Artykuł jest częścią tematu badawczego „Poprawa odporności roślin strączkowych na patogeny i szkodniki”, zobacz wszystkie 5 artykułów
Czynnik wywołujący nekrozę grzybiczą roślin, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, wykorzystuje wielopoziomową strategię infekowania różnych roślin żywicielskich. W niniejszym badaniu zaproponowano zastosowanie diaminowej L-ornityny, aminokwasu niebiałkowego, który stymuluje syntezę innych niezbędnych aminokwasów, jako alternatywnej strategii postępowania w celu wzmocnienia molekularnej, fizjologicznej i biochemicznej odpowiedzi Phaseolus vulgaris L. na białą pleśń wywoływaną przez Pseudomonas sclerotiorum. Eksperymenty in vitro wykazały, że L-ornityna znacząco hamowała wzrost grzybni S. pyrenoidosa w sposób zależny od dawki. Ponadto, mogła znacząco zmniejszyć nasilenie białej pleśni w warunkach szklarniowych. Co więcej, L-ornityna stymulowała wzrost traktowanych roślin, co wskazuje, że testowane stężenia L-ornityny nie były fitotoksyczne dla traktowanych roślin. Ponadto L-ornityna zwiększyła ekspresję przeciwutleniaczy nieenzymatycznych (całkowitej zawartości rozpuszczalnych związków fenolowych i flawonoidów) oraz przeciwutleniaczy enzymatycznych (katalazy (CAT), peroksydazy (POX) i oksydazy polifenolowej (PPO)), a także zwiększyła ekspresję trzech genów związanych z przeciwutleniaczami (PvCAT1, PvSOD i PvGR). Ponadto analiza in silico wykazała obecność potencjalnego białka acetylohydrolazy szczawiooctanu (SsOAH) w genomie S. sclerotiorum, które pod względem analizy funkcjonalnej, konserwatywnych domen i topologii było bardzo podobne do białek acetylohydrolazy szczawiooctanu (SsOAH) z Aspergillus fijiensis (AfOAH) i Penicillium sp. (PlOAH). Co ciekawe, dodatek L-ornityny do pożywki z bulionu ziemniaczanego z dekstrozą (PDB) znacząco zmniejszył ekspresję genu SsOAH w grzybni S. sclerotiorum. Podobnie, egzogenne podanie L-ornityny znacząco zmniejszyło ekspresję genu SsOAH w grzybni grzybów pobranych z roślin poddanych działaniu środka. Wreszcie, podanie L-ornityny znacząco zmniejszyło wydzielanie kwasu szczawiowego zarówno w pożywce PDB, jak i w zainfekowanych liściach. Podsumowując, L-ornityna odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu równowagi redoks, a także wzmacnianiu odpowiedzi obronnej zainfekowanych roślin. Wyniki niniejszego badania mogą pomóc w opracowaniu innowacyjnych, przyjaznych dla środowiska metod zwalczania białej pleśni i ograniczania jej wpływu na produkcję fasoli i innych upraw.
Biała pleśń, wywoływana przez nekrotroficzny grzyb Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, to wyniszczająca choroba, która ogranicza plony i stanowi poważne zagrożenie dla globalnej produkcji fasoli (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton i in., 2006). Sclerotinia sclerotiorum jest jednym z najtrudniejszych do zwalczania grzybowych patogenów roślinnych przenoszonych przez glebę, z szerokim spektrum żywicieli obejmującym ponad 600 gatunków roślin i zdolnością do szybkiej maceracji tkanek żywiciela w sposób niespecyficzny (Liang i Rollins, 2018). W niesprzyjających warunkach przechodzi krytyczną fazę swojego cyklu życiowego, pozostając uśpionym przez długi czas w postaci czarnych, twardych, nasiennych struktur zwanych „sklerocjami” w glebie lub jako białe, puszyste narośla w grzybni lub rdzeniu łodygi zakażonych roślin (Schwartz i in., 2005). S. sclerotiorum jest zdolny do tworzenia sklerocji, co pozwala mu przetrwać na zakażonych polach przez długi czas i przetrwać chorobę (Schwartz i in., 2005). Sklerocje są bogate w składniki odżywcze, mogą przetrwać w glebie przez długi czas i służą jako pierwotne inokulum dla kolejnych infekcji (Schwartz i in., 2005). W sprzyjających warunkach sklerocje kiełkują i wytwarzają unoszące się w powietrzu zarodniki, które mogą zainfekować wszystkie nadziemne części rośliny, w tym między innymi kwiaty, łodygi i strąki (Schwartz i in., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum stosuje wielopoziomową strategię infekowania roślin żywicielskich, obejmującą serię skoordynowanych procesów, od kiełkowania sklerocjalnego do rozwoju objawów. Początkowo S. sclerotiorum wytwarza zawieszone zarodniki (askospory) z grzybowatych struktur zwanych apotecjami, które unoszą się w powietrzu i rozwijają się w nieruchome sklerocja na zakażonych resztkach roślinnych (Bolton i in., 2006). Grzyb wydziela następnie kwas szczawiowy, czynnik wirulencji, który kontroluje pH ścian komórkowych roślin, promuje degradację enzymatyczną i inwazję tkanek (Hegedus i Rimmer, 2005) oraz hamuje eksplozję oksydacyjną rośliny żywicielskiej. Ten proces zakwaszenia osłabia ścianę komórkową roślin, zapewniając sprzyjające środowisko dla prawidłowego i efektywnego działania enzymów degradujących ściany komórkowe grzybów (CWDE), umożliwiając patogenowi pokonanie bariery fizycznej i penetrację tkanek żywiciela (Marciano i in., 1983). Po wniknięciu do organizmu S. sclerotiorum wydziela szereg CWDE, takich jak poligalakturonaza i celulaza, które ułatwiają jego rozprzestrzenianie się w zakażonych tkankach i powodują martwicę tkanek. Rozwój zmian i zlepów strzępkowych prowadzi do charakterystycznych objawów białej pleśni (Hegedus i Rimmer, 2005). Rośliny żywicielskie rozpoznają wzorce molekularne związane z patogenem (PAMP) poprzez receptory rozpoznające wzorce (PRR), uruchamiając serię zdarzeń sygnałowych, które ostatecznie aktywują reakcje obronne.
Pomimo dziesięcioleci wysiłków w zakresie zwalczania chorób, w fasoli, podobnie jak w innych uprawach komercyjnych, nadal brakuje odpowiedniej, odpornej plazmy zarodkowej, ze względu na odporność, przeżywalność i zdolność adaptacji patogenu. Zwalczanie chorób jest zatem niezwykle trudne i wymaga zintegrowanej, wielopłaszczyznowej strategii, obejmującej połączenie praktyk uprawowych, kontroli biologicznej i chemicznych fungicydów (O'Sullivan i in., 2021). Chemiczna kontrola białej pleśni jest najskuteczniejsza, ponieważ fungicydy, stosowane prawidłowo i we właściwym czasie, mogą skutecznie kontrolować rozprzestrzenianie się choroby, zmniejszać nasilenie infekcji i minimalizować straty plonów. Jednak nadużywanie i nadmierne poleganie na fungicydach może prowadzić do pojawienia się opornych szczepów S. sclerotiorum i negatywnie wpływać na organizmy niebędące celem ataku, zdrowie gleby i jakość wody (Le Cointe i in., 2016; Ceresini i in., 2024). Dlatego znalezienie przyjaznych dla środowiska alternatyw stało się priorytetem.
