Różne teorie obrony roślin dostarczają ważnych wskazówek teoretycznych do wyjaśnienia wzorców wyspecjalizowanego metabolizmu roślin, ale ich kluczowe przewidywania wciąż czekają na sprawdzenie. W niniejszym opracowaniu wykorzystaliśmy bezstronną analizę tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) do systematycznego zbadania metabolomu atenuowanych szczepów tytoniu, od pojedynczych roślin do populacji i blisko spokrewnionych gatunków, a także przetworzyliśmy dużą liczbę teorii cech spektrometrii mas w oparciu o widma związków chemicznych w informacjach. Ramy do testowania kluczowych przewidywań teorii optymalnej obrony (OD) i teorii ruchomego celu (MT). Komponent informacyjny metabolomiki roślin jest zgodny z teorią OD, ale przeczy głównemu przewidywaniu teorii MT dotyczącemu dynamiki metabolomiki spowodowanej przez roślinożerców. W skali mikro- i makroewolucyjnej sygnał jasmonianowy został zidentyfikowany jako główny czynnik determinujący OD, podczas gdy sygnał etylenowy zapewnił precyzyjne dostrojenie specyficznej dla roślinożerców odpowiedzi, opisanej przez sieć molekularną MS/MS.
Specjalne metabolity o zróżnicowanej strukturze są głównymi uczestnikami adaptacji roślin do środowiska, zwłaszcza w obronie przed wrogami (1). Niesamowita dywersyfikacja specjalnego metabolizmu roślin stała się impulsem do dziesięcioleci dogłębnych badań nad wieloma aspektami jego funkcji ekologicznych i doprowadziła do powstania długiej listy teorii obronnych roślin, które stanowią ewolucyjny i ekologiczny rozwój interakcji między roślinami a owadami. Badania empiryczne dostarczają istotnych wskazówek (2). Jednakże te teorie obronne roślin nie podążały normatywną ścieżką hipotetycznego rozumowania dedukcyjnego, w którym kluczowe przewidywania znajdowały się na tym samym poziomie analizy (3) i były testowane eksperymentalnie w celu przyspieszenia kolejnego cyklu rozwoju teoretycznego (4). Ograniczenia techniczne ograniczają gromadzenie danych do określonych kategorii metabolicznych i wykluczają kompleksową analizę wyspecjalizowanych metabolitów, uniemożliwiając w ten sposób porównania między kategoriami, które są niezbędne dla rozwoju teoretycznego (5). Brak kompleksowych danych metabolomicznych i wspólnej waluty do porównywania przepływu pracy w przestrzeni metabolicznej między różnymi grupami roślin utrudnia naukową dojrzałość tej dziedziny.
Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) i metabolomiki pozwalają na kompleksową charakterystykę zmian metabolicznych w obrębie i między gatunkami danego kladu systemu, a także mogą być łączone z metodami obliczeniowymi w celu obliczenia podobieństwa strukturalnego między tymi złożonymi mieszaninami. Wcześniejsza znajomość chemii (5). Połączenie zaawansowanych technologii analitycznych i obliczeniowych zapewnia niezbędne ramy do długoterminowego testowania wielu przewidywań sformułowanych przez ekologiczne i ewolucyjne teorie różnorodności metabolicznej. Shannon (6) po raz pierwszy wprowadził teorię informacji w swoim przełomowym artykule z 1948 roku, kładąc podwaliny pod matematyczną analizę informacji, która była wykorzystywana w wielu dziedzinach poza jej pierwotnym zastosowaniem. W genomice teoria informacji została z powodzeniem zastosowana do ilościowego określenia informacji konserwatywnej sekwencji (7). W badaniach transkryptomicznych teoria informacji analizuje ogólne zmiany w transkryptomie (8). W poprzednich badaniach zastosowaliśmy statystyczne ramy teorii informacji do metabolomiki, aby opisać metaboliczną wiedzę ekspercką na poziomie tkankowym u roślin (9). W tym artykule łączymy przepływ pracy oparty na MS/MS ze statystycznymi ramami teorii informacji, charakteryzującymi się różnorodnością metaboliczną we wspólnej walucie, aby porównać kluczowe przewidywania teorii obrony roślin metabolomu indukowanego przez roślinożerców.
Teoretyczne ramy obrony roślin są zazwyczaj wzajemnie się wykluczające i można je podzielić na dwie kategorie: te, które próbują wyjaśnić dystrybucję specyficznych dla roślin metabolitów w oparciu o funkcje obronne, takie jak optymalna obrona (OD) (10), ruchomy cel (MT) (11) i teoria wyglądu (12), podczas gdy inne szukają mechanicznych wyjaśnień tego, jak zmiany w dostępności zasobów wpływają na wzrost roślin i akumulację wyspecjalizowanych metabolitów, takich jak hipoteza równowagi węgla i składników odżywczych (13), hipoteza tempa wzrostu (14) i hipoteza równowagi wzrostu i różnicowania (15). Te dwa zestawy teorii znajdują się na różnych poziomach analizy (4). Jednak dwie teorie obejmujące funkcje obronne na poziomie funkcjonalnym dominują w rozmowie o konstytutywnych i indukowalnych mechanizmach obronnych roślin: teoria OD, która zakłada, że ​​rośliny inwestują w swoje kosztowne chemiczne mechanizmy obronne tylko wtedy, gdy jest to potrzebne, na przykład, gdy są spożywane. Gdy zwierzę trawiaste atakuje, zatem zgodnie z możliwością przyszłego ataku, przypisywany jest związek o funkcji obronnej (10); Hipoteza MT zakłada, że ​​nie istnieje oś kierunkowej zmiany metabolitu, ale metabolit zmienia się losowo, co stwarza możliwość zablokowania metabolicznego „celu ruchu” atakujących roślinożerców. Innymi słowy, te dwie teorie formułują przeciwstawne przewidywania dotyczące przebudowy metabolicznej zachodzącej po ataku roślinożerców: związek między jednokierunkową akumulacją metabolitów o funkcji obronnej (OD) a niekierunkowymi zmianami metabolicznymi (MT) (11).
Hipotezy OD i MT obejmują nie tylko indukowane zmiany w metabolomie, ale także ekologiczne i ewolucyjne konsekwencje akumulacji tych metabolitów, takie jak adaptacyjne koszty i korzyści tych zmian metabolicznych w określonym środowisku ekologicznym (16). Chociaż obie hipotezy uznają obronną funkcję wyspecjalizowanych metabolitów, która może być kosztowna lub nie, kluczowe przewidywanie, które odróżnia hipotezy OD i MT, leży w kierunkowości indukowanych zmian metabolicznych. Przewidywanie teorii OD spotkało się jak dotąd z największą uwagą eksperymentalną. Testy te obejmują badanie bezpośrednich lub pośrednich funkcji obronnych różnych tkanek określonych związków w szklarniach i warunkach naturalnych, a także zmian w stadium rozwoju roślin (17-19). Jednak jak dotąd, ze względu na brak przepływu pracy i ram statystycznych do globalnej kompleksowej analizy różnorodności metabolicznej dowolnego organizmu, główna prognoza różnic między tymi dwiema teoriami (tj. kierunek zmian metabolicznych) pozostaje do przetestowania. W niniejszym artykule przedstawiamy taką analizę.
Jedną z najważniejszych cech metabolitów roślinnych jest ich ekstremalna różnorodność strukturalna na wszystkich poziomach, od pojedynczych roślin, populacji po podobne gatunki (20). Wiele zmian ilościowych w wyspecjalizowanych metabolitach można zaobserwować w skali populacji, podczas gdy silne różnice jakościowe zwykle utrzymują się na poziomie gatunku (20). Dlatego różnorodność metaboliczna roślin jest głównym aspektem różnorodności funkcjonalnej, odzwierciedlając zdolność adaptacji do różnych nisz, zwłaszcza tych o różnych możliwościach inwazji ze strony specjalnych owadów i pospolitych roślinożerców (21). Od przełomowego artykułu Fraenkla (22) na temat przyczyn istnienia metabolitów roślinnych, interakcje z różnymi owadami są uważane za istotne czynniki presji selekcyjnej i uważa się, że te interakcje ukształtowały rośliny w trakcie ewolucji. Szlak metaboliczny (23). Międzygatunkowe różnice w różnorodności wyspecjalizowanych metabolitów mogą również odzwierciedlać równowagę fizjologiczną związaną z konstytutywną i indukowaną obroną roślin przed strategiami roślinożerców, ponieważ oba gatunki są często negatywnie skorelowane ze sobą (24). Chociaż utrzymywanie dobrego systemu obronnego przez cały czas może być korzystne, terminowe zmiany metaboliczne związane z systemem obronnym przynoszą wyraźne korzyści, umożliwiając roślinom alokację cennych zasobów na inne inwestycje fizjologiczne (19, 24) i unikanie konieczności symbiozy. Szkody uboczne (25). Ponadto, te reorganizacje wyspecjalizowanych metabolitów spowodowane przez owady roślinożerne mogą prowadzić do destrukcyjnego rozmieszczenia w populacji (26) i mogą odzwierciedlać bezpośrednie odczyty istotnych naturalnych zmian w sygnale kwasu jasmonowego (JA), który może być utrzymywany w populacji. Wysokie i niskie sygnały JA to kompromisy między obroną przed roślinożercami a konkurencją ze strony określonych gatunków (27). Ponadto, wyspecjalizowane szlaki biosyntezy metabolitów będą ulegać szybkiej utracie i transformacji w trakcie ewolucji, co doprowadzi do nierównomiernego rozmieszczenia metabolicznego wśród blisko spokrewnionych gatunków (28). Te polimorfizmy mogą szybko się kształtować w odpowiedzi na zmieniające się wzorce roślinożerców (29), co oznacza, że ​​wahania w społecznościach roślinożerców są kluczowym czynnikiem napędzającym heterogeniczność metaboliczną.
Tutaj rozwiązaliśmy konkretnie następujące problemy. (I) W jaki sposób owady roślinożerne rekonfigurują metabolom roślin? (Ii) Jakie są główne składniki informacyjne plastyczności metabolicznej, które można określić ilościowo, aby przetestować przewidywania teorii obrony długoterminowej? (Iii) Czy przeprogramować metabolom roślin w sposób unikalny dla atakującego? Jeśli tak, to jaką rolę odgrywa hormon roślinny w dostosowywaniu specyficznej odpowiedzi metabolicznej i które metabolity przyczyniają się do gatunkowej specyficzności obrony? (Iv) Ponieważ przewidywania formułowane przez wiele teorii obrony można rozszerzyć na wszystkie poziomy tkanek biologicznych, zadaliśmy pytanie, jak spójna jest wywołana odpowiedź metaboliczna w porównaniu wewnętrznym z porównaniem międzygatunkowym? W tym celu systematycznie badaliśmy metabolom liści nikotyny tytoniowej, która jest ekologiczną rośliną modelową o bogatym wyspecjalizowanym metabolizmie i jest skuteczna przeciwko larwom dwóch rodzimych roślinożerców, Lepidoptera Datura (Ms) (bardzo agresywna, głównie zjadana). Na Solanaceae i Spodoptera littoralis (Sl), robaki liści bawełny są rodzajem „rodzaju”, z roślinami żywicielskimi Solanaceae i innymi żywicielami z innych rodzajów i rodzin Plant food. Przeprowadziliśmy analizę widma metabolomicznego MS/MS i wyodrębniliśmy statystyczne deskryptory teorii informacji, aby porównać teorie OD i MT. Utworzyliśmy mapy specyficzności, aby ujawnić tożsamość kluczowych metabolitów. Analizę rozszerzono na rodzimą populację N. nasi i blisko spokrewnionych gatunków tytoniu, aby dokładniej przeanalizować kowariancję między sygnalizacją hormonów roślinnych a indukcją OD.
