEM) Helios NanoLab 650 (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Głównymi parametrami były napięcie 5 keV i natężenie prądu 30 mA.
Wszystkie odwodnione NP insuliny rozpuszczono ponownie w wodzie destylowanej. Wielkość cząstek, PDI, EE i LC zbadano ponownie tą samą metodą, o której mowa wcześniej, aby ocenić ich jakość po odwodnieniu. Stabilność NP anhydroinsuliny mierzono również poprzez badanie właściwości NP po dłuższym przechowywaniu. W tym badaniu wszystkie NP po odwodnieniu przechowywano w lodówce przez trzy miesiące. Po trzech miesiącach przechowywania NP zbadano pod kątem morfologicznej wielkości cząstek, PDI, EE i LC.
Rozpuścić 5 ml zrekonstruowanych NP w 45 ml płynu symulującego sok żołądkowy (pH 1,2, zawierający 1% pepsyny), płyn jelitowy (pH 6,8, zawierający 1% trypsyny) lub roztwór chymotrypsyny (100 g/ml, w buforze fosforanowym, pH 7,8), aby ocenić skuteczność insuliny w ochronie NP po odwodnieniu. Inkubowano je w temperaturze 37°C przy prędkości mieszania 100 obr./min. 500 μl roztworu zebrano w różnych punktach czasowych, a stężenie insuliny określono metodą HPLC.
Zachowanie uwalniania in vitro świeżo przygotowanych i odwodnionych NP insuliny zostało przetestowane metodą worka dializacyjnego (punkt odcięcia masy cząsteczkowej 100 kDa, Spectra Por Inc.). Świeżo przygotowane i odtworzone suche NP dializowano w płynach o pH 2,5, pH 6,6 i pH 7,0 (0,1 M buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej, PBS), aby symulować środowisko pH żołądka, dwunastnicy i górnej części jelita cienkiego. Wszystkie próbki inkubowano w temperaturze 37 °C z ciągłym wstrząsaniem z prędkością 200 obr./min. Odsysaj płyn poza 5 ml workiem dializacyjnym w następujących momentach: 0,5, 1, 2, 3, 4 i 6 h, a następnie natychmiast uzupełnij objętość świeżym dializatem. Zanieczyszczenie insuliną w płynie zostało przeanalizowane metodą HPLC, a szybkość uwalniania insuliny z nanocząsteczek została obliczona na podstawie stosunku uwolnionej wolnej insuliny do całkowitej insuliny zamknięte w nanocząsteczkach (równanie 3).
Linię komórek ludzkiego raka wątrobowokomórkowego HepG2 hodowano w naczyniach o średnicy 60 mm w podłożu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającym 10% surowicy płodowej bydlęcej, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny29. Hodowle prowadzono w temperaturze 37°C, przy wilgotności względnej 95% i 5% CO2. Do badań wychwytu komórki HepG2 wysiewano w gęstości 1 × 105 komórek/ml na 8-dołkowe szkiełka mikroskopowe Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, NY, USA). Do badań cytotoksyczności wysiewano je na 96-dołkowe płytki (Corning, NY, USA) w gęstości 5 × 104 komórek/ml.
Test MTT został użyty do oceny cytotoksyczności świeżo przygotowanych i odwodnionych NPs30. Komórki HepG2 wysiewano na płytkach 96-dołkowych w gęstości 5 × 104 komórek/ml i hodowano przez 7 dni przed badaniem. NPs rozcieńczano do różnych stężeń (50 do 500 μg/ml) w podłożu hodowlanym, a następnie podawano komórkom. Po 24 godzinach inkubacji komórki przemywano 3-krotnie PBS i inkubowano z podłożem zawierającym 0,5 mg/ml MTT przez kolejne 4 godziny. Cytotoksyczność oceniano, mierząc enzymatyczną redukcję żółtego tetrazolium MTT do fioletowego formazanu przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika płytek spektrofotometru Tecan Infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, Szwajcaria).
