Wcześniej donosiliśmy, że stężenie w surowicy metabolitu tryptofanu pochodzącego z jelit, kwasu indolo-3-propionowego (IPA), jest niższe u pacjentów z włóknieniem wątroby. W niniejszym badaniu analizowaliśmy transkryptom i metylom DNA w wątrobie osób otyłych w odniesieniu do stężenia IPA w surowicy, a także rolę IPA w indukowaniu fenotypowej inaktywacji komórek gwiaździstych wątroby (HSC) in vitro.
Badaniem objęto 116 pacjentów otyłych bez cukrzycy typu 2 (T2DM) (wiek 46,8 ± 9,3 lat; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), którzy przeszli operację bariatryczną w Centrum Chirurgii Bariatrycznej w Kuopio (KOBS). Stężenie IPA we krwi mierzono metodą chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas (LC-MS), analizę transkryptomu wątroby przeprowadzono metodą sekwencjonowania całkowitego RNA, a analizę metylacji DNA przeprowadzono z użyciem mikrochirurgii Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Do eksperymentów in vitro wykorzystano ludzkie komórki gwiaździste wątroby (LX-2).
Stężenie IPA w surowicy korelowało z ekspresją genów zaangażowanych w szlaki apoptozy, mitofagii i długowieczności w wątrobie. Gen kinazy serynowo-treoninowej 1 (AKT1) był najliczniej występującym i dominującym genem oddziałującym w profilach transkryptu i metylacji DNA wątroby. Leczenie IPA indukowało apoptozę, zmniejszało oddychanie mitochondrialne oraz zmieniało morfologię komórek i dynamikę mitochondriów poprzez modulację ekspresji genów, o których wiadomo, że regulują włóknienie, apoptozę i przeżycie komórek LX-2.
Łącznie dane te potwierdzają, że IPA ma potencjalne działanie terapeutyczne i może indukować apoptozę oraz zmieniać fenotyp komórek macierzystych krwi (HSC) w kierunku stanu nieaktywnego, zwiększając tym samym możliwość hamowania zwłóknienia wątroby poprzez zakłócanie aktywacji komórek macierzystych krwi (HSC) i metabolizmu mitochondriów.
Występowanie otyłości i zespołu metabolicznego wiąże się ze wzrastającą częstością występowania metabolicznie związanej stłuszczeniowej choroby wątroby (MASLD); choroba ta dotyka 25% do 30% populacji ogólnej [1]. Głównym następstwem etiologii MASLD jest włóknienie wątroby, dynamiczny proces charakteryzujący się ciągłym gromadzeniem włóknistej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) [2]. Głównymi komórkami zaangażowanymi w włóknienie wątroby są komórki gwiaździste wątroby (HSC), które wykazują cztery znane fenotypy: uśpiony, aktywowany, inaktywowany i starzejący się [3, 4]. HSC mogą być aktywowane i transdyferencjować się z formy uśpionej w proliferujące komórki podobne do fibroblastów o wysokim zapotrzebowaniu na energię, ze zwiększoną ekspresją α-aktyny mięśni gładkich (α-SMA) i kolagenu typu I (Col-I) [5, 6]. Podczas odwrócenia włóknienia wątroby aktywowane HSC są eliminowane poprzez apoptozę lub inaktywację. Procesy te obejmują zmniejszenie ekspresji genów fibrogenicznych i modulację genów pro-przeżyciowych (takich jak szlaki sygnałowe NF-κB i PI3K/Akt) [7, 8], a także zmiany w dynamice i funkcji mitochondriów [9].
Stwierdzono, że poziomy w surowicy metabolitu tryptofanu, kwasu indolo-3-propionowego (IPA), produkowanego w jelitach, są obniżone w ludzkich chorobach metabolicznych, w tym MASLD [10–13]. IPA jest związany ze spożyciem błonnika pokarmowego, jest znany ze swoich właściwości antyoksydacyjnych i przeciwzapalnych oraz osłabia fenotyp niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH) wywołanego dietą in vivo i in vitro [11–14]. Niektóre dowody pochodzą z naszego poprzedniego badania, które wykazało, że poziomy IPA w surowicy były niższe u pacjentów z włóknieniem wątroby niż u pacjentów otyłych bez włóknienia wątroby w badaniu Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Ponadto wykazaliśmy, że leczenie IPA może zmniejszyć ekspresję genów, które są klasycznymi markerami adhezji komórkowej, migracji komórek i aktywacji komórek macierzystych hematopoezy w modelu ludzkich komórek gwiaździstych wątroby (LX-2) i jest potencjalnym metabolitem hepatoprotekcyjnym [15]. Niemniej jednak nadal nie jest jasne, w jaki sposób IPA indukuje regresję włóknienia wątroby poprzez aktywację apoptozy komórek macierzystych krwi (HSC) i bioenergetyki mitochondrialnej.