Aby uchwycić ogólną mapę plastyczności i struktury metabolomu liści roślinożernego tytoniu, zastosowaliśmy wcześniej opracowany proces analizy i obliczeń, aby kompleksowo zebrać i dekonwoluować niezależne od danych widma MS/MS o wysokiej rozdzielczości z ekstraktów roślinnych (9). Ta niezróżnicowana metoda (zwana MS/MS) może konstruować nieredundantne widma związków, które następnie mogą być używane do wszystkich analiz na poziomie związków opisanych tutaj. Te dekonwoluowane metabolity roślinne są różnego typu i składają się z setek do tysięcy metabolitów (tutaj około 500-1000 s/MS/MS). Tutaj rozważamy plastyczność metaboliczną w ramach teorii informacji i kwantyfikujemy różnorodność i profesjonalizm metabolomu w oparciu o entropię Shannona rozkładu częstości metabolicznej. Korzystając z wcześniej zaimplementowanego wzoru (8), obliczyliśmy zestaw wskaźników, które mogą być użyte do ilościowego określenia różnorodności metabolomu (wskaźnik Hj), specjalizacji profilu metabolicznego (wskaźnik δj) i specyficzności metabolicznej pojedynczego metabolitu (wskaźnik Si). Ponadto zastosowaliśmy Wskaźnik Względnej Plastyczności Odległość (RDPI) do ilościowego określenia indukowalności metabolomu u roślinożerców (Rysunek 1A) (30). W ramach tych ram statystycznych traktujemy widmo MS/MS jako podstawową jednostkę informacji i przetwarzamy względną obfitość MS/MS na mapę rozkładu częstości, a następnie wykorzystujemy entropię Shannona do oszacowania różnorodności metabolomu na jej podstawie. Specjalizacja metabolomu jest mierzona średnią specyficznością pojedynczego widma MS/MS. Zatem wzrost obfitości niektórych klas MS/MS po indukcji przez roślinożerców jest przekształcany w widmową indukowalność, RDPI i specjalizację, tj. wzrost indeksu δj, ponieważ wytwarzane są bardziej wyspecjalizowane metabolity i wytwarzany jest wysoki indeks Si. Obniżenie indeksu różnorodności Hj odzwierciedla, że ​​albo liczba wytworzonych MS/MS jest zmniejszona, albo rozkład częstości profilu zmienia się w mniej jednorodnym kierunku, jednocześnie zmniejszając jego ogólną niepewność. Poprzez obliczenie indeksu Si możliwe jest wskazanie, które MS/MS są indukowane przez określonych roślinożerców, i odwrotnie, które MS/MS nie reagują na indukcję, co jest kluczowym wskaźnikiem rozróżniającym przewidywania MT i OD.
(A) Statystyczne deskryptory użyte dla roślinożernych (H1 do Hx) danych MS/MS-indukowalności (RDPI), różnorodności (indeks Hj), specjalizacji (indeks δj) i specyficzności metabolitów (indeks Si). Wzrost stopnia specjalizacji (δj) wskazuje, że średnio powstaną bardziej specyficzne metabolity roślinożerne, podczas gdy spadek różnorodności (Hj) wskazuje na spadek produkcji metabolitów lub nierównomierne rozmieszczenie metabolitów na mapie rozmieszczenia. Wartość Si ocenia, czy metabolit jest specyficzny dla danych warunków (w tym przypadku roślinożerności), czy też odwrotnie, utrzymuje się na tym samym poziomie. (B) Konceptualny diagram przewidywania teorii obrony z wykorzystaniem osi teorii informacji. Teoria OD przewiduje, że atak roślinożercy zwiększy metabolity obrony, zwiększając tym samym δj. Jednocześnie Hj maleje, ponieważ profil jest reorganizowany w kierunku zmniejszonej niepewności informacji metabolicznej. Teoria MT przewiduje, że atak roślinożerców spowoduje niekierunkowe zmiany w metabolomie, zwiększając tym samym Hj jako wskaźnik zwiększonej niepewności informacji metabolicznej i powodując losowy rozkład Si. Zaproponowaliśmy również model mieszany, najlepszy MT, w którym niektóre metabolity o wyższych wartościach obronnych będą szczególnie podwyższone (wysoka wartość Si), podczas gdy inne będą wykazywały losowe reakcje (niższa wartość Si).
Używając deskryptorów teorii informacji, interpretujemy teorię OD, aby przewidzieć, że wywołane przez roślinożerców specjalne zmiany metabolitów w nieindukowanym stanie konstytutywnym doprowadzą do (i) wzrostu specyficzności metabolicznej (indeks Si) napędzającej specyficzność metabonomiczną (indeks δj) Wzrost) pewnych specjalnych grup metabolitów o wyższej wartości obronnej oraz (ii) spadku różnorodności metabolomu (indeks Hj) ze względu na zmianę rozkładu częstości metabolizmu na bardziej rozkład ciał leptyny. Na poziomie pojedynczego metabolitu oczekuje się uporządkowanego rozkładu Si, gdzie metabolit będzie zwiększał wartość Si zgodnie ze swoją wartością obronną (Rysunek 1B). W tym kontekście wyjaśniamy teorię MT, aby przewidzieć, że wzbudzenie doprowadzi do (i) niekierunkowych zmian w metabolitach, skutkujących spadkiem indeksu δj, oraz (ii) wzrostu indeksu Hj ze względu na wzrost niepewności metabolicznej. Lub losowości, którą można skwantyfikować za pomocą entropii Shannona w postaci uogólnionej różnorodności. Jeśli chodzi o skład metaboliczny, teoria MT przewiduje losowy rozkład Si. Biorąc pod uwagę, że niektóre metabolity znajdują się w określonych warunkach, a inne nie, a ich wartość obronna zależy od środowiska, zaproponowaliśmy również mieszany model obronny, w którym δj i Hj są rozłożone wzdłuż Si. Wzrost we wszystkich kierunkach powoduje, że tylko niektóre grupy metabolitów o wyższych wartościach obronnych będą szczególnie zwiększać Si, podczas gdy inne będą miały rozkład losowy (rysunek 1B).
Aby przetestować przewidywanie przedefiniowanej teorii obrony na osi deskryptora teorii informacji, wyhodowaliśmy larwy roślinożerców eksperckich (Ms) lub generalistycznych (Sl) na liściach Nepenthes pallens (rysunek 2A). Za pomocą analizy MS/MS uzyskaliśmy 599 nieredundantnych widm MS/MS (plik danych S1) z ekstraktów metanolowych z tkanki liści pobranej po żerowaniu gąsienic. Użycie indeksów RDPI, Hj i δj do wizualizacji rekonfiguracji zawartości informacji w plikach konfiguracyjnych MS/MS ujawnia interesujące wzorce (rysunek 2B). Ogólny trend jest taki, że zgodnie z opisem deskryptora informacji, wraz z kontynuacją żerowania gąsienic na liściach, stopień reorganizacji metabolizmu wzrasta z czasem: 72 godziny po żerowaniu roślinożercy, RDPI znacząco wzrasta. W porównaniu z nieuszkodzoną kontrolą, Hj było istotnie zmniejszone, co wynikało ze zwiększonego stopnia specjalizacji profilu metabolicznego, który został skwantyfikowany za pomocą indeksu δj. Ta widoczna tendencja jest zgodna z przewidywaniami teorii OD, ale jest niezgodna z głównymi przewidywaniami teorii MT, która zakłada, że ​​losowe (bezkierunkowe) zmiany poziomów metabolitów są wykorzystywane jako kamuflaż obronny (Rysunek 1B). Chociaż zawartość elicytorów wydzieliny doustnej (OS) i zachowania żywieniowe tych dwóch roślinożerców są różne, ich bezpośrednie żerowanie skutkowało podobnymi zmianami kierunków Hj i δj w trakcie 24-godzinnego i 72-godzinnego okresu zbiorów. Jedyna różnica wystąpiła po 72 godzinach RDPI. W porównaniu z tym spowodowanym karmieniem Ms, ogólny metabolizm wywołany karmieniem Sl był wyższy.
(A) Projekt eksperymentalny: pospolite świnie (S1) lub eksperci (Ms) roślinożercy są karmieni odsolonymi liśćmi dzbaneczników, podczas gdy w przypadku symulowanego roślinożerstwa OS Ms (W + OSMs) jest używany do radzenia sobie z nakłuwaniem rany w standaryzowanych pozycjach liści. Larwy S1 (W + OSSl) lub woda (W + W). Kontrola (C) to nieuszkodzony liść. (B) Indukowalność (RDPI w porównaniu z wykresem kontrolnym), różnorodność (indeks Hj) i specjalizacja (indeks δj) indeks obliczony dla specjalnej mapy metabolitów (599 MS/MS; plik danych S1). Gwiazdki oznaczają istotne różnice między bezpośrednim karmieniem roślinożerców a grupą kontrolną (test t-Studenta ze sparowanym testem t, *P<0,05 i ***P<0,001). ns, nieistotne. (C) Wskaźnik rozdzielczości czasowej głównego (niebieskie pole: aminokwas, kwas organiczny i cukier; plik danych S2) i specjalnego spektrum metabolitów (czerwone pole 443 MS/MS; plik danych S1) po symulowanym traktowaniu roślinożernym. Kolorowy pasek odnosi się do 95% przedziału ufności. Gwiazdka oznacza istotną różnicę między traktowaniem a kontrolą [kwadratowa analiza wariancji (ANOVA), a następnie istotność statystyczna różnic Tukeya (HSD) dla wielokrotnych porównań post hoc, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001]. (D) Specjalizacja wykresów punktowych i specjalnych profili metabolitów (powtórzone próbki z różnymi traktowaniami).