Poliaminy (PA), takie jak putrescyna, spermidyna, spermina i kadaweryna, mogą stanowić obiecującą alternatywę w walce z patogenami roślinnymi przenoszonymi przez glebę, całkowicie lub częściowo ograniczając stosowanie niebezpiecznych fungicydów chemicznych (Nehela i in., 2024; Yi i in., 2024). U roślin wyższych PA biorą udział w wielu procesach fizjologicznych, w tym między innymi w podziale komórek, różnicowaniu oraz reakcji na stres abiotyczny i biotyczny (Killiny i Nehela, 2020). Mogą działać jako przeciwutleniacze, pomagać w usuwaniu reaktywnych form tlenu (ROS), utrzymywać homeostazę redoks (Nehela i Killiny, 2023), indukować geny związane z obroną (Romero i in., 2018), regulować różne szlaki metaboliczne (Nehela i Killiny, 2023), modulować endogenne fitohormony (Nehela i Killiny, 2019), ustanawiać systemową nabytą odporność (SAR) oraz regulować interakcje roślina-patogen (Nehela i Killiny, 2020; Asija i in., 2022; Czerwoniec, 2022). Warto zauważyć, że specyficzne mechanizmy i role PA w obronie roślin różnią się w zależności od gatunku rośliny, patogenów i warunków środowiskowych. Najliczniej występujący PA w roślinach jest biosyntetyzowany z niezbędnej poliaminy L-ornityny (Killiny i Nehela, 2020).
L-ornityna odgrywa wieloraką rolę we wzroście i rozwoju roślin. Na przykład, wcześniejsze badania wykazały, że w ryżu (Oryza sativa) ornityna może być związana z recyklingiem azotu (Liu i in., 2018), plonem ryżu, jego jakością i aromatem (Lu i in., 2020) oraz reakcją na stres wodny (Yang i in., 2000). Ponadto, egzogenne podawanie L-ornityny znacząco zwiększyło tolerancję na suszę u buraków cukrowych (Beta vulgaris) (Hussein i in., 2019) oraz złagodziło stres solny u cebuli (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu i Çavuşoǧlu, 2021) i nerkowca (Anacardium occidentale) (da Rocha i in., 2012). Potencjalna rola L-ornityny w obronie przed stresem abiotycznym może wynikać z jej udziału w akumulacji proliny w traktowanych roślinach. Na przykład, geny związane z metabolizmem proliny, takie jak geny ornityny delta aminotransferazy (delta-OAT) i dehydrogenazy proliny (ProDH1 i ProDH2), były wcześniej zgłaszane jako zaangażowane w obronę Nicotiana benthamiana i Arabidopsis thaliana przed szczepami Pseudomonas syringae niebędącymi żywicielami (Senthil-Kumar i Mysore, 2012). Z drugiej strony, grzybicza dekarboksylaza ornityny (ODC) jest niezbędna do wzrostu patogenów (Singh i in., 2020). Celowanie w ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici poprzez wyciszanie genów indukowane przez żywiciela (HIGS) znacząco zwiększyło odporność roślin pomidora na więdnięcie fuzaryjne (Singh i in., 2020). Jednak potencjalna rola egzogennego stosowania ornityny przeciwko stresom biotycznym, takim jak fitopatogeny, nie została dobrze zbadana. Co ważniejsze, wpływ ornityny na odporność na choroby oraz związane z tym zjawiska biochemiczne i fizjologiczne wciąż pozostaje w dużej mierze niezbadany.
Zrozumienie złożoności infekcji roślin strączkowych przez S. sclerotiorum jest istotne dla opracowania skutecznych strategii kontroli. W niniejszym badaniu staraliśmy się zidentyfikować potencjalną rolę diaminy L-ornityny jako kluczowego czynnika wzmacniającego mechanizmy obronne i odporność roślin strączkowych na infekcję Sclerotinia sclerotiorum. Postawiliśmy hipotezę, że oprócz wzmocnienia reakcji obronnych zainfekowanych roślin, L-ornityna odgrywa również kluczową rolę w utrzymaniu statusu redoks. Sugerujemy, że potencjalne działanie L-ornityny wiąże się z regulacją enzymatycznych i nieenzymatycznych mechanizmów obrony antyoksydacyjnej oraz interferencją z czynnikami patogeniczności/wirulencji grzybów i powiązanymi białkami. Ta podwójna funkcjonalność L-ornityny czyni ją obiecującym kandydatem na zrównoważoną strategię łagodzenia wpływu białej pleśni i zwiększania odporności powszechnych upraw roślin strączkowych na ten silny patogen grzybowy. Wyniki niniejszego badania mogą pomóc w opracowaniu innowacyjnych, przyjaznych dla środowiska metod zwalczania białej pleśni i ograniczania jej wpływu na produkcję roślin strączkowych.
W niniejszym badaniu, jako materiał doświadczalny wykorzystano podatną odmianę komercyjną fasoli zwyczajnej Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Zdrowe nasiona zostały uprzejmie dostarczone przez Dział Badań Roślin Strączkowych, Instytut Badań nad Roślinami Polowymi (FCRI), Centrum Badań Rolniczych (ARC) w Egipcie. Pięć nasion wysiano do plastikowych doniczek (średnica wewnętrzna 35 cm, głębokość 50 cm) wypełnionych glebą zakażoną S. sclerotiorum w warunkach szklarniowych (25 ± 2 °C, wilgotność względna 75 ± 1%, 8 h światła/16 h ciemności). Po 7–10 dniach od siewu (DPS) sadzonki przerwano, pozostawiając w każdej doniczce tylko dwie sadzonki o równomiernym wzroście i trzech w pełni rozwiniętych liściach. Wszystkie rośliny w doniczkach podlewano raz na dwa tygodnie i nawożono co miesiąc w dawce zalecanej dla danej odmiany.
Aby przygotować stężenie L-ornitynodiaminy (znanej również jako kwas (+)-(S)-2,5-diaminopentanowy; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy) wynoszące 500 mg/l, najpierw rozpuszczono 50 mg w 100 ml sterylnej wody destylowanej. Następnie roztwór macierzysty rozcieńczono i wykorzystano w kolejnych eksperymentach. W skrócie, przetestowano in vitro sześć serii stężeń L-ornityny (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/l). Dodatkowo, jako kontrolę negatywną (próbną) zastosowano sterylną wodę destylowaną, a jako kontrolę pozytywną zastosowano komercyjny fungicyd „Rizolex-T” w stężeniu 50% (toklofos metylowy 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gubernatorstwo Gharbia, Egipt). Komercyjny fungicyd „Rizolex-T” testowano in vitro w pięciu stężeniach (2, 4, 6, 8 i 10 mg/l).