W niniejszej pracy wykazujemy, że stężenie IPA w surowicy jest związane z ekspresją genów zaangażowanych w szlaki apoptozy, mitofagii i długowieczności w wątrobie osób otyłych, ale niechorujących na cukrzycę typu 2 (KOBS). Ponadto odkryliśmy, że IPA może indukować klirens i degradację aktywowanych komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) poprzez szlak inaktywacji. Wyniki te ujawniają nową rolę IPA, co czyni ją potencjalnym celem terapeutycznym w promowaniu regresji włóknienia wątroby.
Poprzednie badanie w kohorcie KOBS wykazało, że pacjenci z włóknieniem wątroby mieli niższe poziomy krążącego IPA w porównaniu z pacjentami bez włóknienia wątroby [15]. Aby wykluczyć potencjalne zakłócające działanie cukrzycy typu 2, zrekrutowaliśmy 116 pacjentów otyłych bez cukrzycy typu 2 (średni wiek ± SD: 46,8 ± 9,3 lat; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabela 1) z trwającego badania KOBS jako populację badawczą [16]. Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę, a protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Szpitala Okręgowego North Savo zgodnie z Deklaracją Helsińską (54/2005, 104/2008 i 27/2010).
Wycinki wątroby pobrano podczas operacji bariatrycznej i poddano ocenie histologicznej przez doświadczonych patologów zgodnie z wcześniej opisanymi kryteriami [17, 18]. Kryteria oceny podsumowano w tabeli uzupełniającej S1 i opisano je wcześniej [19].
Próbki surowicy po posiłkach analizowano metodą niekierowanej chromatografii cieczowej połączonej ze spektrometrią mas (LC-MS) w celu analizy metabolomicznej (n = 116). Próbki analizowano przy użyciu systemu UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Niemcy) zgodnie z wcześniejszym opisem19. Identyfikację alkoholu izopropylowego (IPA) oparto na czasie retencji i porównaniu widma MS/MS z czystymi standardami. Intensywność sygnału IPA (powierzchnia piku) była brana pod uwagę we wszystkich dalszych analizach [20].
Sekwencjonowanie RNA całej wątroby przeprowadzono przy użyciu Illumina HiSeq 2500, a dane wstępnie przetworzono zgodnie z wcześniejszym opisem [19, 21, 22]. Przeprowadzono ukierunkowaną analizę różnicowej ekspresji transkryptów wpływających na funkcję/biogenezę mitochondriów, wykorzystując 1957 genów wybranych z bazy danych MitoMiner 4.0 [23]. Analizę metylacji DNA wątroby przeprowadzono przy użyciu mikrochipu Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, Kalifornia, USA) z zastosowaniem tej samej metodologii, którą opisano wcześniej [24, 25].
Ludzkie komórki gwiaździste wątroby (LX-2) zostały uprzejmie udostępnione przez prof. Stefano Romeo i hodowane w podłożu DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Aby dobrać dawkę roboczą IPA, komórki LX-2 poddano działaniu różnych stężeń IPA (10 μM, 100 μM i 1 mM; Sigma, 220027) w podłożu DMEM/F12 przez 24 godziny. Ponadto, aby zbadać zdolność IPA do inaktywacji komórek HSC, komórki LX-2 poddano współleczeniu 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) i 1 mM IPA w podłożu bez surowicy przez 24 godziny. W przypadku odpowiednich kontroli nośnikowych, do leczenia TGF-β1 użyto 4 nM HCL zawierającego 0,1% BSA, a do leczenia IPA 0,05% DMSO. Oba środki zastosowano razem w leczeniu skojarzonym.
Apoptozę oceniano za pomocą zestawu FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit z 7-AAD (Biolegend, San Diego, Kalifornia, USA, nr kat. 640922) zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, komórki LX-2 (1 × 105 komórek/dołek) hodowano przez noc w płytkach 12-dołkowych, a następnie traktowano wielokrotnymi dawkami IPA lub IPA i TGF-β1. Następnego dnia zebrano komórki pływające i przylegające, trypsynizowano, przemyto PBS, zawieszono w buforze wiążącym Annexin V i inkubowano z FITC-Annexin V i 7-AAD przez 15 minut.