Aby zbadać, czy remodeling na poziomie metabolomu wywołany przez roślinożerców znajduje odzwierciedlenie w zmianach poziomu poszczególnych metabolitów, skupiliśmy się najpierw na metabolitach badanych wcześniej w liściach Nepenthes pallens o udowodnionej odporności na roślinożerców. Amidy fenolowe to koniugaty hydroksycynamonamidu i poliaminy, które kumulują się podczas procesu roślinożerstwa owadów i o których wiadomo, że obniżają wydajność owadów (32). Przeszukaliśmy prekursory odpowiednich MS/MS i przedstawiliśmy ich kumulatywne krzywe kinetyczne (Rysunek S1). Nic dziwnego, że pochodne fenolu, które nie są bezpośrednio zaangażowane w obronę przed roślinożercami, takie jak kwas chlorogenowy (CGA) i rutyna, ulegają zmniejszeniu po roślinożerstwie. Z kolei roślinożercy mogą sprawić, że fenoloamidy będą bardzo silne. Ciągłe karmienie obu roślinożerców skutkowało niemal takim samym widmem wzbudzenia fenolamidów, a ten wzorzec był szczególnie widoczny w przypadku syntezy fenolamidów de novo. To samo zjawisko można zaobserwować podczas badania szlaku 17-hydroksygeranylnonanodiolu diterpenowych glikozydów (17-HGL-DTG), który wytwarza dużą liczbę acyklicznych diterpenów o skutecznych funkcjach przeciwko roślinożercom (33), z których karmienie Ms Sl wywołało podobny profil ekspresji (ryc. S1).
Potencjalną wadą eksperymentów z bezpośrednim żerowaniem roślinożerców jest różnica w tempie konsumpcji liści i czasie żerowania roślinożerców, co utrudnia wyeliminowanie specyficznych dla roślinożerców efektów spowodowanych przez rany i roślinożerców. Aby lepiej rozwiązać kwestię specyficzności gatunkowej roślinożerców w zakresie indukowanej odpowiedzi metabolicznej liści, przeprowadziliśmy symulację żerowania larw Ms i Sl, natychmiast podając świeżo zebrany OS (OSM i OSS1) do standardowego nakłucia W o spójnych pozycjach liści. Procedura ta nazywa się traktowaniem W + OS i standaryzuje indukcję poprzez precyzyjne określenie czasu wystąpienia reakcji wywołanej przez roślinożercę bez powodowania zakłócających efektów różnic w tempie lub ilości utraconej tkanki (Rysunek 2A) (34). Korzystając z analizy i obliczeń MS/MS, uzyskaliśmy 443 widma MS/MS (plik danych S1), które nakładały się na widma zebrane wcześniej z eksperymentów z bezpośrednim żerowaniem. Analiza teorii informacji tego zestawu danych MS/MS wykazała, że ​​przeprogramowanie metabolomów wyspecjalizowanych w liściach przez symulację roślinożerców wykazało indukcje specyficzne dla OS (Rysunek 2C). W szczególności, w porównaniu z leczeniem OSS1, OSM spowodowało wzmocnienie specjalizacji metabolomu po 4 godzinach. Warto zauważyć, że w porównaniu z zestawem danych eksperymentalnych dotyczących bezpośredniego karmienia roślinożerców, kinetyka metaboliczna wizualizowana w przestrzeni dwuwymiarowej przy użyciu Hj i δj jako współrzędnych oraz kierunkowość specjalizacji metabolomu w odpowiedzi na symulowane leczenie roślinożerców w czasie wzrastają zgodnie (Rysunek 2D). Jednocześnie określiliśmy ilościowo zawartość aminokwasów, kwasów organicznych i cukrów (plik danych S2), aby zbadać, czy ten ukierunkowany wzrost biegłości metabolomu wynika z rekonfiguracji centralnego metabolizmu węgla w odpowiedzi na symulowane roślinożercy (Rysunek S2). Aby lepiej wyjaśnić ten wzór, dodatkowo monitorowaliśmy kinetykę akumulacji metabolicznej wcześniej omówionych szlaków fenolamidu i 17-HGL-DTG. Specyficzna dla OS indukcja u roślinożerców przekształca się w zróżnicowany wzór przegrupowania w metabolizmie fenoloamidu (rysunek S3). Amidy fenolowe zawierające reszty kumarynowe i kawoilowe są preferencyjnie indukowane przez OSS1, podczas gdy OSM-y wyzwalają specyficzną indukcję koniugatów ferulowych. W przypadku szlaku 17-HGL-DTG wykryto zróżnicowaną indukcję OS przez produkty malonylacji i dimalonylacji (rysunek S3).
Następnie zbadaliśmy plastyczność transkryptomu indukowaną przez OS, wykorzystując zestaw danych mikromacierzy przebiegu w czasie, który symuluje użycie OSM do traktowania liści rośliny rozetowej u roślinożerców. Kinetyka pobierania próbek zasadniczo pokrywa się z kinetyką użytą w tym badaniu metabolomicznym (35). W porównaniu z rekonfiguracją metabolomu, w której plastyczność metaboliczna jest szczególnie zwiększona w czasie, obserwujemy przejściowe wybuchy transkrypcji w liściach indukowanych przez Ms, gdzie indukowalność transkryptomu (RDPI) i specjalizacja (δj) są na poziomie 1. Nastąpił znaczący wzrost godzin, a różnorodność (Hj) w tym punkcie czasowym, ekspresja BMP1 została znacząco zmniejszona, po czym nastąpiła relaksacja specjalizacji transkryptomu (Rysunek S4). Rodziny genów metabolicznych (takie jak P450, glikozylotransferaza i acylotransferaza BAHD) uczestniczą w procesie składania specjalnych metabolitów z jednostek strukturalnych pochodzących z metabolizmu pierwotnego, zgodnie ze wspomnianym wcześniej wczesnym modelem wysokiej specjalizacji. W ramach studium przypadku przeanalizowano szlak fenyloalaniny. Analiza potwierdziła, że ​​geny rdzeniowe metabolizmu fenolamidu są silnie indukowane przez OS u roślinożerców w porównaniu z roślinami niepodlegającymi temu procesowi, a ich wzorce ekspresji są ściśle powiązane. Czynnik transkrypcyjny MYB8 oraz geny strukturalne PAL1, PAL2, C4H i 4CL, zlokalizowane przed tym szlakiem, wykazały wczesną inicjację transkrypcji. Acylotransferazy, które odgrywają rolę w końcowym procesie tworzenia fenolamidu, takie jak AT1, DH29 i CV86, wykazują przedłużony wzorzec regulacji w górę (rysunek S4). Powyższe obserwacje wskazują, że wczesna inicjacja specjalizacji transkryptomu i późniejsze nasilenie specjalizacji metabolomicznej są sprzężone, co może wynikać z synchronicznego systemu regulacyjnego, który inicjuje silną reakcję obronną.
Rekonfiguracja w sygnalizacji hormonów roślinnych działa jak warstwa regulacyjna, która integruje informacje roślinożerne w celu przeprogramowania fizjologii roślin. Po symulacji roślinożerców zmierzyliśmy skumulowaną dynamikę kluczowych kategorii hormonów roślinnych i zwizualizowaliśmy czasową koekspresję między nimi [współczynnik korelacji Pearsona (PCC) > 0,4] (Rysunek 3A). Zgodnie z oczekiwaniami, hormony roślinne związane z biosyntezą są powiązane w ramach sieci koekspresji hormonów roślinnych. Ponadto, specyficzność metaboliczna (indeks Si) jest mapowana na tę sieć, aby wyróżnić hormony roślinne indukowane przez różne metody leczenia. Narysowano dwa główne obszary specyficznej odpowiedzi roślinożerców: jeden znajduje się w klastrze JA, gdzie JA (jego biologicznie aktywna forma JA-Ile) i inne pochodne JA wykazują najwyższy wynik Si; drugi to etylen (ET). Giberelina wykazała jedynie umiarkowany wzrost swoistości dla roślinożerców, podczas gdy inne hormony roślinne, takie jak cytokinina, auksyna i kwas abscysynowy, charakteryzowały się niską swoistością indukcji dla roślinożerców. W porównaniu z zastosowaniem wyłącznie W + W, wzmocnienie wartości szczytowej pochodnych JA poprzez zastosowanie OS (W + OS) można zasadniczo przekształcić w silny specyficzny wskaźnik JA. Co zaskakujące, wiadomo, że OSM i OSS1 o różnej zawartości elicytorów powodują podobną akumulację JA i JA-Ile. W przeciwieństwie do OSS1, OSM jest specyficznie i silnie indukowany przez OSM, podczas gdy OSS1 nie wzmacnia reakcji ran bazalnych (ryc. 3B).
(A) Analiza sieci koekspresji oparta na obliczeniu PCC symulacji kinetyki akumulacji hormonu roślinnego wywołanej przez roślinożercę. Węzeł reprezentuje pojedynczy hormon roślinny, a rozmiar węzła reprezentuje indeks Si specyficzny dla hormonu roślinnego między zabiegami. (B) Akumulacja JA, JA-Ile i ET w liściach spowodowana różnymi zabiegami oznaczona różnymi kolorami: morelowy, W + OSM; niebieski, W + OSSl; czarny, W + W; szary, C (kontrola). Gwiazdki oznaczają istotne różnice między zabiegiem a kontrolą (dwuczynnikowa ANOVA, a następnie post hoc wielokrotne porównanie Tukey HSD, *** P <0,001). Analiza teorii informacji (C)697 MS/MS (plik danych S1) w biosyntezie JA i zaburzonym spektrum percepcji (irAOC i irCOI1) i (D)585 MS/MS (plik danych S1) w ETR1 z zaburzonym sygnałem ET Dwa symulowane zabiegi roślinożerne wyzwoliły linie roślinne i puste rośliny kontrolne nośnika (EV). Gwiazdki oznaczają istotne różnice między leczeniem W+OS a nieuszkodzoną kontrolą (dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA), a następnie wielokrotne porównanie post hoc metodą Tukeya HSD, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). (E) Wykresy rozproszone opozycji wobec specjalizacji. Kolory reprezentują różne szczepy modyfikowane genetycznie; symbole reprezentują różne metody leczenia: trójkąt, W + OSS1; prostokąt, W + OSM; kółko C
Następnie używamy genetycznie zmodyfikowanego szczepu atenuowanych Nepenthes (irCOI1 i sETR1) w kluczowych etapach biosyntezy JA i ET (irAOC i irACO) oraz percepcji (irCOI1 i sETR1), aby przeanalizować metabolizm tych dwóch hormonów roślinnych u roślinożerców Względny wkład reprogramowania. Zgodnie z poprzednimi eksperymentami potwierdziliśmy indukcję OS u roślin z pustym nośnikiem (EV) (rysunek 3, C do D) i ogólny spadek indeksu Hj spowodowany przez OSM, podczas gdy indeks δj wzrósł. Odpowiedź jest wyraźniejsza niż odpowiedź wywołana przez OSS1. Dwuliniowy wykres wykorzystujący Hj i δj jako współrzędne pokazuje specyficzną deregulację (rysunek 3E). Najbardziej oczywistym trendem jest to, że w szczepach pozbawionych sygnału JA, różnorodność metabolomu i zmiany specjalizacji spowodowane przez roślinożerców są prawie całkowicie wyeliminowane (rysunek 3C). Natomiast cicha percepcja ET w roślinach sETR1, chociaż ogólny wpływ na zmiany metabolizmu roślinożerców jest znacznie niższy niż w przypadku sygnalizacji JA, osłabia różnicę w indeksach Hj i δj między wzbudzeniami OSM i OSS1 (Rysunek 3D i Rysunek S5). . Wskazuje to, że oprócz podstawowej funkcji przekazywania sygnału JA, przekazywanie sygnału ET służy również jako dostrajanie specyficznej dla gatunku odpowiedzi metabolicznej roślinożerców. Zgodnie z tą funkcją dostrajania nie było zmiany w ogólnej indukcji metabolomu w roślinach sETR1. Z drugiej strony, w porównaniu z roślinami sETR1, rośliny irACO indukowały podobne ogólne amplitudy zmian metabolicznych powodowanych przez roślinożerców, ale wykazały istotnie różne wyniki Hj i δj między wyzwaniami OSM i OSS1 (Rysunek S5).