Próbki łodyg i strąków fasoli zwyczajnej wykazujące typowe objawy białej pleśni (stopień porażenia: 10–30%) pobrano z gospodarstw komercyjnych. Chociaż większość zakażonych materiałów roślinnych zidentyfikowano według gatunku/odmiany (podatna odmiana handlowa Giza 3), inne, zwłaszcza te pozyskane z lokalnych rynków, były nieznanego gatunku. Zebrane zakażone materiały najpierw zdezynfekowano powierzchniowo 0,5% roztworem podchlorynu sodu przez 3 minuty, a następnie kilkakrotnie przepłukano sterylną wodą destylowaną i osuszono sterylną bibułą filtracyjną w celu usunięcia nadmiaru wody. Zakażone organy pocięto następnie na małe kawałki z tkanki środkowej (pomiędzy tkanką zdrową a zakażoną), hodowano na agarze ziemniaczano-dekstrozowym (PDA) i inkubowano w temperaturze 25 ± 2 °C z cyklem 12 godzin światła/12 godzin ciemności przez 5 dni w celu stymulacji tworzenia sklerocji. Metodę grzybni zastosowano również do oczyszczania izolatów grzybów z mieszanych lub zanieczyszczonych kultur. Oczyszczony izolat grzyba został najpierw zidentyfikowany na podstawie jego cech morfologicznych, a następnie potwierdzono, że jest to S. sclerotiorum na podstawie cech mikroskopowych. Na koniec wszystkie oczyszczone izolaty zostały przebadane pod kątem patogeniczności na podatnej odmianie fasoli zwyczajnej Giza 3, aby spełnić założenia Kocha.
Ponadto, najbardziej inwazyjny izolat S. sclerotiorum (izolat nr 3) został dodatkowo potwierdzony sekwencjonowaniem metodą wewnętrznego transkrybowanego odstępnika (ITS), zgodnie z opisem White i in., 1990; Baturo-Ciesniewska i in., 2017. W skrócie, izolaty hodowano w bulionie ziemniaczano-dekstrozowym (PDB) i inkubowano w temperaturze 25 ± 2°C przez 5–7 dni. Następnie zebrano grzybnię grzyba, przefiltrowano przez gazę, przemyto dwukrotnie sterylną wodą i wysuszono sterylną bibułą filtracyjną. Genomowe DNA wyizolowano za pomocą zestawu Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah i in., 2022, 2024). Region ITS rDNA został następnie amplifikowany przy użyciu specyficznej pary starterów ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; oczekiwana wielkość: 540 pb) (Baturo-Ciesniewska i in., 2017). Oczyszczone produkty PCR poddano sekwencjonowaniu (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Sekwencje ITS rDNA sekwencjonowano dwukierunkowo przy użyciu metody sekwencjonowania Sangera. Zebrane sekwencje zapytań porównano następnie z najnowszymi danymi z GenBank i Narodowego Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) przy użyciu oprogramowania BLASTn. Sekwencję zapytania porównano z 20 innymi szczepami/izolatami S. sclerotiorum pobranymi z najnowszych danych w NCBI GenBank (Supplementary Table S1) przy użyciu ClustalW z pakietu Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; wersja 11) (Kumar i in., 2024). Analizę ewolucyjną przeprowadzono przy użyciu metody największego prawdopodobieństwa i ogólnego modelu substytucji nukleotydów odwracalnych w czasie (Nei i Kumar, 2000). Pokazano drzewo o najwyższym logarytmie prawdopodobieństwa. Początkowe drzewo do wyszukiwania heurystycznego jest wybierane poprzez wybranie drzewa o wyższym logarytmie prawdopodobieństwa spośród drzewa sąsiadującego (NJ) (Kumar i in., 2024) i drzewa o maksymalnej parsymonii (MP). Drzewo NJ skonstruowano przy użyciu macierzy odległości parami obliczonej przy użyciu ogólnego modelu odwracalnego w czasie (Nei i Kumar, 2000).
Aktywność przeciwbakteryjną L-ornityny i bakteriobójczego środka „Rizolex-T” oznaczono in vitro metodą dyfuzji w agarze. Metoda: Odpowiednią ilość roztworu macierzystego L-ornityny (500 mg/l) dokładnie wymieszać z 10 ml pożywki PDA, aby przygotować roztwory o stężeniach końcowych odpowiednio 12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/l. Jako kontrolę zastosowano pięć stężeń fungicydu „Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 i 10 mg/l) oraz sterylną wodę destylowaną. Po zestaleniu się podłoża, świeżo przygotowany wałek grzybni Sclerotinia sclerotiorum o średnicy 4 mm przeniesiono na środek szalki Petriego i hodowano w temperaturze 25 ± 2°C, aż grzybnia pokryła całą kontrolną szalkę Petriego. Następnie mierzono wzrost grzyba. Oblicz procentowe zahamowanie wzrostu promieniowego S. sclerotiorum, korzystając z równania 1:
Eksperyment powtórzono dwukrotnie, z sześcioma powtórzeniami biologicznymi dla każdej grupy kontrolnej/eksperymentalnej i pięcioma doniczkami (po dwie rośliny w doniczce) dla każdego powtórzenia biologicznego. Każde powtórzenie biologiczne analizowano dwukrotnie (dwa powtórzenia techniczne), aby zapewnić dokładność, wiarygodność i powtarzalność wyników eksperymentu. Dodatkowo, do obliczenia półmaksymalnego stężenia hamującego (IC50) i IC99 (Prentice, 1976) zastosowano analizę regresji probitowej.
Aby ocenić potencjał L-ornityny w warunkach szklarniowych, przeprowadzono dwa kolejne eksperymenty w doniczkach. W skrócie, doniczki wypełniono sterylną glebą gliniasto-piaskową (3:1) i zaszczepiono świeżo przygotowaną kulturą S. sclerotiorum. Najpierw wyhodowano najbardziej inwazyjny izolat S. sclerotiorum (izolat nr 3), przecinając jedno sklerotium na pół, umieszczając je na PDA stroną do dołu i inkubując w temperaturze 25°C w ciągłej ciemności (24 h) przez 4 dni w celu stymulacji wzrostu grzybni. Następnie pobrano cztery 5 mm wkładki agarowe z przedniej krawędzi i zaszczepiono 100 g sterylnej mieszanki otrębów pszennych i ryżowych (1:1, v/v), a wszystkie kolby inkubowano w temperaturze 25 ± 2°C w cyklu 12 h światła/12 h ciemności przez 5 dni w celu stymulacji tworzenia sklerotium. Zawartość wszystkich kolb dokładnie wymieszano, aby zapewnić jednorodność przed dodaniem gleby. Następnie do każdej doniczki dodano 100 g kolonizującej mieszanki otrębów, aby zapewnić stałe stężenie patogenów. Zaszczepione doniczki podlano w celu pobudzenia wzrostu grzybów i umieszczono w warunkach szklarniowych na 7 dni.
Następnie w każdej doniczce wysiano pięć nasion odmiany Giza 3. W przypadku doniczek traktowanych L-ornityną i fungicydem Rizolex-T, wysterylizowane nasiona moczono najpierw przez dwie godziny w wodnym roztworze dwóch związków o końcowym stężeniu IC99 wynoszącym odpowiednio około 250 mg/l i 50 mg/l, a następnie suszono na powietrzu przez godzinę przed siewem. Z drugiej strony, nasiona moczono w sterylnej wodzie destylowanej jako kontrolę negatywną. Po 10 dniach, przed pierwszym podlewaniem, siewki przerwano, pozostawiając tylko dwie schludne siewki w każdej doniczce. Dodatkowo, aby upewnić się, że infekcja wywołana jest przez S. sclerotiorum, łodygi roślin fasoli w tym samym stadium rozwoju (10 dni) nacięto w dwóch różnych miejscach za pomocą wysterylizowanego skalpela i do każdej rany wprowadzono około 0,5 g kolonizującej mieszanki otrębów, a następnie zapewniono wysoką wilgotność, aby stymulować infekcję i rozwój choroby u wszystkich zaszczepionych roślin. Rośliny kontrolne zraniono w podobny sposób, a następnie do rany wprowadzono taką samą ilość (0,5 g) sterylnej, nieskolonizowanej mieszanki otrębów i utrzymywano ją w warunkach wysokiej wilgotności, aby symulować środowisko sprzyjające rozwojowi choroby i zapewnić spójność między grupami poddanymi leczeniu.