Wydajność wychwytu komórkowego nanocząstek została sprawdzona za pomocą konfokalnej mikroskopii skaningowej laserowej i analizy cytometrii przepływowej. Każdy dołek systemu szkiełek komorowych Nunc Lab-Tek został potraktowany wolną insuliną FITC, nanocząstkami napełnionymi insuliną FITC i zrekonstytuowany 25 μg/ml odwodnionych nanocząstek nanocząstek FITC w tym samym stężeniu i inkubowany przez 4 godziny. Komórki przemyto 3 razy PBS i utrwalono 4% paraformaldehydem. Jądra komórkowe barwiono 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI). Lokalizację insuliny obserwowano za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego laserowego/dwufotonowego Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japonia). Do analizy cytometrii przepływowej zastosowano te same stężenia 10 μg/ml wolnej insuliny FITC i nanocząstek nanocząstek FITC Nanocząstki i ponownie rozpuszczone, odwodnione nanocząstki insuliny FITC dodano do płytek 96-dołkowych zasianych komórkami HepG2 i inkubowano przez 4 godziny. Po 4 godzinach inkubacji komórki usunięto i przemyto 3 razy FBS. 5 × 104 komórek na próbkę analizowano za pomocą cytometru przepływowego BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Stany Zjednoczone).
Wszystkie wartości wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe. Porównania między wszystkimi grupami oceniono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji lub testu t za pomocą oprogramowania IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, Nowy Jork, USA), a wartość p < 0,05 uznano za statystycznie istotną.
W niniejszym badaniu wykazano elastyczność i zdolność suszenia rozpyłowego do odwadniania usieciowanych nanocząstek chitozanu/TPP/insuliny z lepszą rekonstytucją w porównaniu ze standardowymi metodami liofilizacji z wykorzystaniem wypełniaczy lub krioochronnych środków o wysokiej pojemności i wyższej ładowności. Zoptymalizowane nanocząstki insuliny dały średnią wielkość cząstek 318 nm i wydajność enkapsulacji 99,4%. Wyniki SEM i FTIR po odwodnieniu wykazały, że struktura kulista została zachowana tylko w suszonych rozpyłowo NP z mannitolem i bez niego oraz liofilizowanych z mannitolem, ale liofilizowane NP bez mannitolu uległy rozkładowi podczas odwodnienia. W teście zdolności do rekonstytucji, nanocząstki insuliny suszone rozpyłowo bez mannitolu wykazały najmniejszą średnią wielkość cząstek i najwyższe obciążenie po rekonstytucji. Zachowania uwalniania wszystkich tych odwodnionych NP wykazały, że zostały one szybko uwolnione w roztworach o pH = 2,5 i pH = 7 i bardzo stabilne w roztworze pH = 6,5. W porównaniu z innymi rozpuszczonymi odwodnionymi NP, NP suszone rozpyłowo bez mannitolu wykazały najszybsze uwalnianie. Wynik ten jest zgodny z wynikami zaobserwowanymi w teście wychwytu komórkowego, ponieważ NP suszone rozpyłowo bez mannitolu prawie całkowicie zachowały wydajność wychwytu komórkowego świeżo przygotowanych NP. Wyniki te sugerują, że suche nanocząsteczki insuliny przygotowane metodą suszenia rozpyłowego bez dodatku mannitolu są najbardziej odpowiednie do dalszego przetwarzania w inne bezwodne formy dawkowania, takie jak tabletki doustne lub bioadhezyjne folie.
Ze względu na kwestie związane z własnością intelektualną, zestawy danych wygenerowane i/lub analizowane w ramach niniejszego badania nie są publicznie dostępne, lecz można je uzyskać u odpowiednich autorów na uzasadnione żądanie.
Kagan, A. Cukrzyca typu 2: podłoże społeczne i naukowe, powikłania medyczne oraz implikacje dla pacjentów i innych osób. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. i Jiang, P. Rozwój kapsułek insuliny: czy podawanie doustne jest teraz możliwe? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. i Dass, CR Najnowsze postępy w doustnych systemach dostarczania liposomów z insuliną w leczeniu cukrzycy.Interpretacja.J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).