Aby zidentyfikować wyspecjalizowane metabolity, które mają istotny wkład w gatunkowo specyficzną odpowiedź roślinożerców i dostroić ich produkcję poprzez sygnały ET, zastosowaliśmy wcześniej opracowaną strukturalną metodę MS/MS. Metoda ta opiera się na metodzie bi-clusteringu, aby ponownie wywnioskować rodzinę metaboliczną z fragmentów MS/MS [znormalizowany iloczyn skalarny (NDP)] i wynik podobieństwa oparty na stracie neutralnej (NL). Zestaw danych MS/MS skonstruowany poprzez analizę linii transgenicznych ET wygenerował 585 MS/MS (plik danych S1), które zostały rozdzielone przez grupowanie ich w siedem głównych modułów MS/MS (M) (Rysunek 4A). Niektóre z tych modułów są gęsto upakowane wcześniej scharakteryzowanymi specjalnymi metabolitami: na przykład M1, M2, M3, M4 i M7 są bogate w różne pochodne fenolu (M1), glikozydy flawonoidowe (M2), cukry acylowe (M3 i M4) i 17-HGL-DTG (M7). Dodatkowo obliczana jest specyficzna informacja metaboliczna (indeks Si) pojedynczego metabolitu w każdym module, a jego rozkład Si można intuicyjnie obserwować. Krótko mówiąc, widma MS/MS wykazujące wysoką specyficzność roślinożerstwa i genotypu charakteryzują się wysokimi wartościami Si, a statystyki kurtozy wskazują na rozkład futra w prawym rogu ogona. Jeden z takich ubogich rozkładów koloidów wykryto w M1, w którym fenoloamid wykazał najwyższą frakcję Si (rysunek 4B). Wspomniany wcześniej roślinożerny indukowany 17-HGL-DTG w M7 wykazał umiarkowany wynik Si, wskazując na umiarkowany stopień regulacji różnicowej między dwoma typami OS. Natomiast większość konstytutywnie produkowanych wyspecjalizowanych metabolitów, takich jak rutyna, CGA i cukry acylowe, ma najniższe wyniki Si. Aby lepiej zbadać złożoność strukturalną i rozkład Si między specjalnymi metabolitami, dla każdego modułu skonstruowano sieć molekularną (rysunek 4B). Ważnym przewidywaniem teorii OD (podsumowanym na Rysunku 1B) jest to, że reorganizacja specjalnych metabolitów po roślinożerstwie powinna prowadzić do jednokierunkowych zmian w metabolitach o wysokiej wartości obronnej, szczególnie poprzez zwiększenie ich specyficzności (w przeciwieństwie do losowego rozkładu) Tryb) Metabolit obronny przewidziany przez teorię MT. Większość pochodnych fenoli zgromadzonych w M1 jest funkcjonalnie związana ze spadkiem wydajności owadów (32). Porównując wartości Si w metabolitach M1 między indukowanymi liśćmi i składowymi liśćmi roślin kontrolnych EV po 24 godzinach, zaobserwowaliśmy, że specyficzność metaboliczna wielu metabolitów po owadach roślinożernych ma znacząco rosnącą tendencję (Rysunek 4C). Specyficzny wzrost wartości Si wykryto tylko w defensywnych fenolamidach, ale nie wykryto wzrostu wartości Si w innych fenolach i nieznanych metabolitach współistniejących w tym module. Jest to specjalistyczny model, który jest powiązany z teorią OD. Główne przewidywania zmian metabolicznych spowodowanych przez roślinożerców są spójne. Aby sprawdzić, czy ta specyficzna cecha widma fenolamidu została wywołana przez ET specyficzny dla OS, nanieśliśmy na wykres indeks Si metabolitu i spowodowaliśmy różnicową wartość ekspresji między OSM i OSS1 w genotypach EV i sETR1 (ryc. 4D). W przypadku sETR1 różnica między OSM i OSS1 wywołana przez fenamid została znacznie zredukowana. Metodę biklasteryzacji zastosowano również do danych MS/MS zebranych w szczepach z niewystarczającą ilością JA, aby wywnioskować główne moduły MS/MS związane ze specjalizacją metaboliczną regulowaną przez JA (ryc. S6).
(A) Wyniki klastrowania 585 MS/MS oparte na wspólnym fragmencie (podobieństwo NDP) i wspólnej stracie neutralnej (podobieństwo NL) wskazują, że moduł (M) jest zgodny ze znaną rodziną związków lub z nieznanym lub słabo metabolizowanym składem metabolitu. Obok każdego modułu pokazano rozkład specyficznych metabolitów (MS/MS) (Si). (B) Modularna sieć molekularna: Węzły reprezentują MS/MS i krawędzie, NDP (czerwony) i NL (niebieski) wyniki MS/MS (próg, > 0,6). Stopniowany indeks specyficzności metabolitu (Si) pokolorowany na podstawie modułu (po lewej) i zmapowany na sieć molekularną (po prawej). (C) Moduł M1 rośliny EV w stanie konstytutywnym (kontrola) i indukowanym (symulowany roślinożerca) po 24 godzinach: diagram sieci molekularnej (wartość Si to rozmiar węzła, defensywny fenoloamid jest podświetlony na niebiesko). (D) Diagram sieci molekularnej M1 linii widmowej sETR1 z zaburzoną percepcją EV i ET: związek fenolowy reprezentowany przez węzeł zielonego koła i istotna różnica (wartość P) między zabiegami W + OSM i W + OSS1 jako rozmiar węzła. CP, N-kawoilo-tyrozyna; CS, N-kawoilo-spermidyna; FP, ester kwasu N-ferulowego-kwas moczowy; FS, N-ferulilo-spermidyna; CoP, N', N "-kumarolilo-tyrozyna; DCS, N', N"-dikawoilo-spermidyna; CFS, N', N"-kawoilo, feruloilo-spermidyna; Lycium barbarum w kolcowoju Son; Nick. O-AS, cukier O-acylowy.
Rozszerzyliśmy analizę z pojedynczego, atenuowanego genotypu Nepenthes na populacje naturalne, gdzie silne zmiany wewnątrzgatunkowe w poziomach JA roślinożerców i poziomach specyficznych metabolitów zostały wcześniej opisane w populacjach naturalnych (26). Użyj tego zestawu danych, aby objąć 43 plazmy zarodkowe. Te plazmy zarodkowe składają się ze 123 gatunków roślin z N. pallens. Rośliny te pobrano z nasion zebranych w różnych rodzimych siedliskach w Utah, Nevadzie, Arizonie i Kalifornii (Rysunek S7), obliczyliśmy różnorodność metabolomu (tutaj zwaną poziomem populacji) β różnorodność) i specjalizację spowodowaną przez OSM. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami zaobserwowaliśmy szeroki zakres zmian metabolicznych wzdłuż osi Hj i δj, co wskazuje, że plazmy zarodkowe wykazują istotne różnice w plastyczności swoich odpowiedzi metabolicznych na roślinożerców (Rysunek S7). Organizacja ta przypomina wcześniejsze obserwacje dotyczące dynamicznego zakresu zmian JAs powodowanych przez roślinożerców i utrzymuje bardzo wysoką wartość w pojedynczej populacji (26, 36). Używając JA i JA-Ile do testowania ogólnej korelacji między Hj i δj, stwierdziliśmy istotną dodatnią korelację między JA a indeksem różnorodności i specjalizacji β metabolomu (rysunek S7). Sugeruje to, że indukowana przez roślinożerców heterogeniczność w indukcji JAs wykryta na poziomie populacji może wynikać z kluczowych polimorfizmów metabolicznych spowodowanych selekcją pochodzącą od owadów roślinożernych.
Poprzednie badania wykazały, że rodzaje tytoniu różnią się znacznie pod względem rodzaju i względnej zależności od indukowanych i konstytutywnych mechanizmów obronnych metabolizmu. Uważa się, że te zmiany w przekazywaniu sygnału antyroślinożerczego i zdolnościach obronnych są regulowane przez presję populacji owadów, cykl życiowy roślin i koszty produkcji obronnej w niszy, w której rośnie dany gatunek. Badaliśmy spójność przebudowy metabolomu liści indukowanej przez roślinożerców sześciu gatunków Nicotiana pochodzących z Ameryki Północnej i Południowej. Gatunki te są blisko spokrewnione z Nepenthes North America, a mianowicie Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. atenuated grass, Nicotiana tabacum, tytoń liniowy, tytoń (Nicotiana spegazzinii) i tytoń z liści tytoniu (Nicotiana obtusifolia) (ryc. 5A) (37). Sześć z tych gatunków, w tym dobrze scharakteryzowany gatunek N. please, to rośliny jednoroczne z kladu petunii, a obtusifolia N. to byliny z siostrzanego kladu Trigonophyllae (38). Następnie przeprowadzono indukcję W + W, W + OSM i W + OSS1 na tych siedmiu gatunkach, aby zbadać reorganizację metaboliczną żerowania owadów na poziomie gatunkowym.
(A) Drzewo filogenetyczne bootstrap oparte na maksymalnym prawdopodobieństwie [dla syntezy glutaminy jądrowej (38)] i rozmieszczenie geograficzne siedmiu blisko spokrewnionych gatunków Nicotiana (różne kolory) (37). (B) Wykres punktowy wyspecjalizowanej różnorodności dla profili metabolicznych siedmiu gatunków Nicotiana (939 MS/MS; plik danych S1). Na poziomie gatunku różnorodność metabolomu jest negatywnie skorelowana ze stopniem specjalizacji. Analiza korelacji na poziomie gatunku między różnorodnością metaboliczną i specjalizacją a akumulacją JA jest pokazana na Rysunku 2. S9. Kolor, różne typy; trójkąt, W + OSS1; prostokąt, W + OSM; (C) Dynamika JA i JA-Ile Nicotiana jest uszeregowana według amplitudy wzbudzenia OS (dwuczynnikowa ANOVA i Tukey HSD po wielokrotnym porównaniu, * P <0,05, ** P <0,01 i * ** Dla porównania W + OS i W + W, P <0,001). Wykres pudełkowy różnorodności (D) i specjalizacji (E) każdego gatunku po symulacji roślinożerności i metylowego JA (MeJA). Gwiazdka oznacza istotną różnicę między W + OS i W + W lub lanoliną plus W (Lan + W) lub Lan plus MeJA (Lan + MeJa) a kontrolą Lan (dwukierunkowa analiza wariancji, a następnie wielokrotne porównanie post hoc metodą HSD Tukeya, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001).
