Dziękujemy za odwiedzenie strony nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby zapewnić najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z najnowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Dodatkowo, aby zapewnić ciągłą obsługę, ta strona nie będzie zawierać stylów ani JavaScriptu.
Burze pyłowe stanowią poważne zagrożenie dla wielu krajów na całym świecie ze względu na ich destrukcyjny wpływ na rolnictwo, zdrowie ludzi, sieci transportowe i infrastrukturę. W rezultacie erozja wietrzna jest uważana za problem globalny. Jednym z przyjaznych dla środowiska sposobów ograniczenia erozji wietrznej jest zastosowanie mikrobiologicznego wytrącania węglanów (MICP). Jednak produkty uboczne MICP opartego na degradacji mocznika, takie jak amoniak, nie są idealne, gdy są produkowane w dużych ilościach. W niniejszym badaniu przedstawiono dwie formulacje bakterii mrówczanu wapnia do degradacji MICP bez wytwarzania mocznika i kompleksowo porównano ich wydajność z dwiema formulacjami bakterii octanu wapnia niewytwarzających amoniaku. Rozważane bakterie to Bacillus subtilis i Bacillus amyloliquefaciens. Najpierw określono zoptymalizowane wartości czynników kontrolujących powstawanie CaCO3. Następnie przeprowadzono testy w tunelu aerodynamicznym na próbkach wydm poddanych działaniu zoptymalizowanych formulacji, mierząc odporność na erozję wietrzną, prędkość progową odmywania oraz odporność na bombardowanie piaskiem. Allomorfy węglanu wapnia (CaCO3) oceniano za pomocą mikroskopii optycznej, skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Preparaty na bazie mrówczanu wapnia charakteryzowały się znacznie lepszym tworzeniem węglanu wapnia niż preparaty na bazie octanu. Ponadto B. subtilis wytwarzał więcej węglanu wapnia niż B. amyloliquefaciens. Mikrofotografie SEM wyraźnie wykazały wiązanie i odciskanie się aktywnych i nieaktywnych bakterii na węglanie wapnia, spowodowane sedymentacją. Wszystkie preparaty znacząco ograniczyły erozję wietrzną.
Erozja wietrzna od dawna jest uznawana za poważny problem, z którym borykają się regiony suche i półpustynne, takie jak południowo-zachodnie Stany Zjednoczone, zachodnie Chiny, Afryka Saharyjska i znaczna część Bliskiego Wschodu1. Niskie opady deszczu w klimacie suchym i hiperpustynnym przekształciły duże obszary tych regionów w pustynie, wydmy i nieużytki. Ciągła erozja wietrzna stanowi zagrożenie dla infrastruktury, takiej jak sieci transportowe, grunty rolne i przemysłowe, prowadząc do złych warunków życia i wysokich kosztów rozwoju miast w tych regionach2,3,4. Co ważne, erozja wietrzna wpływa nie tylko na miejsce występowania, ale także powoduje problemy zdrowotne i ekonomiczne w odległych społecznościach, ponieważ przenosi cząstki stałe przez wiatr do obszarów oddalonych od źródła5,6.
Kontrola erozji wietrznej pozostaje problemem globalnym. Do jej zwalczania stosuje się różne metody stabilizacji gleby. Metody te obejmują takie materiały, jak stosowanie wody7, ściółki olejowe8, biopolimery5, mikrobiologiczne wytrącanie węglanów (MICP)9,10,11,12 oraz enzymatyczne wytrącanie węglanów (EICP)1. Zwilżanie gleby jest standardową metodą ograniczania zapylenia w terenie. Jednak szybkie parowanie sprawia, że ​​ta metoda ma ograniczoną skuteczność w regionach suchych i półsuchych1. Stosowanie związków ściółkujących na bazie oleju zwiększa spójność piasku i tarcie międzycząsteczkowe. Ich właściwości kohezyjne wiążą ziarna piasku; jednak ściółki olejowe stwarzają również inne problemy; ich ciemny kolor zwiększa absorpcję ciepła i prowadzi do obumierania roślin i mikroorganizmów. Ich zapach i opary mogą powodować problemy z oddychaniem, a co najważniejsze, ich wysoki koszt stanowi kolejną przeszkodę. Biopolimery są jedną z ostatnio zaproponowanych ekologicznych metod łagodzenia erozji wietrznej; Są one pozyskiwane ze źródeł naturalnych, takich jak rośliny, zwierzęta i bakterie. Guma ksantanowa, guma guar, chitozan i guma gellan to najczęściej stosowane biopolimery w zastosowaniach inżynieryjnych5. Jednak biopolimery rozpuszczalne w wodzie mogą tracić wytrzymałość i wypłukiwać się z gleby pod wpływem wody13,14. Wykazano, że EICP jest skuteczną metodą redukcji pyłu w różnych zastosowaniach, w tym na nieutwardzonych drogach, w stawach osadowych i na placach budowy. Chociaż wyniki są zachęcające, należy wziąć pod uwagę pewne potencjalne wady, takie jak koszt i brak miejsc nukleacji (co przyspiesza formowanie i wytrącanie kryształów CaCO315,16).