Mitochondria w żywych komórkach barwiono pod kątem aktywności oksydacyjnej za pomocą Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia). Do testów MTR komórki LX-2 inkubowano w równych gęstościach z IPA i TGF-β1. Po 24 godzinach żywe komórki trypsynizowano, przemywano PBS, a następnie inkubowano ze 100 μM MTR w podłożu bez surowicy w temperaturze 37 °C przez 20 minut, jak opisano wcześniej [ 26 ]. Do analizy morfologii żywych komórek, wielkość komórek i złożoność cytoplazmatyczną analizowano odpowiednio przy użyciu parametrów rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC).
Wszystkie dane (30 000 zdarzeń) pozyskano przy użyciu NovoCyte Quanteon (Agilent) i przeanalizowano przy użyciu oprogramowania NovoExpress® 1.4.1 lub FlowJo V.10.
Tempo zużycia tlenu (OCR) i tempo zakwaszenia pozakomórkowego (ECAR) mierzono w czasie rzeczywistym za pomocą analizatora przepływu pozakomórkowego Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia) wyposażonego w Seahorse XF Cell Mito Stress, zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, 2 × 104 komórek LX-2/dołek wysiano na płytki do hodowli komórkowej XF96. Po całonocnej inkubacji komórki traktowano izopropanolem (IPA) i TGF-β1 (Metody Uzupełniające 1). Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania Seahorse XF Wave, które zawiera generator raportów testu fenotypu energii komórkowej Seahorse XF. Na tej podstawie obliczono wskaźnik zdrowia bioenergetycznego (BHI) [27].
Całkowity RNA został przepisany na cDNA. Szczegółowe metody opisano w publikacji [15]. Poziomy mRNA ludzkiego kwaśnego białka rybosomalnego 60S P0 (RPLP0) i cyklofiliny A1 (PPIA) wykorzystano jako konstytutywne kontrole genów. System QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, Holandia) został użyty z zestawem TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) lub zestawem Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), a względny współczynnik ekspresji genu obliczono przy użyciu parametrów cyklu porównawczego wartości Ct (ΔΔCt) i metody ∆∆Ct. Szczegóły dotyczące starterów podano w tabelach uzupełniających S2 i S3.
DNA jądrowe (ncDNA) i DNA mitochondrialne (mtDNA) wyekstrahowano przy użyciu zestawu do analizy krwi i tkanek DNeasy (Qiagen) zgodnie z wcześniejszym opisem [28]. Względną ilość mtDNA obliczono, obliczając stosunek każdego docelowego regionu mtDNA do średniej geometrycznej trzech regionów DNA jądrowego (mtDNA/ncDNA), jak opisano szczegółowo w Metodach uzupełniających 2. Szczegóły dotyczące starterów dla mtDNA i ncDNA przedstawiono w Tabeli uzupełniającej S4.
Żywe komórki barwiono barwnikiem Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Kalifornia) w celu uwidocznienia międzykomórkowych i wewnątrzkomórkowych sieci mitochondrialnych. Komórki LX-2 (1 × 104 komórek/dołek) hodowano na szkiełkach mikroskopowych w odpowiednich płytkach hodowlanych ze szklanym dnem (Ibidi GmbH, Martinsried, Niemcy). Po 24 godzinach żywe komórki LX-2 inkubowano z 100 μM MTR przez 20 min w temperaturze 37°C, a jądra komórkowe barwiono DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich), jak opisano wcześniej [29]. Sieci mitochondrialne wizualizowano za pomocą odwróconego mikroskopu Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Niemcy) wyposażonego w moduł konfokalny Zeiss LSM 800 w temperaturze 37°C, w wilgotnej atmosferze z 5% CO2, z użyciem obiektywu 63×NA 1,3. Dla każdego rodzaju próbki wykonano dziesięć obrazów serii Z. Każda seria Z zawiera 30 przekrojów, każdy o grubości 9,86 μm. Dla każdej próbki wykonano obrazy dziesięciu różnych pól widzenia za pomocą oprogramowania ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Niemcy), a analizę morfologii mitochondriów przeprowadzono za pomocą oprogramowania ImageJ (v1.54d) [30, 31] zgodnie z parametrami szczegółowo opisanymi w Metodach uzupełniających 3.