Metoda leczenia: Siewki fasoli podlewano 500 ml wodnego roztworu L-ornityny (250 mg/l) lub fungicydu Rizolex-T (50 mg/l) poprzez nawadnianie gleby, a następnie zabieg powtarzano trzykrotnie w odstępie 10 dni. Kontrole, którym podawano placebo, nawadniano 500 ml sterylnej wody destylowanej. Wszystkie zabiegi wykonywano w warunkach szklarniowych (25 ± 2°C, 75 ± 1% wilgotności względnej i fotoperiod 8 h światła/16 h ciemności). Wszystkie doniczki podlewano co dwa tygodnie i co miesiąc traktowano zrównoważonym nawozem NPK (20-20-20, z 3,6% siarki i mikroelementami TE; Zain Seeds, Egipt) w stężeniu 3–4 g/l poprzez oprysk dolistny zgodnie z zaleceniami dla konkretnej odmiany i instrukcjami producenta. O ile nie zaznaczono inaczej, w pełni rozwinięte, dojrzałe liście (2. i 3. liść od góry) zebrano z każdej replikacji biologicznej 72 godziny po zabiegu (hpt), zhomogenizowano, połączono i przechowywano w temperaturze -80 °C w celu przeprowadzenia dalszych analiz, w tym między innymi histochemicznej lokalizacji in situ wskaźników stresu oksydacyjnego, peroksydacji lipidów, przeciwutleniaczy enzymatycznych i nieenzymatycznych oraz ekspresji genów.
Intensywność zakażenia białą pleśnią oceniano co tydzień 21 dni po inokulacji (dpi) w skali 1–9 (Tabela Uzupełniająca S2) opartej na skali Petzoldta i Dickson (1996) zmodyfikowanej przez Terana i in. (2006). W skrócie, łodygi i gałęzie roślin fasoli badano, rozpoczynając od miejsca inokulacji, aby śledzić postęp zmian wzdłuż międzywęźli i węzłów. Następnie mierzono odległość uszkodzenia od miejsca inokulacji do najdalszego punktu wzdłuż łodygi lub gałęzi i przyznawano ocenę 1–9 na podstawie lokalizacji uszkodzenia, gdzie (1) oznaczało brak widocznego zakażenia w pobliżu miejsca inokulacji, a (2–9) oznaczało stopniowy wzrost rozmiaru uszkodzenia i postęp wzdłuż węzłów/międzywęźli (Tabela Uzupełniająca S2). Intensywność zakażenia białą pleśnią przeliczono następnie na procenty, stosując wzór 2:
Ponadto obszar pod krzywą postępu choroby (AUDPC) obliczono przy użyciu wzoru (Shaner i Finney, 1977), który niedawno dostosowano do białej zgnilizny fasoli zwyczajnej (Chauhan i in., 2020) przy użyciu równania 3:
Gdzie Yi = nasilenie choroby w czasie ti, Yi+1 = nasilenie choroby w następnym czasie ti+1, ti = czas pierwszego pomiaru (w dniach), ti+1 = czas następnego pomiaru (w dniach), n = całkowita liczba punktów czasowych lub punktów obserwacji. Parametry wzrostu roślin fasoli, w tym wysokość rośliny (cm), liczba gałęzi na roślinę i liczba liści na roślinę, rejestrowano co tydzień przez 21 dni we wszystkich powtórzeniach biologicznych.
W każdym powtórzeniu biologicznym próbki liści (drugi i trzeci w pełni rozwinięty liść od góry) pobrano 45. dnia po zabiegu (15 dni po ostatnim zabiegu). Każde powtórzenie biologiczne składało się z pięciu doniczek (dwie rośliny w doniczce). Około 500 mg rozdrobnionej tkanki użyto do ekstrakcji pigmentów fotosyntetycznych (chlorofilu a, chlorofilu b i karotenoidów) przy użyciu 80% acetonu w temperaturze 4°C w ciemności. Po 24 godzinach próbki odwirowano, a supernatant zebrano w celu oznaczenia zawartości chlorofilu a, chlorofilu b i karotenoidów kolorymetrycznie przy użyciu spektrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia) zgodnie z metodą (Lichtenthaler, 1987) poprzez pomiar absorbancji przy trzech różnych długościach fali (A470, A646 i A663 nm). Na koniec zawartość barwników fotosyntetycznych obliczono, korzystając z następujących wzorów 4–6 opisanych przez Lichtenthalera (1987).
Po 72 godzinach od zabiegu (hpt), z każdego powtórzenia biologicznego pobrano liście (drugi i trzeci w pełni rozwinięty liść od góry) w celu histochemicznej lokalizacji in situ nadtlenku wodoru (H2O2) i anionu ponadtlenkowego (O2•−). Każde powtórzenie biologiczne składało się z pięciu doniczek (po dwie rośliny w doniczce). Każde powtórzenie biologiczne analizowano w dwóch powtórzeniach (dwa powtórzenia techniczne), aby zapewnić dokładność, niezawodność i powtarzalność metody. H2O2 i O2•− oznaczano odpowiednio przy użyciu 0,1% 3,3′-diaminobenzydyny (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy) lub nitrobłękitu tetrazolowego (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy), zgodnie z metodami opisanymi przez Romero-Puertas i in. (2004) oraz Adam i in. (1989) z niewielkimi modyfikacjami. W celu histochemicznej lokalizacji H2O2 in situ, płatki poddano próżniowej infiltracji 0,1% DAB w 10 mM buforze Tris (pH 7,8), a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej na świetle przez 60 minut. Płatki wybielono w 0,15% (v/v) TCA w mieszaninie etanolu i chloroformu 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kair, Egipt), a następnie wystawiono na działanie światła do momentu ściemnienia. Podobnie, zastawki poddano próżniowej infiltracji 10 mM buforem fosforanu potasu (pH 7,8) zawierającym 0,1% w/v HBT w celu histochemicznej lokalizacji O2•− in situ. Płatki poddano inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20 minut, następnie wybielono jak powyżej, a następnie naświetlono do momentu pojawienia się ciemnoniebieskich/fioletowych plamek. Intensywność powstałego koloru brązowego (jako wskaźnika H2O2) lub niebieskofioletowego (jako wskaźnika O2•−) oceniano przy użyciu wersji Fiji pakietu do przetwarzania obrazu ImageJ (http://fiji.sc; dostęp 7 marca 2024 r.).
Malondialdehyd (MDA; jako marker peroksydacji lipidów) oznaczano zgodnie z metodą Du i Bramlage (1992) z niewielkimi modyfikacjami. Liście z każdego powtórzenia biologicznego (drugi i trzeci w pełni rozwinięty liść od góry) zebrano 72 godziny po zabiegu (hpt). Każde powtórzenie biologiczne obejmowało pięć doniczek (po dwie rośliny w doniczce). Każde powtórzenie biologiczne analizowano w dwóch powtórzeniach (dwa powtórzenia techniczne), aby zapewnić dokładność, wiarygodność i powtarzalność metody. W skrócie, do ekstrakcji MDA z 20% roztworem kwasu trichlorooctowego (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) zawierającego 0,01% butylowanego hydroksytoluenu (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) użyto 0,5 g zmielonej tkanki liścia. Zawartość MDA w supernatancie oznaczono kolorymetrycznie, mierząc absorbancję przy 532 i 600 nm za pomocą spektrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia), a następnie wyrażono w nmol g−1 FW.