Proces MICP został po raz pierwszy opisany pod koniec XIX wieku przez Murraya i Irwina (1890) oraz Steinmanna (1901) w ich badaniu degradacji mocznika przez mikroorganizmy morskie17. MICP to naturalnie występujący proces biologiczny obejmujący różnorodne aktywności mikrobiologiczne i procesy chemiczne, w których węglan wapnia wytrąca się w wyniku reakcji jonów węglanowych z metabolitów mikrobiologicznych z jonami wapnia w środowisku18,19. MICP obejmujący cykl azotowy degradujący mocznik (MICP degradujący mocznik) jest najczęstszym rodzajem wytrącania węglanu indukowanego przez mikroorganizmy, w którym ureaza wytwarzana przez bakterie katalizuje hydrolizę mocznika20,21,22,23,24,25,26,27 w następujący sposób:
W procesie MICP obejmującym cykl węglowy utleniania soli organicznych (MICP bez degradacji mocznika) bakterie heterotroficzne wykorzystują sole organiczne, takie jak octan, mleczan, cytrynian, bursztynian, szczawian, jabłczan i glioksylan, jako źródła energii do wytwarzania minerałów węglanowych28. W obecności mleczanu wapnia jako źródła węgla i jonów wapnia, reakcja chemiczna powstawania węglanu wapnia jest przedstawiona w równaniu (5).
W procesie MICP komórki bakteryjne zapewniają miejsca nukleacji, które są szczególnie ważne dla wytrącania węglanu wapnia; powierzchnia komórki bakteryjnej ma ładunek ujemny i może działać jako adsorbent dla kationów dwuwartościowych, takich jak jony wapnia. Adsorbując jony wapnia na komórkach bakteryjnych, gdy stężenie jonów węglanowych jest wystarczające, kationy wapnia i aniony węglanowe reagują, a węglan wapnia wytrąca się na powierzchni bakterii29,30. Proces można podsumować następująco31,32:
Kryształy węglanu wapnia generowane metodą biosyntezy można podzielić na trzy rodzaje: kalcyt, wateryt i aragonit. Spośród nich kalcyt i wateryt to najczęstsze alomorfy węglanu wapnia indukowane bakteriami33,34. Kalcyt jest najbardziej stabilnym termodynamicznie alomorfem węglanu wapnia35. Chociaż wateryt jest uważany za metastabilny, ostatecznie przekształca się w kalcyt36,37. Wateryt jest najgęstszym z tych kryształów. Jest to kryształ heksagonalny, który dzięki większym rozmiarom ma lepszą zdolność wypełniania porów niż inne kryształy węglanu wapnia38. Zarówno zdegradowany mocznikiem, jak i niedegradowany mocznikiem MICP może prowadzić do wytrącania się waterytu13,39,40,41.
Chociaż MICP wykazał obiecujący potencjał w stabilizacji problematycznych gleb i gleb podatnych na erozję wietrzną42,43,44,45,46,47,48, jednym z produktów ubocznych hydrolizy mocznika jest amoniak, który może powodować łagodne do poważnych problemów zdrowotnych w zależności od poziomu narażenia49. Ten efekt uboczny sprawia, że ​​stosowanie tej konkretnej technologii jest kontrowersyjne, zwłaszcza gdy konieczne jest poddanie działaniu dużych obszarów, na przykład w celu tłumienia zapylenia. Ponadto zapach amoniaku jest nie do zniesienia, gdy proces jest przeprowadzany przy wysokich dawkach i dużych objętościach, co może mieć wpływ na jego praktyczne zastosowanie. Chociaż ostatnie badania wykazały, że jony amonowe można zmniejszyć poprzez przekształcenie ich w inne produkty, takie jak struwit, metody te nie usuwają całkowicie jonów amonowych50. Dlatego nadal istnieje potrzeba poszukiwania alternatywnych rozwiązań, które nie generują jonów amonowych. Wykorzystanie ścieżek degradacji MICP bez mocznika może stanowić potencjalne rozwiązanie, które dotychczas było słabo zbadane w kontekście ograniczania erozji wietrznej. Fattahi i in. badali degradację MICP bez mocznika z wykorzystaniem octanu wapnia i Bacillus megaterium41, podczas gdy Mohebbi i in. użyli octanu wapnia i Bacillus amyloliquefaciens9. Jednak ich badania nie zostały porównane z innymi źródłami wapnia i bakteriami heterotroficznymi, które mogłyby ostatecznie poprawić odporność na erozję wietrzną. Brakuje również literatury porównującej ścieżki degradacji bez mocznika ze ścieżkami degradacji mocznika w ograniczaniu erozji wietrznej.
Ponadto większość badań nad erozją wietrzną i kontrolą zapylenia przeprowadzono na próbkach gleby o płaskich powierzchniach.1,51,52,53 Jednak płaskie powierzchnie występują w naturze rzadziej niż wzgórza i obniżenia terenu. Dlatego wydmy są najpowszechniejszym elementem krajobrazu w regionach pustynnych.
Aby przezwyciężyć powyższe niedociągnięcia, niniejsze badanie miało na celu wprowadzenie nowego zestawu czynników bakteryjnych niewytwarzających amoniaku. W tym celu rozważyliśmy ścieżki MICP niedegradujące mocznika. Zbadano wydajność dwóch źródeł wapnia (mrówczanu wapnia i octanu wapnia). Według najlepszej wiedzy autorów, wytrącanie węglanów przy użyciu dwóch kombinacji źródeł wapnia i bakterii (tj. mrówczanu wapnia - Bacillus subtilis i mrówczanu wapnia - Bacillus amyloliquefaciens) nie było badane w poprzednich badaniach. Wybór tych bakterii opierał się na produkowanych przez nie enzymach, które katalizują utlenianie mrówczanu wapnia i octanu wapnia, tworząc mikrobiologiczne wytrącanie węglanu. Zaprojektowaliśmy dokładne badanie eksperymentalne w celu znalezienia optymalnych czynników, takich jak pH, rodzaje bakterii i źródeł wapnia oraz ich stężenia, stosunek bakterii do roztworu źródła wapnia i czas utwardzania. Na koniec zbadano skuteczność tego zestawu czynników bakteryjnych w hamowaniu erozji wietrznej poprzez wytrącanie węglanu wapnia. W tym celu przeprowadzono serię testów w tunelu aerodynamicznym na wydmach, aby określić wielkość erozji wietrznej, prędkość odrywania się piasku od podłoża oraz jego odporność na bombardowanie wiatrem. Przeprowadzono również pomiary penetrometryczne i badania mikrostrukturalne (np. analizę dyfrakcji rentgenowskiej (XRD) i skaningową mikroskopię elektronową (SEM)).