Stosując metodę podwójnego klastra, zidentyfikowaliśmy 9 modułów 939 MS/MS (plik danych S1). Skład MS/MS rekonfigurowanych przez różne metody różni się znacznie w zależności od modułu i gatunku (Rysunek S8). Wizualizacja Hj (określanego tutaj jako gamma-różnorodność na poziomie gatunku) i δj ujawnia, że ​​różne gatunki agregują w bardzo różne grupy w przestrzeni metabolicznej, gdzie podział na poziomie gatunku jest zazwyczaj bardziej widoczny niż pobudzenie. Z wyjątkiem N. linear i N. obliquus, wykazują one szeroki zakres dynamiczny efektów indukcji (Rysunek 5B). Natomiast gatunki takie jak N. purpurea i N. obtusifolia wykazują mniej oczywistą odpowiedź metaboliczną na metodę, ale ich metabolom jest bardziej zróżnicowany. Specyficzny dla gatunku rozkład indukowanej odpowiedzi metabolicznej skutkował istotną ujemną korelacją między specjalizacją a różnorodnością gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Zmiany w poziomach JAs indukowane przez OS są dodatnio skorelowane ze specjalizacją metabolomu i ujemnie skorelowane z różnorodnością metaboliczną gamma wykazywaną przez każdy gatunek (ryc. 5B i ryc. S9). Warto zauważyć, że gatunki potocznie określane jako gatunki „odpowiadające na sygnał” na ryc. 5C, takie jak Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute i Nepenthes atenuated, wywołały istotne objawy po 30 minutach. Niedawne ogniska JA i JA-Ile specyficzne dla OS, podczas gdy inne bakterie określane jako „nieodpowiadające na sygnał”, takie jak Nepenthes mills, Nepenthes powdery i N. obtusifolia, wykazują jedynie indukcję JA-Ile Edge bez jakiejkolwiek specyficzności OS (ryc. 5C). Na poziomie metabolicznym, jak wspomniano powyżej, dla atenuowanych Nepenthes, substancje reagujące na sygnał wykazywały specyficzność OS i znacząco zwiększały δj, jednocześnie zmniejszając Hj. Ten specyficzny dla OS efekt primingu nie został wykryty u gatunków sklasyfikowanych jako gatunki niereagujące na sygnał (ryc. 5, D i E). Metabolity specyficzne dla OS są częściej dzielone między gatunkami reagującymi na sygnał, a te skupiska sygnałów grupują się z gatunkami o słabszej reakcji na sygnał, podczas gdy gatunki o słabszej reakcji na sygnał wykazują mniejszą współzależność (ryc. S8). Wynik ten wskazuje, że specyficzna dla OS indukcja JA i specyficzna dla OS rekonfiguracja metabolomu w dalszej części szlaku metabolicznego są sprzężone na poziomie gatunku.
Następnie użyliśmy pasty lanolinowej zawierającej metylo JA (MeJA) do traktowania roślin, aby zbadać, czy te tryby sprzęgania są ograniczone przez dostępność JA przynoszonego przez egzogenny JA, który będzie w cytoplazmie roślin. Szybka deestryfikacja to JA. Zaobserwowaliśmy tę samą tendencję stopniowej zmiany od gatunków reagujących na sygnał do gatunków niereagujących na sygnał, spowodowaną ciągłym dostarczaniem JA (Rysunek 5, D i E). Krótko mówiąc, traktowanie MeJA silnie przeprogramowało metabolomy nicieni liniowych, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens i N. mikimotoi, co skutkowało znaczącym wzrostem δj i spadkiem Hj. N. purpurea wykazała jedynie wzrost δj, ale nie Hj. N. obtusifolia, która wcześniej wykazała akumulację wyjątkowo niskich poziomów JA, również słabo reaguje na traktowanie MeJA pod względem rekonfiguracji metabolomu. Wyniki te wskazują, że produkcja JA lub transdukcja sygnału jest fizjologicznie ograniczona u gatunków niereagujących na sygnał. Aby przetestować tę hipotezę, zbadaliśmy cztery gatunki (N. pallens, N. mills, N. pink i N. microphylla) indukowane przez W + W, W + OSM i W + OSS1 transkryptomu (39). Zgodnie ze schematem remodelingu metabolomu, gatunki są dobrze rozdzielone w przestrzeni transkryptomu, spośród których N. attenuated wykazał najwyższy RDPI indukowany przez OS, podczas gdy N. gracilis miał najniższy (ryc. 6A). Jednakże stwierdzono, że różnorodność transkryptomu indukowana przez N. oblonga była najniższa spośród czterech gatunków, w przeciwieństwie do najwyższej różnorodności metabonomicznej N. oblonga wykazanej wcześniej u siedmiu gatunków. Poprzednie badania wykazały, że zestaw genów związanych z wczesnymi sygnałami obronnymi, w tym sygnałami JA, wyjaśnia specyficzność wczesnych odpowiedzi obronnych indukowanych przez elicytory związane z roślinożercami u gatunków Nicotiana (39). Porównanie szlaków sygnałowych JA między tymi czterema gatunkami ujawniło interesujący wzorzec (ryc. 6B). Większość genów w tym szlaku, takich jak AOC, OPR3, ACX i COI1, wykazywała stosunkowo wysoki poziom indukcji u tych czterech gatunków. Jednak kluczowy gen, JAR4, przekształca JA w biologicznie aktywną formę transkryptów akumulowanych przez JA-Ile, a jego poziom transkrypcji jest bardzo niski, szczególnie u N. mills, Nepenthes pieris i N. microphylla. Ponadto, u N. bifidum nie wykryto jedynie transkryptu innego genu, AOS. Te zmiany w ekspresji genów mogą być odpowiedzialne za skrajne fenotypy indukowane przez niską produkcję JA u gatunków anergicznych sygnałowo oraz indukcję u N. gracilis.
(A) Analiza teorii informacji przeprogramowania wczesnych odpowiedzi transkrypcyjnych czterech blisko spokrewnionych gatunków tytoniu, pobranych 30 minut po indukcji przez roślinożercę. RDPI oblicza się, porównując liście indukowane przez roślinożercę OS z kontrolą z raną. Kolory oznaczają różne gatunki, a symbole oznaczają różne metody leczenia. (B) Analiza ekspresji genów w szlakach sygnałowych JA u czterech gatunków. Uproszczona ścieżka JA jest pokazana obok wykresu pudełkowego. Różne kolory oznaczają różne metody przetwarzania. Gwiazdka oznacza, że ​​istnieje istotna różnica między leczeniem W + OS a kontrolą W + W (dla testu t-Studenta dla różnic parami, *P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). OPDA, kwas 12-oksofitodienowy; OPC-8: kwas 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenylo)-cyklopentano-1-oktanowy.
W ostatniej części badaliśmy, w jaki sposób specyficzna dla gatunku owada przebudowa metabolomu różnych gatunków roślin może być odporna na roślinożerców. Poprzednie badania kładły nacisk na rodzaj Nicotiana. Ich odporność na Ms i larwy znacznie się różni (40). W tym przypadku badaliśmy związek między tym modelem a ich plastycznością metaboliczną. Używając powyższych czterech gatunków tytoniu i testując korelację między różnorodnością i specjalizacją metabolomu powodowaną przez roślinożerców a odpornością roślin na Ms i Sl, stwierdziliśmy, że odporność, różnorodność i specjalizacja na generalistyczne Sl są dodatnio skorelowane, podczas gdy korelacja między odpornością na kobiety eksperckie a specjalizacją jest słaba, a korelacja ze zróżnicowaniem nie jest istotna (Rysunek S10). Jeśli chodzi o odporność na S1, zarówno atenuowane N. chinensis, jak i N. gracilis, które wcześniej wykazano, że wykazują zarówno poziomy transdukcji sygnału JA, jak i plastyczność metabolomu, miały bardzo różne odpowiedzi na indukcję przez roślinożerców, a także wykazały podobnie wysoką odporność. Płeć.
W ciągu ostatnich sześćdziesięciu lat teoria obrony roślin dostarczyła ram teoretycznych, na podstawie których badacze przewidzieli znaczną liczbę ewolucji i funkcji wyspecjalizowanych metabolitów roślin. Większość z tych teorii nie podąża za normalną procedurą silnego wnioskowania (41). Proponują kluczowe przewidywania (3) na tym samym poziomie analizy. Gdy testowanie kluczowych przewidywań pozwala na analizę konkretnych teorii, spowoduje to, że pole rozwija się. Bądź wspierany, ale odrzucaj inne (42). Zamiast tego nowa teoria formułuje przewidywania na różnych poziomach analizy i dodaje nową warstwę rozważań opisowych (42). Jednak dwie teorie zaproponowane na poziomie funkcjonalnym, MT i OD, można łatwo wyjaśnić jako ważne przewidywania wyspecjalizowanych zmian metabolicznych powodowanych przez roślinożerców: Teoria OD zakłada, że ​​zmiany w wyspecjalizowanej „przestrzeni” metabolicznej są wysoce kierunkowe. Teoria MT zakłada, że ​​zmiany te będą niekierunkowe i losowo rozmieszczone w przestrzeni metabolicznej i mają tendencję do posiadania metabolitów o wysokiej wartości obronnej. Poprzednie badania przewidywań OD i MT zostały przetestowane przy użyciu wąskiego zestawu związków „obronnych” a priori. Te testy skoncentrowane na metabolitach uniemożliwiają analizę zakresu i trajektorii rekonfiguracji metabolomu podczas roślinożerstwa i nie pozwalają na testowanie w spójnych ramach statystycznych, aby wymagać kluczowych przewidywań, które można rozpatrywać jako całość. Kwantyfikacja zmian w metabolomie roślin. W tym przypadku wykorzystaliśmy innowacyjną technologię metabolomiki opartą na obliczeniowej spektrometrii mas i przeprowadziliśmy analizę dekonwolucji spektrometrii mas w ogólnej aktualności deskryptorów teorii informacji, aby przetestować rozróżnienie między dwoma proponowanymi na poziomie globalnej metabolomiki. Kluczowe przewidywanie tej teorii. Teoria informacji została zastosowana w wielu dziedzinach, szczególnie w kontekście badań nad bioróżnorodnością i przepływem składników odżywczych (43). Jednak, o ile nam wiadomo, jest to pierwsze zastosowanie użyte do opisu przestrzeni informacji metabolicznej roślin i rozwiązania problemów ekologicznych związanych z tymczasowymi zmianami metabolicznymi w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. W szczególności, potencjał tej metody polega na jej zdolności do porównywania wzorców wewnątrz i między gatunkami roślin, co pozwala na zbadanie, w jaki sposób roślinożercy ewoluowali od różnych gatunków do międzygatunkowych wzorców makroewolucyjnych na różnych etapach ewolucji. Metabolizm.