Komórki utrwalono 2% glutaraldehydem w 0,1 M buforze fosforanowym, a następnie utrwalono 1% roztworem tetratlenku osmu (Sigma Aldrich, MO, USA), stopniowo odwadniano acetonem (Merck, Darmstadt, Niemcy), a na koniec zatopiono w żywicy epoksydowej. Przygotowano ultracienkie skrawki i zabarwiono 1% octanem uranylu (Merck, Darmstadt, Niemcy) i 1% cytrynianem ołowiu (Merck, Darmstadt, Niemcy). Obrazy ultrastrukturalne uzyskano za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokio, Japonia) przy napięciu przyspieszającym 80 kV.
Morfologię komórek LX-2 poddanych działaniu IPA przez 24 godziny analizowano metodą mikroskopii fazowo-kontrastowej przy powiększeniu 50x, stosując odwrócony mikroskop świetlny firmy Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 i AxioCam MRm, Jena, Niemcy).
Dane kliniczne wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe lub medianę (zakres międzykwartylowy: IQR). Do porównania różnic między trzema grupami badawczymi zastosowano jednokierunkową analizę wariancji (zmienne ciągłe) lub test χ² (zmienne kategoryczne). Współczynnik wyników fałszywie dodatnich (FDR) zastosowano do korekty wielokrotnych testów, a geny z FDR < 0,05 uznano za statystycznie istotne. Do korelacji metylacji DNA CpG z intensywnością sygnału IPA zastosowano analizę korelacji Spearmana, z nominalnymi wartościami p (p < 0,05).
Analizę szlaków przeprowadzono za pomocą internetowego narzędzia do analizy zestawów genów (WebGestalt) dla 268 transkryptów (nominalny p < 0,01), 119 transkryptów związanych z mitochondriami (nominalny p < 0,05) oraz 4350 transkryptów CpG z 3093 transkryptów wątrobowych, które były powiązane z poziomami IPA w surowicy. Do znalezienia nakładających się genów wykorzystano bezpłatne narzędzie Venny DB (wersja 2.1.0), a do wizualizacji interakcji białko-białko wykorzystano narzędzie StringDB (wersja 11.5).
W eksperymencie LX-2 próbki testowano pod kątem normalności rozkładu za pomocą testu D'Agostino-Pearsona. Dane uzyskano z co najmniej trzech powtórzeń biologicznych i poddano jednoczynnikowej analizie wariancji (ANOVA) z testem post hoc Bonferroniego. Wartość p poniżej 0,05 uznawano za istotną statystycznie. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, a liczba eksperymentów jest podana na każdym rysunku. Wszystkie analizy i wykresy wykonano za pomocą oprogramowania statystycznego GraphPad Prism 8 dla systemu Windows (GraphPad Software Inc., wersja 8.4.3, San Diego, USA).
Najpierw zbadaliśmy związek między poziomami IPA w surowicy a transkryptami wątrobowymi, ogólnoustrojowymi i mitochondrialnymi. W profilu transkryptów całkowitych, genem najsilniej powiązanym z poziomami IPA w surowicy był MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; kinaza białkowa aktywowana mitogenem 3); w profilu transkryptów związanych z mitochondriami, genem najsilniej powiązanym był AKT1 (FDR = 0,7621; kinaza serynowo-treoninowa AKT 1) (plik dodatkowy 1 i plik dodatkowy 2).
Następnie przeanalizowaliśmy transkrypty globalne (n = 268; p < 0,01) i transkrypty związane z mitochondriami (n = 119; p < 0,05), ostatecznie identyfikując apoptozę jako najważniejszą ścieżkę kanoniczną (p = 0,0089). W przypadku transkryptów mitochondrialnych związanych z poziomami IPA w surowicy skupiliśmy się na apoptozie (FDR = 0,00001), mitofagii (FDR = 0,00029) oraz szlakach sygnałowych TNF (FDR = 0,000006) (ryc. 1A, tabela 2 i rysunki uzupełniające 1A–B).
Nakładająca się analiza globalnych transkryptów związanych z mitochondriami i metylacji DNA w ludzkiej wątrobie w powiązaniu z poziomami IPA w surowicy. A przedstawia 268 globalnych transkryptów, 119 transkryptów związanych z mitochondriami i metylowanych transkryptów DNA, które są mapowane na 3092 miejsca CpG związane z poziomami IPA w surowicy (wartości p < 0,01 dla globalnych transkryptów i metylowanego DNA oraz wartości p < 0,05 dla transkryptów mitochondrialnych). Główne nakładające się transkrypty są pokazane w środku (AKT1 i YKT6). B Mapa interakcji 13 genów o najwyższym wyniku interakcji (0,900) z innymi genami została skonstruowana z 56 nakładających się genów (czarny obszar linii), które były istotnie związane z poziomami IPA w surowicy przy użyciu narzędzia online StringDB. Zielony: Geny zmapowane na składnik komórkowy Gene Ontology (GO): mitochondria (GO:0005739). AKT1 to białko o najwyższym wyniku (0,900) w zakresie interakcji z innymi białkami na podstawie danych (na podstawie eksploracji tekstu, eksperymentów, baz danych i współekspresji). Węzły sieciowe reprezentują białka, a krawędzie reprezentują połączenia między białkami.