W celu oceny przeciwutleniaczy nieenzymatycznych i enzymatycznych, liście (drugi i trzeci w pełni rozwinięty liść od góry) pobrano z każdego powtórzenia biologicznego po 72 godzinach od zabiegu (hpt). Każde powtórzenie biologiczne składało się z pięciu doniczek (po dwie rośliny w doniczce). Każdą próbkę biologiczną analizowano w dwóch powtórzeniach (dwie próbki techniczne). Dwa liście zmielono ciekłym azotem i wykorzystano bezpośrednio do oznaczenia przeciwutleniaczy enzymatycznych i nieenzymatycznych, całkowitej zawartości aminokwasów, zawartości proliny, ekspresji genów oraz ilościowego oznaczenia szczawianów.
Całkowitą zawartość rozpuszczalnych związków fenolowych oznaczono przy użyciu odczynnika Folina-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) z niewielkimi modyfikacjami metody opisanej przez Kahkonena i in. (1999). W skrócie, około 0,1 g homogenizowanej tkanki liścia ekstrahowano 20 ml 80% metanolu w ciemności przez 24 godziny, a supernatant zebrano po odwirowaniu. 0,1 ml ekstraktu próbki zmieszano z 0,5 ml odczynnika Folina-Ciocalteu (10%), wytrząsano przez 30 sekund i pozostawiono w ciemności na 5 minut. Następnie do każdej probówki dodano 0,5 ml 20% roztworu węglanu sodu (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kair, Egipt), dokładnie wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę. Po inkubacji absorbancję mieszaniny reakcyjnej zmierzono przy długości fali 765 nm za pomocą spektrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia). Stężenie całkowitych rozpuszczalnych fenoli w ekstraktach próbek oznaczono za pomocą krzywej kalibracyjnej kwasu galusowego (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) i wyrażono w miligramach ekwiwalentu kwasu galusowego na gram świeżej masy (mg GAE g-1 świeżej masy).
Całkowitą zawartość rozpuszczalnych flawonoidów oznaczono zgodnie z metodą Djeridane i in. (2006) z niewielkimi modyfikacjami. W skrócie, 0,3 ml powyższego ekstraktu metanolowego zmieszano z 0,3 ml 5% roztworu chlorku glinu (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), energicznie mieszano, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie dodano 0,3 ml 10% roztworu octanu potasu (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kair, Egipt), dokładnie wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji zmierzono absorbancję mieszaniny reakcyjnej przy długości fali 430 nm za pomocą spektrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia). Stężenie wszystkich rozpuszczalnych flawonoidów w ekstraktach próbek określono przy użyciu krzywej kalibracji rutyny (TCI America, Portland, OR, USA), a następnie wyrażono w miligramach ekwiwalentu rutyny na gram świeżej masy (mg RE g-1 świeżej masy).
Całkowitą zawartość wolnych aminokwasów w liściach fasoli oznaczono za pomocą zmodyfikowanego odczynnika ninhydrynowego (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) w oparciu o metodę zaproponowaną przez Yokoyamę i Hiramatsu (2003) oraz zmodyfikowaną przez Sun i in. (2006). W skrócie, 0,1 g zmielonej tkanki ekstrahowano buforem o pH 5,4, a 200 μl supernatantu poddano reakcji z 200 μl ninhydryny (2%) i 200 μl pirydyny (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA). Następnie inkubowano we wrzącej łaźni wodnej przez 30 min, a następnie schłodzono i zmierzono przy długości fali 580 nm za pomocą spektrofotometru UV-160A (Shimadzu Corporation, Japonia). Prolinę oznaczono natomiast metodą Batesa (Bates i in., 1973). Prolinę ekstrahowano 3% kwasem sulfosalicylowym (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA), a po odwirowaniu 0,5 ml supernatantu zmieszano z 1 ml lodowatego kwasu octowego (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) i odczynnikiem ninhydrynowym. Inkubowano w temperaturze 90°C przez 45 minut, schłodzono i zmierzono przy długości fali 520 nm za pomocą tego samego spektrofotometru, co powyżej. Całkowitą zawartość wolnych aminokwasów i proliny w ekstraktach z liści oznaczono odpowiednio za pomocą krzywych kalibracyjnych dla glicyny i proliny (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), wyrażając je w mg/g świeżej masy.
Aby określić aktywność enzymatyczną enzymów antyoksydacyjnych, około 500 mg homogenizowanej tkanki ekstrahowano 3 ml 50 mM buforu Tris (pH 7,8) zawierającego 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 7,5% poliwinylopirolidonu (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), wirowano przy 10 000 × g przez 20 min w lodówce (4 °C), a następnie zebrano supernatant (surowy ekstrakt enzymu) (El-Nagar i in., 2023; Osman i in., 2023). Następnie katalazę (CAT) poddano reakcji z 2 ml 0,1 M buforu fosforanu sodu (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 100 μl 269 mM roztworu H2O2 w celu oznaczenia jej aktywności enzymatycznej zgodnie z metodą Aebi (1984) z niewielkimi modyfikacjami (El-Nagar i in., 2023; Osman i in., 2023). Aktywność enzymatyczną peroksydazy gwajakolozależnej (POX) oznaczono metodą Harrach i in. (2009). (2008) z niewielkimi modyfikacjami (El-Nagar i in., 2023; Osman i in., 2023), a aktywność enzymatyczną polifenoloksydazy (PPO) określono po reakcji z 2,2 ml 100 mM buforu fosforanowego sodu (pH 6,0), 100 μl gwajakolu (TCI Chemicals, Portland, OR, USA) i 100 μl 12 mM H2O2. Metodę nieznacznie zmodyfikowano w stosunku do (El-Nagar i in., 2023; Osman i in., 2023). Test wykonano po reakcji z 3 ml roztworu katecholu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) świeżo przygotowanego w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 6,0). Aktywność CAT mierzono poprzez monitorowanie rozkładu H2O2 przy długości fali 240 nm (A240), aktywność POX mierzono poprzez monitorowanie wzrostu absorbancji przy długości fali 436 nm (A436), a aktywność PPO mierzono poprzez rejestrowanie wahań absorbancji przy długości fali 495 nm (A495) co 30 s przez 3 min przy użyciu spektrofotometru UV-160A (Shimadzu, Japonia).
Do określenia poziomu transkryptów trzech genów związanych z antyoksydantami, w tym katalazy peroksysomalnej (PvCAT1; nr dostępu w GenBank: KF033307.1), dysmutazy ponadtlenkowej (PvSOD; nr dostępu w GenBank: XM_068639556.1) i reduktazy glutationu (PvGR; nr dostępu w GenBank: KY195009.1), wykorzystano metodę RT-PCR w czasie rzeczywistym (real-time RT-PCR). Sekwencje starterów powyższych trzech genów wymieniono w tabeli uzupełniającej S3. Gen PvActin-3 (numer w bazie GenBank: XM_068616709.1) został użyty jako gen goszczący, a względną ekspresję genu obliczono metodą 2-ΔΔCT (Livak i Schmittgen, 2001). Wykazano stabilność aktyny w warunkach stresu biotycznego (niezgodnej interakcji między roślinami strączkowymi a grzybem antraknozowym Colletotrichum lindemuthianum) oraz stresu abiotycznego (susza, zasolenie, niska temperatura) (Borges i in., 2012).