Produkcja węglanu wapnia wymaga jonów wapnia i jonów węglanowych. Jony wapnia można uzyskać z różnych źródeł wapnia, takich jak chlorek wapnia, wodorotlenek wapnia i odtłuszczone mleko w proszku54,55. Jony węglanowe można wytwarzać różnymi metodami mikrobiologicznymi, takimi jak hydroliza mocznika oraz tlenowe lub beztlenowe utlenianie materii organicznej56. W niniejszym badaniu jony węglanowe uzyskano z reakcji utleniania mrówczanu i octanu. Ponadto, do wytworzenia czystego węglanu wapnia użyliśmy soli wapniowych mrówczanu i octanu, dzięki czemu jako produkty uboczne uzyskano jedynie CO2 i H2O. W tym procesie tylko jedna substancja służy jako źródło wapnia i źródło węglanu, a amoniak nie jest wytwarzany. Te cechy sprawiają, że metoda wytwarzania źródła wapnia i węglanu, którą uznaliśmy za bardzo obiecującą.
Odpowiednie reakcje mrówczanu wapnia i octanu wapnia, prowadzące do powstania węglanu wapnia, przedstawiono we wzorach (7)-(14). Wzory (7)-(11) pokazują, że mrówczan wapnia rozpuszcza się w wodzie, tworząc kwas mrówkowy lub mrówczan. Roztwór jest zatem źródłem wolnych jonów wapnia i jonów wodorotlenkowych (wzory 8 i 9). W wyniku utleniania kwasu mrówkowego atomy węgla w kwasie mrówkowym przekształcają się w dwutlenek węgla (wzór 10). Ostatecznie powstaje węglan wapnia (wzory 11 i 12).
Podobnie, z octanu wapnia powstaje węglan wapnia (równania 13–15), z tą różnicą, że zamiast kwasu mrówkowego powstaje kwas octowy lub octan.
Bez obecności enzymów octan i mrówczan nie mogą zostać utlenione w temperaturze pokojowej. FDH (dehydrogenaza mrówczanowa) i CoA (koenzym A) katalizują utlenianie mrówczanu i octanu do dwutlenku węgla (równania 16, 17) 57, 58, 59. Różne bakterie są zdolne do produkcji tych enzymów, a w badaniu wykorzystano bakterie heterotroficzne, a mianowicie Bacillus subtilis (PTCC nr 1204 (Persian Type Culture Collection), znane również jako NCIMB nr 13061 (International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plasmids, Plant Seeds and Plant Cell Tissue Cultures)) i Bacillus amyloliquefaciens (PTCC nr 1732, NCIMB nr 12077). Bakterie te hodowano w podłożu zawierającym pepton mięsny (5 g/l) i ekstrakt mięsny (3 g/l), zwanym bulionem odżywczym (NBR) (105443 Merck).
W związku z tym przygotowano cztery formulacje mające na celu wywołanie wytrącania węglanu wapnia przy użyciu dwóch źródeł wapnia i dwóch bakterii: mrówczanu wapnia i Bacillus subtilis (FS), mrówczanu wapnia i Bacillus amyloliquefaciens (FA), octanu wapnia i Bacillus subtilis (AS) oraz octanu wapnia i Bacillus amyloliquefaciens (AA).
W pierwszej części projektu eksperymentalnego przeprowadzono testy mające na celu określenie optymalnej kombinacji, która zapewni maksymalną produkcję węglanu wapnia. Ponieważ próbki gleby zawierały węglan wapnia, zaprojektowano zestaw wstępnych testów ewaluacyjnych, aby dokładnie zmierzyć CaCO3 wytwarzane przez różne kombinacje, a także oceniono mieszaniny pożywki hodowlanej i roztworów źródeł wapnia. Dla każdej z powyższych kombinacji źródła wapnia i roztworu bakterii (FS, FA, AS i AA) wyznaczono współczynniki optymalizacji (stężenie źródła wapnia, czas utwardzania, stężenie roztworu bakterii mierzone gęstością optyczną roztworu (OD), stosunek źródła wapnia do roztworu bakterii oraz pH) i wykorzystano je w testach obróbki wydm w tunelu aerodynamicznym, opisanych w kolejnych sekcjach.
Dla każdej kombinacji przeprowadzono 150 eksperymentów, aby zbadać wpływ wytrącania CaCO3 i ocenić różne czynniki, takie jak stężenie źródła wapnia, czas utwardzania, wartość OD bakterii, stosunek źródła wapnia do roztworu bakterii oraz pH podczas tlenowego utleniania materii organicznej (Tabela 1). Zakres pH dla zoptymalizowanego procesu wybrano na podstawie krzywych wzrostu Bacillus subtilis i Bacillus amyloliquefaciens, aby uzyskać szybszy wzrost. Zostało to wyjaśnione bardziej szczegółowo w sekcji „Wyniki”.