Analiza głównych składowych (PCA) przekształca wielowymiarowy zbiór danych w przestrzeń redukcji wymiarowości, tak aby można było wyjaśnić główny trend danych, dlatego jest zazwyczaj stosowana jako technika eksploracyjna do analizy zbioru danych, taka jak dekonwolucyjny metabolom. Jednak redukcja wymiarowości spowoduje utratę części zawartości informacyjnej w zbiorze danych, a PCA nie może dostarczyć ilościowych informacji o cechach, które są szczególnie istotne dla teorii ekologicznej, takich jak: w jaki sposób roślinożercy rekonfigurują różnorodność w wyspecjalizowanych dziedzinach (na przykład bogactwo, rozmieszczenie) i obfitość) metabolity? Które metabolity są predyktorami stanu indukowanego danego roślinożercy? Z perspektywy specyficzności, różnorodności i indukowalności, zawartość informacyjna profilu metabolitów specyficznych dla liścia ulega rozkładowi i stwierdzono, że jedzenie roślinożerców może aktywować specyficzny metabolizm. Nieoczekiwanie zaobserwowaliśmy, że, jak opisano we wdrożonych wskaźnikach teorii informacji, wynikająca sytuacja metaboliczna w dużym stopniu pokrywa się po atakach dwóch roślinożerców (nocnego generalisty Sl) i eksperta od psiankowatych Ms. Chociaż ich zachowanie żywieniowe i stężenie są istotnie różne. Inicjator koniugatu kwasu tłuszczowego i aminokwasu (FAC) w OS (31). Dzięki zastosowaniu OS roślinożercy do leczenia standaryzowanych ran kłutych, symulowane leczenie roślinożercą również wykazało podobny trend. Ta standaryzowana procedura symulacji reakcji roślin na ataki roślinożerców eliminuje czynniki zakłócające spowodowane zmianami w zachowaniu żywieniowym roślinożerców, które prowadzą do różnego stopnia uszkodzeń w różnych momentach (34). FAC, który jest znany jako główna przyczyna OSM, zmniejsza reakcje JAS i innych hormonów roślinnych w OSS1, podczas gdy OSS1 zmniejsza je setki razy (31). Jednak OSS1 powodował podobne poziomy akumulacji JA w porównaniu z OSM. Wcześniej wykazano, że reakcja JA w atenuowanych Nepenthes jest bardzo wrażliwa na OSM, gdzie FAC może zachować swoją aktywność nawet po rozcieńczeniu 1:1000 wodą (44). Zatem, w porównaniu z OSM, chociaż FAC w OSS1 jest bardzo niski, jest on wystarczający do wywołania wystarczającego wzrostu JA. Wcześniejsze badania wykazały, że białka porynopodobne (45) i oligosacharydy (46) mogą być wykorzystywane jako molekularne wskazówki do wyzwalania reakcji obronnych roślin w OSS1. Nadal jednak nie jest jasne, czy te elicytory w OSS1 są odpowiedzialne za akumulację JA obserwowaną w niniejszym badaniu.
Chociaż istnieje niewiele badań opisujących zróżnicowane odciski palców metabolicznych spowodowane przez zastosowanie różnych roślinożerców lub egzogennego JA lub SA (kwasu salicylowego) (47), nikt nie zakłócił zaburzeń specyficznych dla gatunku roślinożercy w sieci traw roślinnych i jego wpływu na specyficzne Całkowity wpływ metabolizmu jest systematycznie badany. dane osobowe. Ta analiza dodatkowo potwierdziła, że ​​wewnętrzne połączenie sieci hormonów z innymi hormonami roślinnymi innymi niż JA kształtuje specyficzność reorganizacji metabolicznej spowodowanej przez roślinożerców. W szczególności wykryliśmy, że ET wywołany przez OSM był znacznie większy niż ten wywołany przez OSS1. Ten tryb jest zgodny z większą zawartością FAC w OSM, co jest warunkiem koniecznym i wystarczającym do wywołania wybuchu ET (48). W kontekście interakcji między roślinami i roślinożercami funkcja sygnalizacyjna ET na dynamikę metabolitów specyficznych dla roślin jest nadal sporadyczna i skierowana tylko do jednej grupy związków. Ponadto, większość badań wykorzystywała egzogenne zastosowanie ET lub jego prekursorów lub różnych inhibitorów do badania regulacji ET, wśród których te egzogenne zastosowania chemiczne będą powodować wiele niespecyficznych skutków ubocznych. Według naszej wiedzy, niniejsze badanie stanowi pierwsze systematyczne badanie na dużą skalę roli ET w wykorzystaniu ET do produkcji i percepcji zaburzonych roślin transgenicznych w celu koordynacji dynamiki metabolomu roślin. Specyficzna dla roślinożerców indukcja ET może ostatecznie modulować odpowiedź metabolomu. Najważniejsza jest transgeniczna manipulacja genami biosyntezy ET (ACO) i percepcji (ETR1), która ujawniła specyficzną dla roślinożerców akumulację fenolamidów de novo. Wcześniej wykazano, że ET może precyzyjnie dostroić indukowaną przez JA akumulację nikotyny poprzez regulację N-metylotransferazy putrescyny (49). Jednak z mechanicznego punktu widzenia nie jest jasne, w jaki sposób ET precyzyjnie dostraja indukcję fenamidu. Oprócz funkcji transdukcji sygnału przez ET, przepływ metaboliczny może być również przekierowywany do S-adenozylo-1-metioniny, regulując w ten sposób powstawanie poliaminofenoloamidów. S-adenozylo-1-metionina jest ET i wspólnym produktem pośrednim szlaku biosyntezy poliamin. Mechanizm, za pomocą którego sygnał ET reguluje poziom fenolamidu, wymaga dalszych badań.
Przez długi czas, ze względu na dużą liczbę specjalnych metabolitów o nieznanej strukturze, intensywna uwaga skupiona na określonych kategoriach metabolicznych nie była w stanie ściśle ocenić czasowych zmian różnorodności metabolicznej po interakcjach biologicznych. Obecnie, w oparciu o analizę teorii informacji, głównym wynikiem akwizycji widm MS/MS w oparciu o nieobciążone metabolity jest to, że roślinożercy zjadający lub symulujący roślinożerców nadal zmniejszają ogólną różnorodność metaboliczną metabolomu liści, jednocześnie zwiększając stopień jego specjalizacji. Ten tymczasowy wzrost specyficzności metabolomu spowodowany przez roślinożerców jest związany z synergistycznym wzrostem specyficzności transkryptomu. Cechą, która przyczynia się najbardziej do tej większej specjalizacji metabolomu (mającej wyższą wartość Si) jest specjalny metabolit o wcześniej scharakteryzowanej funkcji roślinożernej. Model ten jest spójny z przewidywaniami teorii OD, ale przewidywania MT związane z losowością przeprogramowania metabolomu nie są spójne. Dane te są jednak zgodne z przewidywaniami modelu mieszanego (najlepsza MT; rycina 1B), ponieważ inne nieopisane metabolity o nieznanych funkcjach obronnych mogą nadal wykazywać losowy rozkład Si.
Godnym uwagi wzorcem dodatkowo uchwyconym w tych badaniach jest to, że od poziomu mikroewolucji (pojedyncza roślina i populacja tytoniu) do większej skali ewolucyjnej (blisko spokrewnione gatunki tytoniu), różne poziomy organizacji ewolucyjnej są w „najlepszej obronie”. Istnieją znaczące różnice w zdolnościach roślinożerców. Moore i in. (20) oraz Kessler i Kalske (1) niezależnie zaproponowali przekształcenie trzech funkcjonalnych poziomów bioróżnorodności pierwotnie wyróżnionych przez Whittakera (50) w konstytutywne i indukowane zmiany czasowe różnorodności chemicznej; ci autorzy nie podsumowali Procedury gromadzenia danych metabolomu na dużą skalę również nie określają, jak obliczyć różnorodność metaboliczną na podstawie tych danych. W niniejszym badaniu drobne modyfikacje klasyfikacji funkcjonalnej Whittakera będą uwzględniać różnorodność α-metaboliczną jako różnorodność widm MS/MS w danej roślinie, a różnorodność β-metaboliczną jako podstawowy metabolizm wewnątrzgatunkowy grupy populacji Space, a różnorodność γ-metaboliczna będzie rozszerzeniem analizy podobnych gatunków.
Sygnał JA jest niezbędny dla szerokiego zakresu reakcji metabolicznych roślinożerców. Brakuje jednak rygorystycznych ilościowych testów wpływu wewnątrzgatunkowej regulacji biosyntezy JA na różnorodność metabolomu, a to, czy sygnał JA jest ogólnym miejscem dywersyfikacji metabolicznej indukowanej stresem w wyższej skali makroewolucyjnej, pozostaje niejasne. Zaobserwowaliśmy, że roślinożerna natura Nepenthes herbivorous indukuje specjalizację metabolomu, a zmienność specjalizacji metabolomu w populacji gatunków Nicotiana i blisko spokrewnionych gatunków Nicotiana jest systematycznie dodatnio skorelowana z sygnalizacją JA. Ponadto, gdy sygnał JA jest osłabiony, specyficzność metaboliczna indukowana przez roślinożercę o pojedynczym genotypie zostanie zniesiona (Rysunek 3, C i E). Ponieważ zmiany spektrum metabolicznego naturalnie atenuowanych populacji Nepenthes są głównie ilościowe, zmiany w różnorodności i specyficzności metabolicznej β w tej analizie mogą być w dużej mierze spowodowane silnym wzbudzeniem kategorii związków bogatych w metabolity. Te klasy związków dominują w części profilu metabolomu i prowadzą do dodatniej korelacji z sygnałami JA.