Początkowo przeprowadziliśmy analizę in silico całego genomu białek acetylohydrolazy szczawiooctanu (OAH) w S. sclerotiorum, używając narzędzia białko-białko BLAST (BLASTp 2.15.0+) (Altschul i in., 1997, 2005). W skrócie, wykorzystaliśmy OAH z Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksyda: 1191702; numer dostępu w GenBank XP_040799428.1; 342 aminokwasy) i Penicillium lagena (PlOAH; taksyda: 94218; numer dostępu w GenBank XP_056833920.1; 316 aminokwasów) jako sekwencje zapytania do mapowania homologicznego białka w S. sclerotiorum (taksyda: 5180). Badanie BLASTp przeprowadzono na podstawie najnowszych dostępnych danych dotyczących genomu S. sclerotiorum w bazie GenBank na stronie internetowej Narodowego Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Ponadto, przewidywany gen OAH z S. sclerotiorum (SsOAH) oraz analiza ewolucyjna i drzewo filogenetyczne AfOAH z A. fijiensis CBS 313.89 i PlOAH z P. lagena zostały wywnioskowane za pomocą metody największego prawdopodobieństwa w programie MEGA11 (Tamura i in., 2021) oraz modelu opartego na macierzy JTT (Jones i in., 1992). Drzewo filogenetyczne połączono z analizą wielokrotnych dopasowań sekwencji białkowych wszystkich przewidywanych genów OAH (SsOAH) z S. sclerotiorum oraz sekwencją zapytania za pomocą narzędzia Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos i Agarwala, 2007). Ponadto najlepiej dopasowane sekwencje aminokwasowe SsOAH z S. sclerotiorum zostały wyrównane z sekwencjami zapytania (AfOAH i PlOAH) (Larkin i in., 2007) przy użyciu narzędzia ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), a konserwatywne regiony w wyrównaniu zostały zwizualizowane przy użyciu narzędzia ESPript (wersja 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Ponadto, przewidywane domeny reprezentatywne pod względem funkcjonalnym i konserwatywne miejsca SsOAH S. sclerotiorum zostały interaktywnie sklasyfikowane do różnych rodzin za pomocą narzędzia InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum i in., 2021). Na koniec, trójwymiarowe (3D) modelowanie struktury przewidywanego SsOAH S. sclerotiorum przeprowadzono z wykorzystaniem silnika rozpoznawania homologii/analogii białek (serwer Phyre2 w wersji 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley i in., 2015) i zwalidowano za pomocą serwera SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini i in., 2014). Przewidywane struktury trójwymiarowe (format PDB) wizualizowano interaktywnie przy użyciu pakietu UCSF-Chimera (wersja 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen i in., 2004).
Do określenia poziomu transkrypcji acetylohydrolazy szczawiooctanu (SsOAH; numer w bazie GenBank: XM_001590428.1) w grzybni Sclerotinia sclerotiorum zastosowano ilościową reakcję PCR z fluorescencją w czasie rzeczywistym. W skrócie, S. sclerotiorum zaszczepiono do kolby zawierającej PDB i umieszczono w inkubatorze z wytrząsaniem (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) w temperaturze 25 ± 2°C przez 24 godziny przy 150 obr./min i w ciągłej ciemności (24 godziny), aby stymulować wzrost grzybni. Następnie komórki traktowano L-ornityną i fungicydem Rizolex-T w końcowych stężeniach IC50 (odpowiednio około 40 i 3,2 mg/l), a następnie hodowano przez kolejne 24 godziny w tych samych warunkach. Po inkubacji hodowle wirowano z prędkością 2500 obr./min przez 5 minut, a supernatant (grzybnię) zebrano do analizy ekspresji genów. Podobnie, grzybnię pobrano 0, 24, 48, 72, 96 i 120 godzin po zakażeniu z zainfekowanych roślin, na których powierzchni tkanek wytworzyła się biała pleśń i grzybnia bawełniasta. Z grzybni wyekstrahowano RNA, a następnie zsyntetyzowano cDNA, jak opisano powyżej. Sekwencje starterów dla SsOAH wymieniono w Tabeli Uzupełniającej S3. SsActin (numer w GenBank: XM_001589919.1) został użyty jako gen metabolizmu, a względną ekspresję genu obliczono metodą 2-ΔΔCT (Livak i Schmittgen, 2001).
Kwas szczawiowy oznaczano w bulionie ziemniaczano-dekstrozowym (PDB) oraz próbkach roślin zawierających patogen grzybowy Sclerotinia sclerotiorum zgodnie z metodą Xu i Zhang (2000) z niewielkimi modyfikacjami. W skrócie, izolaty S. sclerotiorum zaszczepiono do kolb zawierających PDB, a następnie hodowano w inkubatorze z wytrząsaniem (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) przy 150 obr./min w temperaturze 25 ± 2 °C przez 3–5 dni w ciągłej ciemności (24 h) w celu stymulacji wzrostu grzybni. Po inkubacji hodowlę grzybni najpierw przefiltrowano przez bibułę filtracyjną Whatman nr 1, a następnie wirowano przy 2500 obr./min przez 5 min w celu usunięcia resztek grzybni. Supernatant zebrano i przechowywano w temperaturze 4 °C w celu dalszego ilościowego oznaczenia szczawianu. W celu przygotowania próbek roślinnych, około 0,1 g fragmentów tkanki roślinnej ekstrahowano trzykrotnie wodą destylowaną (po 2 ml). Następnie próbki wirowano z prędkością 2500 obr./min przez 5 minut, a supernatant przefiltrowano na sucho przez bibułę filtracyjną Whatman nr 1 i zebrano do dalszej analizy.
Do ilościowej analizy kwasu szczawiowego mieszaninę reakcyjną przygotowano w probówce ze szklanym korkiem w następującej kolejności: 0,2 ml próbki (lub filtratu hodowli PDB lub standardowego roztworu kwasu szczawiowego), 0,11 ml błękitu bromofenolowego (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M kwasu siarkowego (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kair, Egipt) i 0,176 ml 100 mM dwuchromianu potasu (K2Cr2O7; TCI Chemicals, Portland, OR, USA). Następnie roztwór rozcieńczono do 4,8 ml wodą destylowaną, energicznie wymieszano i natychmiast umieszczono w łaźni wodnej o temperaturze 60°C. Po 10 minutach reakcję zatrzymano, dodając 0,5 ml roztworu wodorotlenku sodu (NaOH; 0,75 M). Absorbancję (A600) mieszaniny reakcyjnej mierzono przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru UV-160 (Shimadzu Corporation, Japonia). PDB i woda destylowana były stosowane jako kontrole do ilościowego oznaczania przesączy hodowlanych i próbek roślin. Stężenia kwasu szczawiowego w przesączach hodowlanych, wyrażone w mikrogramach kwasu szczawiowego na mililitr pożywki PDB (μg.ml−1), oraz w ekstraktach z liści, wyrażone w mikrogramach kwasu szczawiowego na gram świeżej masy (μg.g−1 FW), określono za pomocą krzywej kalibracyjnej kwasu szczawiowego (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
W trakcie badania wszystkie eksperymenty zaprojektowano w całkowicie losowym układzie (CRD) z sześcioma powtórzeniami biologicznymi na zabieg i pięcioma doniczkami na powtórzenie biologiczne (dwie rośliny na doniczkę), o ile nie zaznaczono inaczej. Powtórzenia biologiczne analizowano w duplikatach (dwa powtórzenia techniczne). Powtórzenia techniczne wykorzystano do sprawdzenia powtarzalności tego samego eksperymentu, ale nie wykorzystano ich w analizie statystycznej, aby uniknąć powtórzeń błędnych. Dane analizowano statystycznie za pomocą analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu istotności różnic Tukeya-Kramera (HSD) (p ≤ 0,05). W przypadku eksperymentów in vitro wartości IC50 i IC99 obliczono za pomocą modelu probitowego, a także 95% przedziałów ufności.