Poniższe kroki zostały wykorzystane do przygotowania próbek do fazy optymalizacji. Roztwór MICP został najpierw przygotowany poprzez dostosowanie początkowego pH pożywki hodowlanej, a następnie autoklawowany w temperaturze 121°C przez 15 minut. Następnie szczep zaszczepiono w laminarnym przepływie powietrza i utrzymywano w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30°C i przy 180 obr./min. Gdy OD bakterii osiągnęło pożądany poziom, zmieszano je z roztworem źródła wapnia w żądanej proporcji (rysunek 1a). Roztwór MICP poddano reakcji i zestaleniu w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 220 obr./min i 30°C przez czas, aż osiągnął wartość docelową. Wytrącony CaCO3 oddzielono po wirowaniu z prędkością 6000 g przez 5 minut, a następnie wysuszono w temperaturze 40°C w celu przygotowania próbek do testu kalcymetrycznego (rysunek 1b). Wytrącanie CaCO3 mierzono następnie za pomocą kalcymetru Bernarda, w którym proszek CaCO3 reaguje z 1,0 N HCl (ASTM-D4373-02), wytwarzając CO2. Objętość tego gazu jest miarą zawartości CaCO3 (rysunek 1c). Aby przeliczyć objętość CO2 na zawartość CaCO3, wygenerowano krzywą kalibracyjną, przemywając czysty proszek CaCO3 1 N HCl i nanosząc ją na wykres w funkcji wydzielonego CO2. Morfologię i czystość wytrąconego proszku CaCO3 zbadano za pomocą obrazowania SEM i analizy XRD. Do badania tworzenia się węglanu wapnia wokół bakterii, fazy utworzonego węglanu wapnia oraz aktywności bakterii wykorzystano mikroskop optyczny o powiększeniu 1000 razy.
Basen Dejegh to znany, silnie zerodowany region w południowo-zachodniej prowincji Fars w Iranie. Naukowcy zebrali z tego obszaru próbki gleby zerodowanej przez wiatr. Próbki pobrano z powierzchni gleby do badań. Testy wskaźnikowe próbek gleby wykazały, że była to słabo wysortowana gleba piaszczysta z mułem i została sklasyfikowana jako SP-SM zgodnie z Jednolitym Systemem Klasyfikacji Gleb (USC) (rysunek 2a). Analiza XRD wykazała, że ​​gleba Dejegh składała się głównie z kalcytu i kwarcu (rysunek 2b). Ponadto analiza EDX wykazała obecność innych pierwiastków, takich jak Al, K i Fe, w mniejszych proporcjach.
Aby przygotować laboratoryjne wydmy do badań erozji wietrznej, glebę rozkruszano z wysokości 170 mm przez lej o średnicy 10 mm na twardą powierzchnię, uzyskując typową wydmę o wysokości 60 mm i średnicy 210 mm. W naturze wydmy o najniższej gęstości powstają w wyniku procesów eolicznych. Podobnie, próbka przygotowana zgodnie z powyższą procedurą miała najniższą gęstość względną, γ = 14,14 kN/m³, tworząc stożek piaskowy osadzony na poziomej powierzchni pod kątem usypu około 29,7°.
Optymalny roztwór MICP uzyskany w poprzedniej sekcji rozpylono na zboczu wydmy w dawkach 1, 2 i 3 lm-2, a następnie próbki przechowywano w inkubatorze w temperaturze 30 °C (rys. 3) przez 9 dni (tj. optymalny czas utwardzania), a potem wyeksportowano do badania w tunelu aerodynamicznym.
Dla każdego zabiegu przygotowano cztery próbki, jedną do pomiaru zawartości węglanu wapnia i wytrzymałości powierzchni za pomocą penetrometru, a pozostałe trzy próbki wykorzystano do testów erozji przy trzech różnych prędkościach. W testach w tunelu aerodynamicznym określono wielkość erozji przy różnych prędkościach wiatru, a następnie progową prędkość oderwania dla każdej próbki poddanej zabiegowi określono za pomocą wykresu wielkości erozji w funkcji prędkości wiatru. Oprócz testów erozji wietrznej, próbki poddano bombardowaniu piaskiem (tj. eksperymentom skokowym). W tym celu przygotowano dwie dodatkowe próbki z dawkami 2 i 3 L m−2. Test bombardowania piaskiem trwał 15 minut przy strumieniu 120 g m−1, co mieści się w zakresie wartości wybranych w poprzednich badaniach60,61,62. Odległość pozioma między dyszą ścierną a podstawą wydmy wynosiła 800 mm i znajdowała się 100 mm nad dnem tunelu. Pozycję tę ustalono w taki sposób, aby większość skaczących cząstek piasku opadała na wydmę.
Test w tunelu aerodynamicznym przeprowadzono w otwartym tunelu aerodynamicznym o długości 8 m, szerokości 0,4 m i wysokości 1 m (rysunek 4a). Tunel aerodynamiczny wykonany jest z ocynkowanej blachy stalowej i może generować prędkość wiatru do 25 m/s. Dodatkowo, przetwornica częstotliwości służy do regulacji częstotliwości wentylatora i stopniowego jej zwiększania w celu uzyskania docelowej prędkości wiatru. Rysunek 4b przedstawia schemat wydm wyżłobionych przez wiatr oraz profil prędkości wiatru zmierzony w tunelu aerodynamicznym.