Ponieważ metabolity mikrobioty jelitowej mogą regulować skład epigenetyczny poprzez metylację DNA [32], zbadaliśmy, czy poziomy IPA w surowicy są powiązane z metylacją DNA w wątrobie. Stwierdziliśmy, że dwa główne miejsca metylacji związane z poziomami IPA w surowicy znajdowały się w pobliżu regionu 3 bogatego w prolinę i serynę (C19orf55) oraz członka 6 rodziny białek szoku cieplnego B (małego) (HSPB6) (plik dodatkowy 3). Metylacja DNA 4350 CpG (p < 0,01) była skorelowana z poziomami IPA w surowicy i była wzbogacona w szlaki regulacji długowieczności (p = 0,006) (rycina 1A, tabela 2 i rysunek uzupełniający 1C).
Aby zrozumieć mechanizmy biologiczne leżące u podstaw powiązań między poziomami IPA w surowicy, transkryptami globalnymi, transkryptami związanymi z mitochondriami oraz metylacją DNA w ludzkiej wątrobie, przeprowadziliśmy analizę nakładania się genów zidentyfikowanych w poprzedniej analizie szlaków (rycina 1A). Wyniki analizy wzbogacenia szlaków 56 nakładających się genów (zaznaczonych czarną linią na rycinie 1A) wykazały, że szlak apoptozy (p = 0,00029) uwypuklił dwa geny wspólne dla trzech analiz: AKT1 i YKT6 (homolog YKT6 v-SNARE), jak pokazano na diagramie Venna (rycina uzupełniająca 2 i rycina 1A). Co ciekawe, odkryliśmy, że AKT1 (cg19831386) i YKT6 (cg24161647) były dodatnio skorelowane z poziomami IPA w surowicy (plik dodatkowy 3). Aby zidentyfikować potencjalne interakcje białkowe między produktami genów, wybraliśmy 13 genów z najwyższym wynikiem wspólnego regionu (0,900) spośród 56 nakładających się genów jako dane wejściowe i skonstruowaliśmy mapę interakcji. Zgodnie z poziomem ufności (marginalnym poziomem ufności), gen AKT1 z najwyższym wynikiem (0,900) znajdował się na szczycie (rysunek 1B).
Na podstawie analizy szlaku odkryliśmy, że apoptoza była głównym szlakiem, dlatego zbadaliśmy, czy leczenie IPA wpłynie na apoptozę komórek macierzystych krwiotwórczych (HSC) in vitro. Wcześniej wykazaliśmy, że różne dawki IPA (10 μM, 100 μM i 1 mM) nie są toksyczne dla komórek LX-2 [15]. Niniejsze badanie wykazało, że leczenie IPA w stężeniu 10 μM i 100 μM zwiększyło liczbę żywych i martwiczych komórek. Jednakże, w porównaniu z grupą kontrolną, żywotność komórek zmniejszyła się przy stężeniu IPA 1 mM, podczas gdy tempo martwicy komórek pozostało niezmienione (Rysunek 2A, B). Następnie, aby znaleźć optymalne stężenie indukujące apoptozę w komórkach LX-2, przetestowaliśmy 10 μM, 100 μM i 1 mM IPA przez 24 godziny (Rysunek 2A-E i Rysunek uzupełniający 3A-B). Co ciekawe, IPA w stężeniu 10 μM i 100 μM zmniejszyło wskaźnik apoptozy (%), natomiast IPA w stężeniu 1 mM zwiększyło późną apoptozę i wskaźnik apoptozy (%) w porównaniu z grupą kontrolną, dlatego też wybrano je do dalszych eksperymentów (rysunki 2A–D).