Ponieważ mechanizmy biochemiczne blisko spokrewnionych gatunków tytoniu są bardzo różne, metabolity są szczegółowo identyfikowane w aspekcie jakościowym, co czyni je bardziej analitycznymi. Przetwarzanie wychwyconego profilu metabolicznego przez teorię informacji ujawnia, że ​​indukcja roślinożerna zaostrza kompromis między różnorodnością metaboliczną gamma a specjalizacją. Sygnał JA odgrywa w tym kompromisie kluczową rolę. Wzrost specjalizacji metabolomu jest zgodny z główną prognozą OD i jest dodatnio skorelowany z sygnałem JA, podczas gdy sygnał JA jest ujemnie skorelowany z różnorodnością metaboliczną gamma. Modele te wskazują, że zdolność roślin do OD jest głównie determinowana przez plastyczność JA, zarówno w skali mikroewolucyjnej, jak i w szerszej skali ewolucyjnej. Eksperymenty z egzogennym zastosowaniem JA, które omijają defekty biosyntezy JA, dodatkowo ujawniają, że blisko spokrewnione gatunki tytoniu można rozróżnić na gatunki reagujące na sygnał i gatunki niereagujące na sygnał, podobnie jak ich tryb JA i plastyczność metabolomu indukowane przez roślinożerców. Gatunki niereagujące na sygnały nie mogą na nie reagować ze względu na niezdolność do produkcji endogennego JA i w związku z tym podlegają ograniczeniom fizjologicznym. Może to być spowodowane mutacjami w niektórych kluczowych genach szlaku sygnałowego JA (AOS i JAR4 u N. crescens). Wynik ten wskazuje, że te międzygatunkowe wzorce makroewolucyjne mogą być napędzane głównie przez zmiany w wewnętrznej percepcji i reakcji hormonalnej.
Oprócz interakcji między roślinami a roślinożercami, badanie różnorodności metabolicznej wiąże się ze wszystkimi ważnymi postępami teoretycznymi w badaniach nad adaptacją biologiczną do środowiska i ewolucją złożonych cech fenotypowych. Wraz ze wzrostem ilości danych pozyskiwanych przez nowoczesne instrumenty MS, testowanie hipotez dotyczących różnorodności metabolicznej może obecnie wykraczać poza indywidualne/kategorialne różnice w metabolitach i przeprowadzać globalną analizę w celu ujawnienia nieoczekiwanych wzorców. W procesie analizy na dużą skalę ważną metaforą jest koncepcja tworzenia sensownych map, które można wykorzystać do eksploracji danych. Dlatego ważnym rezultatem obecnego połączenia obiektywnej metabolomiki MS/MS i teorii informacji jest to, że dostarcza ona prostej metryki, która może być używana do konstruowania map do przeglądania różnorodności metabolicznej w różnych skalach taksonomicznych. Jest to podstawowy wymóg tej metody. Badanie mikro/makroewolucji i ekologii społeczności.
Na poziomie makroewolucyjnym sednem teorii koewolucji roślin i owadów Ehrlicha i Ravena (51) jest przewidywanie, że zmienność międzygatunkowej różnorodności metabolicznej jest przyczyną dywersyfikacji linii roślinnych. Jednak w ciągu pięćdziesięciu lat od publikacji tej przełomowej pracy hipoteza ta była rzadko testowana (52). Wynika to głównie z cech filogenetycznych porównywalnych cech metabolicznych w obrębie linii roślinnych o dużym zasięgu. Rzadkość ta może być wykorzystana do zakotwiczenia metod analizy docelowej. Obecny przepływ pracy MS/MS przetwarzany przez teorię informacji kwantyfikuje podobieństwo strukturalne MS/MS nieznanych metabolitów (bez wcześniejszego wyboru metabolitu) i przekształca te MS/MS w zestaw MS/MS, a zatem w profesjonalnym metabolizmie Te modele makroewolucyjne są porównywane w skali klasyfikacyjnej. Proste wskaźniki statystyczne. Proces jest podobny do analizy filogenetycznej, która może wykorzystywać dopasowanie sekwencji do ilościowego określenia tempa dywersyfikacji lub ewolucji cech bez wcześniejszego przewidywania.
Na poziomie biochemicznym hipoteza przesiewowa Firna i Jonesa (53) pokazuje, że różnorodność metaboliczna jest utrzymywana na różnych poziomach, dostarczając surowców do wywierania aktywności biologicznej wcześniej niespokrewnionych lub podstawionych metabolitów. Metody teorii informacji zapewniają ramy, w których te specyficzne dla metabolitów przejścia ewolucyjne, zachodzące podczas specjalizacji metabolitów, mogą być kwantyfikowane w ramach proponowanego procesu przesiewowego ewolucyjnego: adaptacja biologicznie aktywna od niskiej specyficzności do wysokiej specyficzności zahamowanych metabolitów danego środowiska.
Podsumowując, we wczesnych latach biologii molekularnej opracowano ważne teorie obronne roślin, a dedukcyjne metody oparte na hipotezach są powszechnie uważane za jedyny sposób postępu naukowego. Wynika to głównie z technicznych ograniczeń pomiaru całego metabolomu. Chociaż metody oparte na hipotezach są szczególnie przydatne w wyborze innych mechanizmów przyczynowych, ich zdolność do pogłębiania naszej wiedzy na temat sieci biochemicznych jest bardziej ograniczona niż metody obliczeniowe dostępne obecnie we współczesnej nauce intensywnie wykorzystującej dane. Dlatego teorie, których nie da się przewidzieć, wykraczają daleko poza zakres dostępnych danych, a zatem hipotetyczny cykl formuły/testu postępu w dziedzinie badań nie może zostać zniesiony (4). Przewidujemy, że przedstawiony tutaj obliczeniowy proces metabolomiki może na nowo rozbudzić zainteresowanie niedawnymi zagadnieniami (jak) i ostatecznymi (dlaczego) różnorodności metabolicznej i przyczynić się do nowej ery teoretycznie ukierunkowanej nauki o danych. Era ta ponownie zbadała ważne teorie, które zainspirowały poprzednie pokolenia.
Bezpośrednie karmienie roślinożerców odbywa się poprzez wyhodowanie larwy drugiego stadium larwalnego lub larwy Sl na pojedynczym liściu dzbanecznika bladoróżowego jednej rośliny kwitnącej różą, z 10 powtórzeniami na roślinę. Larwy owadów zaciskano zaciskami, a pozostałą tkankę liścia zbierano 24 i 72 godziny po zakażeniu, szybko zamrażano i ekstrahowano metabolity.
Symuluj leczenie roślinożerców w sposób wysoce zsynchronizowany. Metoda polega na nakłuciu trzech rzędów kolców po każdej stronie nerwu głównego trzech w pełni rozwiniętych liści rośliny za pomocą kółek z wzorem tkaniny w fazie wzrostu girlandy z tkaniny, a następnie natychmiastowym nałożeniu rozcieńczonego roztworu Ms w stosunku 1:5. Możesz również użyć palców w rękawiczkach, aby wprowadzić S1 OS do rany po nakłuciu. Zbierz i przetwórz liść zgodnie z powyższym opisem. Użyj wcześniej opisanej metody do ekstrakcji metabolitów pierwotnych i hormonów roślinnych (54).
W przypadku egzogennych zastosowań JA, trzy ogonki liściowe każdej z sześciu kwitnących róż każdego gatunku są traktowane 20 μl pasty lanolinowej zawierającej 150 μg MeJA (Lan + MeJA) oraz 20 μl lanoliny i preparatu do ran (Lan + W) lub jako kontrola stosuje się 20 μl czystej lanoliny. Liście zbierano 72 godziny po zabiegu, szybko zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C do momentu użycia.
W naszej grupie badawczej zidentyfikowano cztery linie transgeniczne JA i ET, mianowicie irAOC (36), irCOI1 (55), irACO i sETR1 (48). irAOC znacząco obniżył poziom JA i JA-Ile, podczas gdy irCOI1 nie był wrażliwy na JA. W porównaniu z EV, akumulacja JA-Ile wzrosła. Podobnie, irACO zmniejsza produkcję ET, a w porównaniu z EV, sETR1, który jest niewrażliwy na ET, zwiększa produkcję ET.
Do nieinwazyjnego pomiaru ET wykorzystano fotoakustyczny spektrometr laserowy (czujnik ET w czasie rzeczywistym Sensor Sense ETD-300). Bezpośrednio po zabiegu połowę liści pocięto i przeniesiono do 4-mililitrowej, szczelnie zamkniętej szklanej fiolki, a przestrzeń nad powierzchnią cieczy pozostawiono do nagromadzenia się w ciągu 5 godzin. Podczas pomiaru każdą fiolkę przepłukiwano strumieniem 2 litrów czystego powietrza na godzinę przez 8 minut, które wcześniej przeszło przez katalizator dostarczony przez Sensor Sense w celu usunięcia CO2 i wody.
Dane z mikromacierzy zostały pierwotnie opublikowane w (35) i zapisane w bazie danych Gene Expression Comprehensive Database Narodowego Centrum Informacji Biotechnologicznej (NCBI) (numer dostępu GSE30287). Dane dotyczące liści, których ekspresja została wywołana przez W + OSM, oraz nieuszkodzonej kontroli zostały wyodrębnione na potrzeby niniejszego badania. Surowa intensywność wynosi log2. Przed analizą statystyczną linia bazowa została przekształcona i znormalizowana do 75. percentyla za pomocą pakietu oprogramowania R.
Oryginalne dane sekwencjonowania RNA (RNA-seq) gatunków Nicotiana zostały pobrane z Archiwum Krótkich Czytań NCBI (SRA), numer projektu to PRJNA301787, który został zgłoszony przez Zhou i in. (39) i postępować zgodnie z opisem w (56). Surowe dane przetworzone przez W + W, W + OSM i W + OSS1 odpowiadające gatunkom Nicotiana zostały wybrane do analizy w tym badaniu i przetworzone w następujący sposób: Najpierw surowe odczyty RNA-seq zostały przekonwertowane do formatu FASTQ. HISAT2 konwertuje FASTQ do SAM, a SAMtools konwertuje pliki SAM do posortowanych plików BAM. StringTie jest używany do obliczania ekspresji genów, a jego metoda ekspresji polega na tym, że liczba fragmentów na tysiąc fragmentów zasad na milion sekwencjonowanych fragmentów transkrypcyjnych.
Kolumna chromatograficzna Acclaim (150 mm x 2,1 mm; wielkość cząstek 2,2 μm) używana w analizie oraz kolumna ochronna 4 mm x 4 mm składają się z tego samego materiału. W systemie Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) zastosowano następujący gradient binarny: od 0 do 0,5 minuty, faza izokratyczna 90% A [woda dejonizowana, 0,1% (v/v) acetonitryl i 0,05% kwas mrówkowy], 10% B (acetonitryl i 0,05% kwas mrówkowy); od 0,5 do 23,5 minuty, faza gradientowa wynosi odpowiednio 10% A i 90% B; od 23,5 do 25 minut, faza izokratyczna 10% A i 90% B. Przepływ wynosi 400 μl/min. W przypadku wszystkich analiz MS eluent kolumny należy wstrzyknąć do analizatora kwadrupolowego i analizatora czasu przelotu (qTOF) wyposażonego w źródło elektrorozpylania pracujące w trybie jonizacji dodatniej (napięcie kapilary 4500 V; wyjście kapilary 130 V; temperatura suszenia 200°C; przepływ powietrza suszącego 10 litrów/min).