Na koniec, aby porównać wyniki nieurealizacyjnej formulacji MICP zaproponowanej w tym badaniu z wynikami kontrolnego testu urealizacyjnego MICP, przygotowano również próbki wydm i poddano je działaniu roztworu biologicznego zawierającego mocznik, chlorek wapnia i Sporosarcina pasteurii (ponieważ Sporosarcina pasteurii ma znaczną zdolność do produkcji ureazy63). Gęstość optyczna roztworu bakteryjnego wynosiła 1,5, a stężenia mocznika i chlorku wapnia wynosiły 1 M (wybrane na podstawie wartości zalecanych w poprzednich badaniach36,64,65). Pożywka hodowlana składała się z bulionu odżywczego (8 g/l) i mocznika (20 g/l). Roztwór bakteryjny rozpylono na powierzchnię wydmy i pozostawiono na 24 godziny w celu przyłączenia się bakterii. Po 24 godzinach przyłączenia rozpylono roztwór cementujący (chlorek wapnia i mocznik). Kontrolny test urealizacyjny MICP będzie dalej nazywany UMC. Zawartość węglanu wapnia w próbkach gleby poddanych i niepoddanych obróbce urealitycznej uzyskano poprzez płukanie zgodnie z procedurą zaproponowaną przez Choi i in.66
Rysunek 5 przedstawia krzywe wzrostu Bacillus amyloliquefaciens i Bacillus subtilis w pożywce (pożywce) o początkowym zakresie pH od 5 do 10. Jak pokazano na rysunku, Bacillus amyloliquefaciens i Bacillus subtilis rosły szybciej przy pH odpowiednio 6-8 i 7-9. Dlatego ten zakres pH przyjęto na etapie optymalizacji.
Krzywe wzrostu (a) Bacillus amyloliquefaciens i (b) Bacillus subtilis przy różnych początkowych wartościach pH pożywki.
Rysunek 6 przedstawia ilość dwutlenku węgla wytwarzanego w wapnie Bernarda, która odpowiada wytrąconemu węglanowi wapnia (CaCO3). Ponieważ w każdej kombinacji jeden czynnik był stały, a pozostałe czynniki zmieniane, każdy punkt na tych wykresach odpowiada maksymalnej objętości dwutlenku węgla w danym zestawie eksperymentów. Jak pokazano na rysunku, wraz ze wzrostem stężenia źródła wapnia wzrastała produkcja węglanu wapnia. Zatem stężenie źródła wapnia bezpośrednio wpływa na produkcję węglanu wapnia. Ponieważ źródło wapnia i źródło węgla są takie same (tj. mrówczan wapnia i octan wapnia), im więcej jonów wapnia jest uwalnianych, tym więcej węglanu wapnia powstaje (rysunek 6a). W formulacjach AS i AA produkcja węglanu wapnia nadal rosła wraz z wydłużaniem się czasu utwardzania, aż ilość osadu pozostała prawie niezmieniona po 9 dniach. W formulacji FA tempo tworzenia węglanu wapnia spadało, gdy czas utwardzania przekroczył 6 dni. W porównaniu z innymi formulacjami, formulacja FS wykazała stosunkowo niskie tempo tworzenia węglanu wapnia po 3 dniach (rysunek 6b). W formulacjach FA i FS, 70% i 87% całkowitej produkcji węglanu wapnia uzyskano po trzech dniach, podczas gdy w formulacjach AA i AS odsetek ten wynosił odpowiednio tylko około 46% i 45%. Wskazuje to, że formulacja na bazie kwasu mrówkowego charakteryzuje się wyższą szybkością tworzenia CaCO3 na etapie początkowym w porównaniu z formulacją na bazie octanu. Jednakże, szybkość tworzenia maleje wraz z wydłużaniem się czasu utwardzania. Z rysunku 6c można wywnioskować, że nawet przy stężeniach bakterii powyżej OD1, nie ma znaczącego wkładu w tworzenie węglanu wapnia.
Zmiana objętości CO2 (i odpowiadającej jej zawartości CaCO3) mierzona kalcymetrem Bernarda jako funkcja (a) stężenia źródła wapnia, (b) czasu wiązania, (c) gęstości optycznej, (d) początkowego pH, (e) stosunku źródła wapnia do roztworu bakteryjnego (dla każdej formulacji); oraz (f) maksymalnej ilości węglanu wapnia wytworzonego dla każdej kombinacji źródła wapnia i bakterii.
Jeśli chodzi o wpływ początkowego pH pożywki, rysunek 6d pokazuje, że dla FA i FS produkcja CaCO3 osiągnęła maksymalną wartość przy pH 7. Ta obserwacja jest zgodna z wcześniejszymi badaniami, zgodnie z którymi enzymy FDH są najbardziej stabilne przy pH 7–6,7. Jednakże w przypadku AA i AS wytrącanie CaCO3 wzrosło, gdy pH przekroczyło 7. Wcześniejsze badania wykazały również, że optymalny zakres pH dla aktywności enzymu CoA wynosi od 8 do 9,2–6,8. Biorąc pod uwagę, że optymalne zakresy pH dla aktywności enzymu CoA i wzrostu B. amyloliquefaciens wynoszą odpowiednio (8–9,2) i (6–8) (rysunek 5a), oczekuje się, że optymalne pH formulacji AA wyniesie 8, a oba zakresy pH nakładają się. Fakt ten został potwierdzony eksperymentalnie, jak pokazano na rysunku 6d. Ponieważ optymalne pH dla wzrostu B. subtilis wynosi 7-9 (rysunek 5b), a optymalne pH dla aktywności enzymu CoA wynosi 8-9,2, maksymalna wydajność wytrącania CaCO3 jest spodziewana w zakresie pH 8-9, co potwierdza rysunek 6d (tj. optymalne pH wytrącania wynosi 9). Wyniki przedstawione na rysunku 6e wskazują, że optymalny stosunek roztworu źródła wapnia do roztworu bakterii wynosi 1 zarówno dla roztworów octanu, jak i mrówczanu. Dla porównania, wydajność różnych formulacji (tj. AA, AS, FA i FS) została oceniona na podstawie maksymalnej produkcji CaCO3 w różnych warunkach (tj. stężenia źródła wapnia, czasu utwardzania, gęstości optycznej, stosunku źródła wapnia do roztworu bakterii i początkowego pH). Spośród badanych formulacji, formulacja FS charakteryzowała się najwyższą produkcją CaCO3, która była około trzykrotnie większa niż formulacja AA (rysunek 6f). Przeprowadzono cztery eksperymenty kontrolne bez bakterii dla obu źródeł wapnia i po 30 dniach nie zaobserwowano wytrącania CaCO3.