IPA indukuje apoptozę komórek LX-2. Do ilościowego określenia tempa apoptozy i morfologii komórek metodą cytometrii przepływowej zastosowano metodę podwójnego barwienia Annexin V i 7-AAD. Komórki BA inkubowano z 10 μM, 100 μM i 1 mM IPA przez 24 godziny lub z F–H TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA w podłożu bez surowicy przez 24 godziny. A: żywe komórki (Anneksyna V -/ 7AAD-); B: komórki martwicze (Anneksyna V -/ 7AAD+); C, F: wczesne (Anneksyna V +/ 7AAD-); D, G: późne (Anneksyna V+/7AAD.+); E, H: odsetek wszystkich wczesnych i późnych komórek apoptotycznych w tempie apoptozy (%). Dane wyrażono jako średnia ± SD, n = 3 niezależne eksperymenty. Porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji z testem post hoc Bonferroniego. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Jak wykazaliśmy wcześniej, 5 ng/ml TGF-β1 może indukować aktywację HSC poprzez zwiększenie ekspresji klasycznych genów markerowych [15]. Komórki LX-2 poddano działaniu 5 ng/ml TGF-β1 i 1 mM IPA w połączeniu (ryc. 2E–H). Leczenie TGF-β1 nie zmieniło tempa apoptozy, jednak jednoczesne leczenie IPA zwiększyło późną apoptozę i tempo apoptozy (%) w porównaniu z leczeniem TGF-β1 (ryc. 2E–H). Wyniki te wskazują, że 1 mM IPA może promować apoptozę w komórkach LX-2 niezależnie od indukcji TGF-β1.
Przeprowadziliśmy dalsze badania wpływu IPA na oddychanie mitochondrialne w komórkach LX-2. Wyniki wykazały, że 1 mM IPA zmniejszyło parametry tempa zużycia tlenu (OCR): oddychanie pozamitochondrialne, oddychanie podstawowe i maksymalne, wyciek protonów i produkcję ATP w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 3A, B), podczas gdy wskaźnik zdrowia bioenergetycznego (BHI) nie uległ zmianie.
IPA zmniejsza oddychanie mitochondrialne w komórkach LX-2. Krzywa oddychania mitochondrialnego (OCR) jest przedstawiona jako parametry oddychania mitochondrialnego (oddychanie niemitochondrialne, oddychanie podstawowe, oddychanie maksymalne, wyciek protonów, generowanie ATP, SRC i BHI). Komórki A i B inkubowano z 10 μM, 100 μM i 1 mM IPA przez 24 godziny, odpowiednio. Komórki C i D inkubowano z TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA w podłożu bez surowicy przez 24 godziny, odpowiednio. Wszystkie pomiary znormalizowano do zawartości DNA przy użyciu zestawu CyQuant. BHI: wskaźnik zdrowia bioenergetycznego; SRC: rezerwowa pojemność oddechowa; OCR: tempo zużycia tlenu. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD), n = 5 niezależnych eksperymentów. Porównania statystyczne przeprowadzono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) i testu post hoc Bonferroniego. *p < 0,05; **p < 0,01; i ***p < 0,001
Aby uzyskać pełniejsze zrozumienie wpływu IPA na profil bioenergetyczny komórek LX-2 aktywowanych TGF-β1, przeanalizowaliśmy fosforylację oksydacyjną mitochondriów metodą OCR (ryc. 3C, D). Wyniki pokazały, że leczenie TGF-β1 mogło zmniejszyć maksymalną wydolność oddechową, rezerwową pojemność oddechową (SRC) i wskaźnik BHI w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 3C, D). Ponadto leczenie skojarzone zmniejszyło podstawowe oddychanie, wyciek protonów i produkcję ATP, ale wskaźniki SRC i BHI były istotnie wyższe niż w przypadku leczenia TGF-β1 (ryc. 3C, D).
Wykonaliśmy również „Test fenotypu energii komórkowej” dostarczony przez oprogramowanie Seahorse (Rys. uzupełniający 4A–D). Jak pokazano na Rys. uzupełniającym 3B, potencjały metaboliczne zarówno OCR, jak i ECAR uległy obniżeniu po leczeniu TGF-β1, jednak nie zaobserwowano różnicy między grupą leczoną kombinacją i IPA a grupą kontrolną. Ponadto, zarówno podstawowy, jak i stresowy poziom OCR uległ obniżeniu po leczeniu kombinacją i IPA w porównaniu z grupą kontrolną (Rys. uzupełniający 4C). Co ciekawe, podobny wzorzec zaobserwowano w przypadku terapii skojarzonej, gdzie nie zaobserwowano zmian w podstawowym i stresowym poziomie ECAR w porównaniu z leczeniem TGF-β1 (Rys. uzupełniający 4C). W komórkach macierzystych krwi (HSC), redukcja fosforylacji oksydacyjnej mitochondriów i zdolność terapii skojarzonej do przywrócenia SCR i BHI po ekspozycji na leczenie TGF-β1 nie zmieniły potencjału metabolicznego (OCR i ECAR). Łącznie wyniki te wskazują, że IPA może obniżać bioenergetykę w komórkach macierzystych krwi (HSC), co sugeruje, że IPA może powodować niższy profil energetyczny, który przesuwa fenotyp HSC w kierunku inaktywacji (Rysunek uzupełniający 4D).