Łącznie cztery izolaty zebrano z różnych pól soi w prowincji El Ghabiya w Egipcie. Na podłożu PDA wszystkie izolaty wytwarzały kremowobiałą grzybnię, która szybko stawała się bawełnianobiała (rysunek 1A), a następnie beżowa lub brązowa w stadium sklerotium. Sklerotia są zazwyczaj gęste, czarne, kuliste lub o nieregularnym kształcie, o długości od 5,2 do 7,7 mm i średnicy od 3,4 do 5,3 mm (rysunek 1B). Chociaż u czterech izolatów rozwinął się brzeżny wzór sklerocjów na krawędzi podłoża hodowlanego po 10–12 dniach inkubacji w temperaturze 25 ± 2 °C (rysunek 1A), liczba sklerocjów na płytkę istotnie się różniła między nimi (P < 0,001), przy czym izolat 3 miał największą liczbę sklerocjów (32,33 ± 1,53 sklerocjów na płytkę; rysunek 1C). Podobnie, izolat nr 3 wytworzył więcej kwasu szczawiowego w PDB niż inne izolaty (3,33 ± 0,49 μg.ml−1; ryc. 1D). Izolat nr 3 wykazywał typowe cechy morfologiczne i mikroskopowe grzyba fitopatogennego Sclerotinia sclerotiorum. Na przykład, na PDA kolonie izolatu nr 3 rosły szybko, były kremowobiałe (ryc. 1A), beżowe lub jasnołososiowo-żółtobrązowe i potrzebowały 6-7 dni w temperaturze 25 ± 2°C, aby całkowicie pokryć powierzchnię płytki o średnicy 9 cm. Na podstawie powyższych cech morfologicznych i mikroskopowych, izolat nr 3 zidentyfikowano jako Sclerotinia sclerotiorum.
Rysunek 1. Charakterystyka i patogeniczność izolatów S. sclerotiorum z popularnych upraw roślin strączkowych. (A) Wzrost grzybni czterech izolatów S. sclerotiorum na podłożu PDA, (B) sklerocja czterech izolatów S. sclerotiorum, (C) liczba sklerocji (na płytkę), (D) wydzielanie kwasu szczawiowego na podłożu PDB (μg.ml−1) oraz (E) nasilenie choroby (%) czterech izolatów S. sclerotiorum na podatnej komercyjnej odmianie roślin strączkowych Giza 3 w warunkach szklarniowych. Wartości przedstawiają średnią ± SD pięciu powtórzeń biologicznych (n = 5). Różne litery oznaczają statystycznie istotne różnice między zabiegami (p < 0,05). (F–H) Typowe objawy białej pleśni pojawiły się odpowiednio na łodygach nadziemnych i łuszczynach 10 dni po zaszczepieniu izolatem nr 3 (dpi). (I) Analizę ewolucyjną wewnętrznego transkrybowanego regionu spacerowego (ITS) izolatu S. sclerotiorum nr 3 przeprowadzono metodą największego prawdopodobieństwa i porównano z 20 izolatami/szczepami referencyjnymi uzyskanymi z bazy danych Narodowego Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Liczby nad liniami klastrowania oznaczają pokrycie regionu (%), a liczby pod liniami klastrowania oznaczają długość gałęzi.
Ponadto, w celu potwierdzenia patogeniczności, cztery uzyskane izolaty S. sclerotiorum wykorzystano do zaszczepienia podatnej komercyjnej odmiany fasoli Giza 3 w warunkach szklarniowych, co jest zgodne z postulatami Kocha (ryc. 1E). Chociaż wszystkie uzyskane izolaty grzyba były patogeniczne i mogły zainfekować fasolę szparagową (odmiana Giza 3), powodując typowe objawy białej pleśni na wszystkich częściach nadziemnych (ryc. 1F), szczególnie na łodygach (ryc. 1G) i strąkach (ryc. 1H) po 10 dniach od zaszczepienia (dpi), izolat 3 okazał się najbardziej agresywnym izolatem w dwóch niezależnych eksperymentach. Izolat 3 charakteryzował się najwyższym nasileniem choroby (%) na roślinach fasoli (odpowiednio 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 i 76,7 ± 3,1 po 7, 14 i 21 dniach od zakażenia; ryc. 1F).
Identyfikacja najbardziej inwazyjnego izolatu S. sclerotiorum nr 3 została dodatkowo potwierdzona sekwencjonowaniem metodą wewnętrznego transkrybowanego fragmentu (ITS) (ryc. 1I). Analiza filogenetyczna izolatu nr 3 i 20 szczepów/izolatów referencyjnych wykazała duże podobieństwo (>99%). Warto zauważyć, że izolat S. sclerotiorum nr 3 (533 pz) wykazuje duże podobieństwo do amerykańskiego izolatu S. sclerotiorum LPM36 wyizolowanego z suchych nasion grochu (numer akcesyjny GenBank MK896659.1; 540 pz) oraz chińskiego izolatu S. sclerotiorum YKY211 (numer akcesyjny GenBank OR206374.1; 548 pz), który powoduje zgniliznę łodygi u fiołka (Matthiola incana). Wszystkie te izolaty zostały zgrupowane oddzielnie u góry dendrogramu (ryc. 1I). Nowa sekwencja została złożona w bazie danych NCBI i otrzymała nazwę „Sclerotinia sclerotiorum – izolat YN-25” (numer rejestracyjny GenBank PV202792). Widać, że izolat 3 jest najbardziej inwazyjny, dlatego też wybrano go do badań we wszystkich kolejnych eksperymentach.
Aktywność przeciwbakteryjna diaminy L-ornityny (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy) w różnych stężeniach (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/l) wobec izolatu 3 S. sclerotiorum została zbadana in vitro. Warto zauważyć, że L-ornityna wywierała działanie przeciwbakteryjne i stopniowo hamowała wzrost promienisty strzępek S. sclerotiorum w sposób zależny od dawki (ryc. 2A, B). W najwyższym testowanym stężeniu (125 mg/l) L-ornityna wykazała najwyższy wskaźnik zahamowania wzrostu grzybni (99,62 ± 0,27%; rycina 2B), co odpowiadało skuteczności komercyjnego fungicydu Rizolex-T (wskaźnik zahamowania 99,45 ± 0,39%; rycina 2C) przy najwyższym testowanym stężeniu (10 mg/l), co wskazuje na podobną skuteczność.
Rycina 2. Aktywność przeciwbakteryjna in vitro L-ornityny przeciwko Sclerotinia sclerotiorum. (A) Porównanie aktywności przeciwbakteryjnej różnych stężeń L-ornityny przeciwko S. sclerotiorum z komercyjnym fungicydem Rizolex-T (10 mg/l). (B, C) Szybkość zahamowania (%) wzrostu grzybni S. sclerotiorum po leczeniu różnymi stężeniami L-ornityny (12,5, 25, 50, 75, 100 i 125 mg/l) lub Rizolex-T (2, 4, 6, 8 i 10 mg/l). Wartości oznaczają średnią ± SD pięciu powtórzeń biologicznych (n = 5). Różne litery oznaczają różnice statystyczne między zabiegami (p < 0,05). (D, E) Analiza regresji modelu probitowego odpowiednio dla L-ornityny i komercyjnego fungicydu Rizolex-T. Linia regresji modelu probitowego jest przedstawiona jako ciągła niebieska linia, a przedział ufności (95%) jako przerywana czerwona linia.