Obrazy mikroskopowe wszystkich formulacji wykazały, że wateryt był główną fazą, w której powstawał węglan wapnia (rysunek 7). Kryształy waterytu miały kształt kulisty69,70,71. Stwierdzono, że węglan wapnia wytrącał się na komórkach bakteryjnych, ponieważ powierzchnia komórek bakteryjnych była naładowana ujemnie i mogła działać jako adsorbent kationów dwuwartościowych. Biorąc formulację FS jako przykład w tym badaniu, po 24 godzinach węglan wapnia zaczął tworzyć się na niektórych komórkach bakteryjnych (rysunek 7a), a po 48 godzinach liczba komórek bakteryjnych pokrytych węglanem wapnia znacznie wzrosła. Ponadto, jak pokazano na rysunku 7b, można było również wykryć cząstki waterytu. Ostatecznie, po 72 godzinach, duża liczba bakterii wydawała się być związana przez kryształy waterytu, a liczba cząstek waterytu znacznie wzrosła (rysunek 7c).
Obserwacje mikroskopowe optyczne wytrącania CaCO3 w kompozycjach FS w czasie: (a) 24, (b) 48 i (c) 72 godz.
Aby dokładniej zbadać morfologię fazy wytrąconej, przeprowadzono analizę proszków za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej (XRD) i mikroskopii elektronowej (SEM). Widma XRD (rys. 8a) i mikrofotografie SEM (rys. 8b, c) potwierdziły obecność kryształów waterytu, ponieważ miały one kształt przypominający sałatę, a także zaobserwowano zgodność między szczytami waterytu a szczytami osadu.
(a) Porównanie widm dyfrakcji rentgenowskiej uformowanego CaCO3 i waterytu. Mikroskopijne zdjęcia SEM waterytu przy powiększeniu (b) 1 kHz i (c) 5,27 kHz.
Wyniki testów w tunelu aerodynamicznym przedstawiono na rysunkach 9a i b. Z rysunków 9a wynika, że ​​progowa prędkość erozji (TDV) nieobrobionego piasku wynosi około 4,32 m/s. Przy szybkości aplikacji 1 l/m² (rysunek 9a) nachylenia linii szybkości utraty gleby dla frakcji FA, FS, AA i UMC są w przybliżeniu takie same jak dla nieobrobionej wydmy. Wskazuje to, że obróbka przy tej szybkości aplikacji jest nieskuteczna i gdy tylko prędkość wiatru przekroczy TDV, cienka skorupa glebowa zanika, a szybkość erozji wydmy jest taka sama jak dla nieobrobionej wydmy. Nachylenie erozji frakcji AS jest również niższe niż w przypadku innych frakcji o niższych odciętych (tj. TDV) (rysunek 9a). Strzałki na Rysunku 9b wskazują, że przy maksymalnej prędkości wiatru 25 m/s nie wystąpiła erozja w obrobionych wydmach przy dawkach aplikacji 2 i 3 l/m². Innymi słowy, w przypadku metod FS, FA, AS i UMC, wydmy były bardziej odporne na erozję wietrzną spowodowaną osadzaniem się CaCO³ przy dawkach aplikacji 2 i 3 l/m² niż przy maksymalnej prędkości wiatru (tj. 25 m/s). Zatem wartość TDV wynosząca 25 m/s uzyskana w tych testach stanowi dolną granicę dla dawek aplikacji pokazanych na Rysunku 9b, z wyjątkiem przypadku AA, gdzie TDV jest niemal równa maksymalnej prędkości w tunelu aerodynamicznym.
Badanie erozji wietrznej (a) Utrata masy w zależności od prędkości wiatru (stopień aplikacji 1 l/m2), (b) Prędkość odrywania progowego w zależności od stopnia aplikacji i składu (CA dla octanu wapnia, CF dla mrówczanu wapnia).
Rysunek 10 przedstawia erozję powierzchniową wydm poddanych działaniu różnych formulacji i dawek po teście bombardowania piaskiem, a wyniki ilościowe przedstawiono na Rysunku 11. Przypadek niepoddany działaniu nie został pokazany, ponieważ nie wykazał odporności i został całkowicie zerodowany (całkowita utrata masy) podczas testu bombardowania piaskiem. Z Rysunku 11 jasno wynika, że ​​próbka poddana działaniu biokompozycji AA straciła 83,5% swojej wagi przy dawce aplikacji 2 l/m2, podczas gdy wszystkie pozostałe próbki wykazały mniej niż 30% erozji podczas procesu bombardowania piaskiem. Po zwiększeniu dawki aplikacji do 3 l/m2, wszystkie poddane działaniu próbki straciły mniej niż 25% swojej wagi. Przy obu dawkach aplikacji związek FS wykazał najlepszą odporność na bombardowanie piaskiem. Maksymalna i minimalna odporność na bombardowanie w próbkach poddanych działaniu FS i AA może być przypisana ich maksymalnemu i minimalnemu wytrącaniu CaCO3 (Rysunek 6f).