Wpływ IPA na dynamikę mitochondriów zbadano, stosując trójwymiarową kwantyfikację morfologii i połączeń sieciowych mitochondriów, a także barwienie MTR (rycina 4 i rycina uzupełniająca 5). Rycina 4 pokazuje, że w porównaniu z grupą kontrolną, leczenie TGF-β1 zmniejszyło średnią powierzchnię, liczbę rozgałęzień, całkowitą długość rozgałęzień i liczbę połączeń rozgałęzień (rycina 4A i B) oraz zmieniło proporcję mitochondriów z morfologii kulistej na pośrednią (rycina 4C). Jedynie leczenie IPA zmniejszyło średnią objętość mitochondriów i zmieniło proporcję mitochondriów z morfologii kulistej na pośrednią w porównaniu z grupą kontrolną (rycina 4A). Natomiast sferyczność, średnia długość rozgałęzień i aktywność mitochondriów oceniane za pomocą mitochondrialnego potencjału błonowego MTR (rycina 4A i E) pozostały niezmienione, a parametry te nie różniły się między grupami. Łącznie wyniki te wskazują, że leczenie TGF-β1 i IPA wydaje się modulować kształt i wielkość mitochondriów, a także złożoność sieci w żywych komórkach LX-2.
IPA zmienia dynamikę mitochondriów i obfitość mitochondrialnego DNA w komórkach LX-2. A. Reprezentatywne obrazy konfokalne żywych komórek LX-2 inkubowanych z TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA przez 24 godziny w podłożu bez surowicy, ukazujące sieci mitochondrialne barwione barwnikiem Mitotracker™ Red CMXRos i jądra barwione na niebiesko barwnikiem DAPI. Wszystkie dane zawierały co najmniej 15 obrazów na grupę. Dla każdego rodzaju próbki uzyskano 10 obrazów w układzie Z. Każda sekwencja w osi Z zawierała 30 warstw, każda o grubości 9,86 μm. Skala: 10 μm. B. Obiekty reprezentatywne (tylko mitochondria) zidentyfikowano poprzez zastosowanie progowania adaptacyjnego do obrazu. Przeprowadzono analizę ilościową i porównanie połączeń sieci morfologicznych mitochondriów dla wszystkich komórek w każdej grupie. C. Częstotliwość stosunków kształtów mitochondriów. Wartości bliskie 0 oznaczają kształty kuliste, a wartości bliskie 1 – kształty nitkowate. D Zawartość mitochondrialnego DNA (mtDNA) określono zgodnie z opisem w części „Materiały i metody”. E Analizę Mitotracker™ Red CMXRos przeprowadzono metodą cytometrii przepływowej (30 000 zdarzeń) zgodnie z opisem w części „Materiały i metody”. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, n = 3 niezależne eksperymenty. Porównania statystyczne przeprowadzono z użyciem jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) i testu post hoc Bonferroniego. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Następnie przeanalizowaliśmy zawartość mtDNA w komórkach LX-2 jako wskaźnik liczby mitochondriów. W porównaniu z grupą kontrolną, zawartość mtDNA była zwiększona w grupie leczonej TGF-β1 (ryc. 4D). W porównaniu z grupą leczoną TGF-β1, zawartość mtDNA była zmniejszona w grupie leczonej skojarzeniem (ryc. 4D), co sugeruje, że IPA może zmniejszać zawartość mtDNA, a potencjalnie także liczbę mitochondriów i oddychanie mitochondrialne (ryc. 3C). Co więcej, IPA wydawał się zmniejszać zawartość mtDNA w leczeniu skojarzonym, ale nie wpływał na aktywność mitochondrialną zależną od MTR (ryc. 4A–C).