Dodatkowo przeprowadzono analizę regresji probit, a odpowiednie wykresy przedstawiono w Tabeli 1 i na Rysunkach 2D i E. Krótko mówiąc, akceptowalna wartość nachylenia (y = 2,92x − 4,67) i powiązane istotne statystycznie wartości (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 i p < 0,0001; Rysunek 2D) L-ornityny wskazują na zwiększoną aktywność przeciwgrzybiczą przeciwko S. sclerotiorum w porównaniu z komercyjnym fungicydem Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 i p < 0,0001) (Tabela 1).
Tabela 1. Wartości półmaksymalnego stężenia hamującego (IC50) i IC99 (mg/l) L-ornityny i komercyjnego fungicydu „Rizolex-T” przeciwko S. sclerotiorum.
Ogólnie rzecz biorąc, L-ornityna (250 mg/l) znacząco zmniejszyła rozwój i nasilenie białej pleśni na traktowanych roślinach fasoli zwyczajnej w porównaniu z nieleczonymi roślinami zakażonymi S. sclerotiorum (grupa kontrolna; rycina 3A). Krótko mówiąc, chociaż nasilenie choroby na nieleczonych, zakażonych roślinach kontrolnych stopniowo wzrastało (odpowiednio 52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 i 92,33 ± 3,06%), L-ornityna znacząco zmniejszyła nasilenie choroby (%) w całym eksperymencie (odpowiednio 8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 i 26,36 ± 3,07) w 7, 14 i 21 dniu po leczeniu (rycina 3A). Podobnie, gdy rośliny fasoli zakażone S. sclerotiorum poddano działaniu 250 mg/l L-ornityny, pole powierzchni pod krzywą postępu choroby (AUDPC) zmniejszyło się z 1274,33 ± 33,13 w nieleczonej kontroli do 281,03 ± 7,95, co było wartością nieznacznie niższą niż w przypadku kontroli pozytywnej z fungicydem Rizolex-T w stężeniu 50 mg/l (183,61 ± 7,71; ryc. 3B). Tę samą tendencję zaobserwowano w drugim eksperymencie.
Ryc. 3. Wpływ egzogennego stosowania L-ornityny na rozwój białej zgnilizny fasoli zwyczajnej, wywoływanej przez Sclerotinia sclerotiorum w warunkach szklarniowych. (A) Krzywa progresji choroby białej pleśni fasoli zwyczajnej po leczeniu stężeniem 250 mg/l L-ornityny. (B) Pole pod krzywą progresji choroby (AUDPC) białej pleśni fasoli zwyczajnej po leczeniu L-ornityną. Wartości przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe (SD) z pięciu powtórzeń biologicznych (n = 5). Różne litery oznaczają statystycznie istotne różnice między zabiegami (p < 0,05).
Egzogenne zastosowanie 250 mg/l L-ornityny stopniowo zwiększyło wysokość roślin (ryc. 4A), liczbę gałęzi na roślinie (ryc. 4B) i liczbę liści na roślinie (ryc. 4C) po 42 dniach. Podczas gdy komercyjny fungicyd Rizolex-T (50 mg/l) miał największy wpływ na wszystkie badane parametry odżywcze, egzogenne zastosowanie 250 mg/l L-ornityny miało drugi największy wpływ w porównaniu z nieleczonymi kontrolami (ryc. 4A–C). Z drugiej strony, podanie L-ornityny nie miało istotnego wpływu na zawartość pigmentów fotosyntetycznych, chlorofilu a (ryc. 4D) i chlorofilu b (ryc. 4E), ale nieznacznie zwiększyło całkowitą zawartość karotenoidów (0,56 ± 0,03 mg/g masy całkowitej) w porównaniu z kontrolą negatywną (0,44 ± 0,02 mg/g masy całkowitej) i kontrolą pozytywną (0,46 ± 0,02 mg/g masy całkowitej; ryc. 4F). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wskazują, że L-ornityna nie jest fitotoksyczna dla roślin strączkowych poddanych działaniu L-ornityny, a nawet może stymulować ich wzrost.
Ryc. 4. Wpływ egzogennej aplikacji L-ornityny na charakterystykę wzrostu i pigmenty fotosyntetyczne liści fasoli zainfekowanych Sclerotinia sclerotiorum w warunkach szklarniowych. (A) Wysokość rośliny (cm), (B) Liczba gałęzi na roślinę, (C) Liczba liści na roślinę, (D) Zawartość chlorofilu a (mg g-1 fr wt), (E) Zawartość chlorofilu b (mg g-1 fr wt), (F) Całkowita zawartość karotenoidów (mg g-1 fr wt). Wartości stanowią średnią ± odchylenie standardowe pięciu powtórzeń biologicznych (n = 5). Różne litery oznaczają statystycznie istotne różnice między zabiegami (p < 0,05).
Histochemiczna lokalizacja in situ reaktywnych form tlenu (ROS; wyrażonych jako nadtlenek wodoru [H2O2]) i wolnych rodników (wyrażonych jako aniony ponadtlenkowe [O2•−]) wykazała, że ​​egzogenne zastosowanie L-ornityny (250 mg/l) znacząco zmniejszyło akumulację H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; rys. 5A) i O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; rys. 5B) w porównaniu do akumulacji zarówno nieleczonych zakażonych roślin (odpowiednio 173,31 ± 12,06 i 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW), jak i roślin poddanych działaniu 50 mg/l komercyjnego fungicydu Rizolex-T (170,12 ± 9,50 i 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, odpowiednio) po 72 h. Wysokie poziomy H2O2 i O2•− kumulowały się w warunkach hpt (ryc. 5A, B). Podobnie, test z malondialdehydem (MDA) na bazie TCA wykazał, że rośliny fasoli zakażone S. sclerotiorum kumulowały wyższe poziomy MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) w liściach (ryc. 5C). Jednak egzogenne podanie L-ornityny znacząco zmniejszyło peroksydację lipidów, o czym świadczy spadek zawartości MDA w traktowanych roślinach (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Ryc. 5. Wpływ stosowania egzogennej L-ornityny na główne markery stresu oksydacyjnego i nieenzymatyczne mechanizmy obrony antyoksydacyjnej w liściach fasoli zakażonych S. sclerotiorum 72 godziny po zakażeniu w warunkach szklarniowych. (A) Nadtlenek wodoru (H2O2; nmol g−1 FW) w 72 hpt, (B) anion ponadtlenkowy (O2•−; nmol g−1 FW) w 72 hpt, (C) malonodialdehyd (MDA; nmol g−1 FW) w 72 hpt, (D) całkowite rozpuszczalne fenole (mg GAE g−1 FW) w 72 hpt, (E) całkowite rozpuszczalne flawonoidy (mg RE g−1 FW) w 72 hpt, (F) całkowite wolne aminokwasy (mg g−1 FW) w 72 hpt i (G) zawartość proliny (mg g−1 FW) w 72 hpt. Wartości przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe (średnia ± SD) 5 powtórzeń biologicznych (n = 5). Różne litery oznaczają statystycznie istotne różnice między metodami leczenia (p < 0,05).