Wyniki bombardowania wydm o różnym składzie przy przepływach 2 i 3 l/m2 (strzałki wskazują kierunek wiatru, krzyżyki wskazują kierunek wiatru prostopadły do ​​płaszczyzny rysunku).
Jak pokazano na rysunku 12, zawartość węglanu wapnia we wszystkich formułach wzrastała wraz ze wzrostem dawki aplikacji z 1 l/m² do 3 l/m². Ponadto, przy wszystkich dawkach aplikacji, formuła o najwyższej zawartości węglanu wapnia to FS, a następnie FA i UMC. Sugeruje to, że formuły te mogą mieć wyższą rezystancję powierzchniową.
Rysunek 13a przedstawia zmianę oporu powierzchniowego próbek gleby nieobrobionej, kontrolnej i obrobionej, mierzoną permeametrem. Z rysunku tego wynika, że ​​opór powierzchniowy formulacji UMC, AS, FA i FS znacząco wzrósł wraz ze wzrostem dawki aplikacji. Jednakże wzrost wytrzymałości powierzchniowej był stosunkowo niewielki w przypadku formulacji AA. Jak pokazano na rysunku, formulacje FA i FS z MICP niedegradowanym mocznikiem mają lepszą przepuszczalność powierzchniową w porównaniu z MICP zdegradowanym mocznikiem. Rysunek 13b przedstawia zmianę TDV wraz z oporem powierzchniowym gleby. Z rysunku tego wyraźnie wynika, że ​​dla wydm o oporze powierzchniowym większym niż 100 kPa, progowa prędkość zdzierania przekroczy 25 m/s. Ponieważ opór powierzchniowy in situ można łatwo zmierzyć permeametrem, wiedza ta może pomóc w oszacowaniu TDV bez badań w tunelu aerodynamicznym, służąc tym samym jako wskaźnik kontroli jakości dla zastosowań terenowych.
Wyniki SEM przedstawiono na rysunku 14. Rysunki 14a-b przedstawiają powiększone cząstki niepoddanej obróbce próbki gleby, co wyraźnie wskazuje na jej spoistość i brak naturalnego wiązania lub cementacji. Rysunek 14c przedstawia mikrofotografię SEM próbki kontrolnej poddanej działaniu MICP zdegradowanego mocznikiem. Obraz ten ukazuje obecność wytrąconych jonów CaCO3 w postaci polimorfów kalcytu. Jak pokazano na rysunkach 14d-o, wytrącony jon CaCO3 wiąże cząstki; na mikrofotografiach SEM można również zidentyfikować kuliste kryształy waterytu. Wyniki niniejszego badania oraz wcześniejszych wskazują, że wiązania CaCO3 utworzone w postaci polimorfów waterytu mogą również zapewnić rozsądną wytrzymałość mechaniczną; nasze wyniki pokazują, że opór powierzchni wzrasta do 350 kPa, a prędkość separacji progowej wzrasta z 4,32 do ponad 25 m/s. Wynik ten jest zgodny z wynikami poprzednich badań, zgodnie z którymi matrycą CaCO3 wytrąconego metodą MICP jest wateryt, który charakteryzuje się rozsądną wytrzymałością mechaniczną i odpornością na erozję wietrzną13,40 i może zachować rozsądną odporność na erozję wietrzną nawet po 180 dniach narażenia na warunki środowiskowe panujące w terenie13.
(a, b) Mikrofotografie SEM niepoddanej obróbce gleby, (c) kontrola degradacji mocznika metodą MICP, (df) próbki poddane obróbce AA, (gi) próbki poddane obróbce AS, (jl) próbki poddane obróbce FA i (mo) próbki poddane obróbce FS przy szybkości aplikacji 3 l/m2 przy różnych powiększeniach.
Rysunek 14d-f pokazuje, że po zastosowaniu związków AA, węglan wapnia wytrącił się na powierzchni i między ziarnami piasku, a także zaobserwowano kilka ziaren piasku bez powłoki. W przypadku składników AS, chociaż ilość utworzonego CaCO3 nie wzrosła znacząco (rys. 6f), ilość kontaktów między ziarnami piasku wywołanych przez CaCO3 wzrosła znacząco w porównaniu ze związkami AA (rys. 14g-i).
Z rysunków 14j-l i 14m-o jasno wynika, że ​​zastosowanie mrówczanu wapnia jako źródła wapnia prowadzi do dalszego wzrostu wytrącania CaCO3 w porównaniu ze związkiem AS, co jest zgodne z pomiarami wapniomierzem przedstawionymi na rysunku 6f. Ten dodatkowy CaCO3 wydaje się osadzać głównie na cząstkach piasku i niekoniecznie poprawia jakość kontaktu. Potwierdza to wcześniej zaobserwowane zachowanie: pomimo różnic w ilości wytrącanego CaCO3 (rysunek 6f), trzy formulacje (AS, FA i FS) nie różnią się istotnie pod względem właściwości antyeolicznych (wiatrowych) (rysunek 11) i oporu powierzchniowego (rysunek 13a).