Przeprowadź analizę fragmentów MS/MS (dalej MS/MS), które są nieistotne lub nieodróżnialne od danych, aby uzyskać informacje strukturalne o ogólnym wykrywalnym profilu metabolicznym. Koncepcja metody indiscriminate MS/MS opiera się na fakcie, że kwadrupol ma bardzo duże okno izolacji masy [dlatego wszystkie sygnały stosunku masy do ładunku (m/z) należy traktować jako fragmenty]. Z tego powodu, ponieważ instrument Impact II nie był w stanie wytworzyć pochylenia CE, przeprowadzono kilka niezależnych analiz z wykorzystaniem zwiększonych wartości energii zderzenia dysocjacji indukowanej zderzeniem (CE). Krótko mówiąc, najpierw przeanalizuj próbkę metodą UHPLC z jonizacją elektrorozpylaniem/qTOF-MS w trybie pojedynczej spektrometrii masowej (warunki niskiej fragmentacji generowane przez fragmentację wewnątrzźródłową), skanując od m/z 50 do 1500 z częstotliwością powtarzania 5 Hz. Użyj azotu jako gazu kolizyjnego do analizy MS/MS i wykonaj niezależne pomiary przy następujących czterech różnych napięciach dysocjacji indukowanej kolizją: 20, 30, 40 i 50 eV. Podczas całego procesu pomiaru kwadrupol ma największe okno izolacji masy, od m/z 50 do 1500. Gdy eksperyment m/z przedniego ciała i szerokości izolacji jest ustawiony na 200, zakres masy jest automatycznie aktywowany przez oprogramowanie operacyjne instrumentu i 0 Da. Skanuj w poszukiwaniu fragmentów masy jak w trybie pojedynczej masy. Użyj mrówczanu sodu (50 ml izopropanolu, 200 μl kwasu mrówkowego i 1 ml 1M wodnego roztworu NaOH) do kalibracji masy. Używając precyzyjnego algorytmu kalibracji Bruker, plik danych jest kalibrowany po uruchomieniu średniego widma w danym okresie czasu. Użyj funkcji eksportu oprogramowania Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Brema, Niemcy), aby przekonwertować surowe pliki danych do formatu NetCDF. Zestaw danych MS/MS został zapisany w otwartej bazie danych metabolomiki MetaboLights (www.ebi.ac.uk) pod numerem akcesyjnym MTBLS1471.
Montaż MS/MS można zrealizować poprzez analizę korelacji między sygnałami jakości MS1 i MS/MS dla niskiej i wysokiej energii kolizji oraz nowo zaimplementowanych reguł. Skrypt R służy do przeprowadzenia analizy korelacji rozkładu prekursora do produktu, a skrypt C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) służy do implementacji reguł.
Aby zmniejszyć liczbę błędów fałszywie dodatnich spowodowanych szumem tła i fałszywą korelacją spowodowaną wykryciem pewnych cech m/z w zaledwie kilku próbkach, używamy funkcji „wypełnionego szczytu” pakietu R XCMS (do korekcji szumu tła). Powinna być używana do zastąpienia intensywności „NA” (niewykrytego szczytu). Gdy używana jest funkcja wypełnienia szczytu, w zestawie danych nadal występuje wiele wartości intensywności „0”, które wpłyną na obliczenia korelacji. Następnie porównujemy wyniki przetwarzania danych uzyskane, gdy używana jest funkcja wypełnionego szczytu i gdy funkcja wypełnionego szczytu nie jest używana, i obliczamy wartość szumu tła na podstawie średniej skorygowanej wartości szacowanej, a następnie zastępujemy te wartości intensywności 0 obliczoną wartością tła. Rozważaliśmy również tylko cechy, których intensywność przekraczała trzykrotnie wartość tła i traktowaliśmy je jako „prawdziwe szczyty”. Do obliczeń PCC brane są pod uwagę tylko sygnały m/z prekursora próbki (MS1) i zestawy danych fragmentów z co najmniej ośmioma prawdziwymi szczytami.
Jeśli intensywność cechy jakości prekursora w całej próbce jest istotnie skorelowana ze zmniejszoną intensywnością tej samej cechy jakości, która jest poddawana działaniu niskiej lub wysokiej energii zderzenia, a cecha ta nie jest oznaczona jako pik izotopowy przez CAMERA, można ją dokładniej zdefiniować. Następnie, obliczając wszystkie możliwe pary prekursor-produkt w ciągu 3 s (szacowany czas retencji dla retencji piku), przeprowadza się analizę korelacji. Tylko wtedy, gdy wartość m/z jest niższa niż wartość prekursora, a fragmentacja MS/MS występuje w tym samym miejscu próbki w zbiorze danych, co prekursor, z którego pochodzi, jest ona uznawana za fragment.
Na podstawie tych dwóch prostych reguł wykluczamy wskazane fragmenty o wartościach m/z większych niż m/z zidentyfikowanego prekursora, a także na podstawie pozycji próbki, w której występuje prekursor, oraz wskazanego fragmentu. Możliwe jest również wybranie cech jakościowych generowanych przez wiele fragmentów źródłowych wygenerowanych w trybie MS1 jako kandydatów na prekursory, generując w ten sposób redundantne związki MS/MS. Aby zmniejszyć tę redundancję danych, jeśli podobieństwo NDP widm przekracza 0,6 i należą one do chromatogramu „pcgroup” adnotowanego przez CAMERA, scalamy je. Na koniec scalamy wszystkie cztery wyniki CE związane z prekursorem i fragmentami w ostateczne, zdekonwolutowane widmo kompozytowe, wybierając pik o najwyższej intensywności spośród wszystkich pików kandydackich o tej samej wartości m/z przy różnych energiach zderzeń. Kolejne kroki przetwarzania opierają się na koncepcji widma kompozytowego i uwzględniają różne warunki CE wymagane do maksymalizacji prawdopodobieństwa fragmentacji, ponieważ niektóre fragmenty można wykryć tylko przy określonej energii zderzeń.
Do obliczenia indukowalności profilu metabolicznego wykorzystano RDPI (30). Różnorodność widma metabolicznego (indeks Hj) wyprowadzono z obfitości prekursorów MS/MS, wykorzystując entropię Shannona rozkładu częstotliwości MS/MS, zgodnie z poniższym równaniem opisanym przez Martíneza i in. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), gdzie Pij odpowiada względnej częstości i-tego MS/MS w j-tej próbce (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Specyficzność metaboliczna (indeks Si) jest definiowana jako identyczność ekspresji danego MS/MS w odniesieniu do częstości występowania między badanymi próbkami. Specyficzność MS/MS oblicza się ze wzoru Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi).
Użyj poniższego wzoru, aby zmierzyć specyficzny dla metabolomu indeks δj każdej próbki j i średnią specyficzności MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Widma MS/MS są wyrównywane parami, a podobieństwo jest obliczane na podstawie dwóch wyników. Najpierw, używając standardowej metody NDP (znanej również jako metoda korelacji cosinusowej), użyj następującego równania, aby ocenić podobieństwo segmentów między widmami NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 gdzie S1 i S2 Odpowiednio dla widma 1 i widma 2, a także WS1, i oraz WS2, i reprezentuje wagę opartą na intensywności piku, że różnica i-tego wspólnego piku między dwoma widmami jest mniejsza niż 0,01 Da. Waga jest obliczana w następujący sposób: W = [intensywność piku] m [jakość] n, m = 0,5, n = 2, zgodnie z sugestią MassBank.
Zastosowano drugą metodę punktacji, która polegała na analizie wspólnego NL pomiędzy MS/MS. W tym celu wykorzystaliśmy 52 listy NL często spotykane podczas procesu fragmentacji MS w tandemie oraz bardziej szczegółowy NL (plik danych S1), który został wcześniej adnotowany dla widma MS/MS metabolitów wtórnych osłabionych gatunków Nepenthes (9, 26). Utwórz wektor binarny 1 i 0 dla każdego MS/MS, odpowiadający odpowiednio obecnemu i nieistniejącemu NL. Na podstawie podobieństwa odległości euklidesowej, wynik podobieństwa NL jest obliczany dla każdej pary binarnych wektorów NL.
Do przeprowadzenia podwójnego klasteryzacji wykorzystaliśmy pakiet R DiffCoEx, oparty na rozszerzeniu analizy ważonej koekspresji genów (WGCNA). Wykorzystując macierze punktacji NDP i NL widm MS/MS, użyliśmy pakietu DiffCoEx do obliczenia macierzy korelacji porównawczej. Klasteryzacja binarna jest przeprowadzana poprzez ustawienie parametru „cutreeDynamic” na wartość method = „hybrid”, cutHeight = 0,9999, deepSplit = T i minClusterSize = 10. Kod źródłowy pakietu R DiffCoEx został pobrany z pliku dodatkowego 1 przez Tesson i in. (57); wymagany pakiet oprogramowania R WGCNA można znaleźć pod adresem https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Aby wykonać analizę sieci molekularnych MS/MS, obliczyliśmy sparowaną łączność widmową na podstawie typów podobieństwa NDP i NL, a następnie użyliśmy oprogramowania Cytoscape do wizualizacji topologii sieci przy użyciu układu organicznego w aplikacji rozszerzenia algorytmu układu CyFilescape yFiles.
Do przeprowadzenia analizy statystycznej danych należy użyć oprogramowania R w wersji 3.0.1. Istotność statystyczną oceniono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post-hoc Tukeya na uczciwą istotną różnicę (HSD). Aby przeanalizować różnicę między grupą roślinożerną a grupą kontrolną, rozkład dwustronny dwóch grup próbek o tej samej wariancji przeanalizowano za pomocą testu t-Studenta.
Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć na stronie http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Niniejszy artykuł jest udostępniany w otwartym dostępie na warunkach licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne, która zezwala na używanie, rozpowszechnianie i reprodukcję w dowolnym medium, pod warunkiem, że ostateczne wykorzystanie nie ma na celu osiągnięcia korzyści komercyjnych, a założeniem jest, że oryginalne dzieło jest poprawne. Źródło.
Uwaga: Prosimy o podanie adresu e-mail tylko po to, aby osoba, którą polecasz na stronie, wiedziała, że ​​chcesz, aby otrzymała wiadomość e-mail i że nie jest to spam. Nie będziemy przechwytywać żadnych adresów e-mail.
To pytanie służy do sprawdzenia, czy jesteś gościem, i zapobiegania automatycznemu wysyłaniu spamu.
Teoria informacji dostarcza uniwersalnej waluty do porównywania specjalnych metabolomów i przewidywania teorii obronnych testów.
Teoria informacji dostarcza uniwersalnej waluty do porównywania specjalnych metabolomów i przewidywania teorii obronnych testów.
©2021 Amerykańskie Stowarzyszenie Postępu Nauki. wszelkie prawa zastrzeżone. AAAS jest partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.