Aby lepiej zobrazować komórki bakteryjne pokryte CaCO3 oraz odcisk bakteryjny na wytrąconych kryształach, wykonano mikrofotografie SEM o dużym powiększeniu, a wyniki przedstawiono na rysunku 15. Jak pokazano, węglan wapnia wytrąca się na komórkach bakteryjnych i dostarcza jąder niezbędnych do wytrącania. Rysunek przedstawia również aktywne i nieaktywne wiązania indukowane przez CaCO3. Można wnioskować, że wzrost liczby nieaktywnych wiązań niekoniecznie prowadzi do dalszej poprawy właściwości mechanicznych. Zatem zwiększone wytrącanie CaCO3 niekoniecznie prowadzi do wyższej wytrzymałości mechanicznej, a wzór wytrącania odgrywa istotną rolę. Kwestia ta została również zbadana w pracach Terzisa i Laloui72 oraz Soghiego i Al-Kabaniego45,73. Aby dokładniej zbadać związek między wzorem wytrącania a wytrzymałością mechaniczną, zaleca się badania MICP z wykorzystaniem obrazowania µCT, co wykracza poza zakres niniejszego badania (tj. wprowadzenie różnych kombinacji źródła wapnia i bakterii do MICP bez amoniaku).
CaCO3 indukował wiązania aktywne i nieaktywne w próbkach poddanych działaniu (a) kompozycji AS i (b) kompozycji FS oraz pozostawiał odcisk komórek bakteryjnych na osadzie.
Jak pokazano na rysunkach 14j-o i 15b, widoczna jest warstwa CaCO (według analizy EDX, procentowy skład każdego pierwiastka w warstwie to węgiel 11%, tlen 46,62% i wapń 42,39%, co jest bardzo zbliżone do procentowej zawartości CaCO na rysunku 16). Warstwa ta pokrywa kryształy waterytu i cząstki gleby, pomagając utrzymać integralność układu gleba-osad. Obecność tej warstwy zaobserwowano jedynie w próbkach poddanych działaniu preparatu na bazie mrówczanu.
W tabeli 2 porównano wytrzymałość powierzchniową, prędkość odrywania progowego oraz zawartość CaCO3 indukowanego biologicznie w glebach poddanych działaniu ścieżek MICP degradujących mocznik i niedegradujących mocznika w poprzednich badaniach oraz w niniejszym badaniu. Badania dotyczące odporności na erozję wietrzną próbek wydm poddanych działaniu MICP są ograniczone. Meng i in. zbadali odporność na erozję wietrzną próbek wydm poddanych działaniu MICP, degradujących mocznik, za pomocą dmuchawy do liści,13 natomiast w niniejszym badaniu próbki wydm niedegradujące mocznika (a także próbki kontrolne degradujące mocznik) testowano w tunelu aerodynamicznym i poddawano działaniu czterech różnych kombinacji bakterii i substancji.
Jak widać, niektóre wcześniejsze badania uwzględniały wysokie dawki aplikacji przekraczające 4 l/m213,41,74. Warto zauważyć, że wysokie dawki aplikacji mogą nie być łatwe do zastosowania w terenie z ekonomicznego punktu widzenia ze względu na koszty związane z zaopatrzeniem w wodę, transportem i aplikacją dużych objętości wody. Niższe dawki aplikacji, takie jak 1,62-2 l/m2, również pozwoliły uzyskać dość dobre wytrzymałości powierzchni do 190 kPa i TDV przekraczające 25 m/s. W niniejszym badaniu wydmy traktowane MICP na bazie mrówczanu bez degradacji mocznika osiągnęły wysokie wytrzymałości powierzchni, które były porównywalne z uzyskanymi przy ścieżce degradacji mocznika w tym samym zakresie dawek aplikacji (tj. próbki traktowane MICP na bazie mrówczanu bez degradacji mocznika były również w stanie osiągnąć ten sam zakres wartości wytrzymałości powierzchni, jak podali Meng i in., 13, Rysunek 13a) przy wyższych dawkach aplikacji. Można również zauważyć, że przy dawce 2 l/m2, wydajność węglanu wapnia w przypadku łagodzenia erozji wietrznej przy prędkości wiatru 25 m/s wyniosła 2,25% w przypadku MICP na bazie mrówczanu bez degradacji mocznika, co jest wartością bardzo zbliżoną do wymaganej ilości CaCO3 (tj. 2,41%) w porównaniu z wydmami traktowanymi kontrolnym MICP z degradacją mocznika przy tej samej dawce i tej samej prędkości wiatru (25 m/s).
Zatem z tej tabeli można wywnioskować, że zarówno ścieżka degradacji mocznika, jak i ścieżka degradacji bez mocznika mogą zapewnić całkiem akceptowalną wydajność pod względem oporu powierzchniowego i TDV. Główną różnicą jest to, że ścieżka degradacji bez mocznika nie zawiera amoniaku, a zatem ma mniejszy wpływ na środowisko. Ponadto, metoda MICP oparta na mrówczanie bez degradacji mocznika zaproponowana w tym badaniu wydaje się działać lepiej niż metoda MICP oparta na octanie bez degradacji mocznika. Chociaż Mohebbi i in. badali metodę MICP opartą na octanie bez degradacji mocznika, ich badanie obejmowało próbki na płaskich powierzchniach9. Ze względu na wyższy stopień erozji spowodowanej tworzeniem się wirów wokół próbek wydm i wynikające z tego ścinanie, które skutkuje niższym TDV, oczekuje się, że erozja wietrzna próbek wydm będzie bardziej widoczna niż erozja płaskich powierzchni przy tej samej prędkości.