Zbadaliśmy związek IPA z poziomami mRNA genów związanych z włóknieniem, apoptozą, przeżyciem i dynamiką mitochondriów w komórkach LX-2 (ryc. 5A–D). W porównaniu z grupą kontrolną, w grupie leczonej TGF-β1 zaobserwowano zwiększoną ekspresję genów, takich jak łańcuch α2 kolagenu typu I (COL1A2), α-aktyna mięśni gładkich (αSMA), metaloproteinaza macierzy 2 (MMP2), inhibitor tkankowy metaloproteinazy 1 (TIMP1) oraz gen podobny do dynaminy 1 (DRP1), co wskazuje na nasilenie włóknienia i aktywacji. Ponadto, w porównaniu z grupą kontrolną, leczenie TGF-β1 zmniejszyło poziomy mRNA receptora jądrowego pregnanu X (PXR), kaspazy 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitora α-komórki B, wzmacniacza lekkiego peptydu genu czynnika jądrowego κ (NFκB1A) i inhibitora podjednostki β kinazy czynnika jądrowego κB (IKBKB) (ryc. 5A–D). W porównaniu z leczeniem TGF-β1, leczenie skojarzone TGF-β1 i IPA zmniejszyło ekspresję COL1A2 i MMP2, ale zwiększyło poziomy mRNA PXR, TIMP1, chłoniaka B-komórkowego 2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β i IKBKB. Leczenie IPA znacząco zmniejszyło ekspresję MMP2, białka X związanego z Bcl-2 (BAX), AKT1, białka zaniku nerwu wzrokowego 1 (OPA1) i białka fuzji mitochondrialnej 2 (MFN2), podczas gdy ekspresja CASP8, NFκB1A, NFκB1B i IKBKB była zwiększona w porównaniu z grupą kontrolną. Nie stwierdzono jednak różnic w ekspresji kaspazy-3 (CASP3), czynnika aktywującego peptydazę apoptotyczną 1 (APAF1), białka fuzji mitochondrialnej 1 (MFN1) i białka rozszczepienia 1 (FIS1). Łącznie wyniki te sugerują, że leczenie IPA moduluje ekspresję genów związanych z włóknieniem, apoptozą, przeżyciem i dynamiką mitochondriów. Nasze dane sugerują, że leczenie IPA zmniejsza włóknienie w komórkach LX-2; jednocześnie stymuluje przeżycie poprzez przesunięcie fenotypu w kierunku inaktywacji.
IPA moduluje ekspresję genów fibroblastów, apoptozy, żywotności i dynamiki mitochondriów w komórkach LX-2. Histogramy przedstawiają ekspresję mRNA względem kontroli endogennej (RPLP0 lub PPIA) po indukcji komórek LX-2 TGF-β1 i IPA w pożywce bez surowicy przez 24 godziny. A oznacza fibroblasty, B oznacza komórki apoptotyczne, C oznacza komórki przeżywające, a D oznacza ekspresję genów dynamiki mitochondriów. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD), n = 3 niezależne eksperymenty. Porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) i testu post hoc Bonferroniego. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Następnie zmiany wielkości komórek (FSC-H) i złożoności cytoplazmatycznej (SSC-H) oceniano za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 6A, B), a zmiany morfologii komórek po leczeniu IPA oceniano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i mikroskopii z kontrastem fazowym (ryc. uzupełniająca 6A-B). Zgodnie z oczekiwaniami, komórki w grupie leczonej TGF-β1 zwiększyły swoją wielkość w porównaniu z grupą kontrolną (ryc. 6A, B), wykazując klasyczną ekspansję szorstkiego retikulum endoplazmatycznego (ER*) i fagolizosomów (P), co wskazuje na aktywację komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) (ryc. uzupełniająca 6A). Jednakże, w porównaniu z grupą leczoną TGF-β1, wielkość komórek, złożoność cytoplazmatyczna (ryc. 6A, B) i zawartość ER* były zmniejszone w grupie leczonej skojarzeniem TGF-β1 i IPA (ryc. uzupełniająca 6A). Co więcej, leczenie IPA zmniejszyło rozmiar komórek, złożoność cytoplazmatyczną (ryc. 6A, B) oraz zawartość P i ER* (ryc. uzupełniająca 6A) w porównaniu z grupą kontrolną. Co więcej, po 24 godzinach leczenia IPA wzrosła zawartość komórek apoptotycznych w porównaniu z grupą kontrolną (białe strzałki, ryc. uzupełniająca 6B). Podsumowując, wyniki te sugerują, że 1 mM IPA może stymulować apoptozę komórek macierzystych krwi (HSC) i odwracać zmiany parametrów morfologicznych komórek indukowane przez TGF-β1, regulując w ten sposób rozmiar i złożoność komórek, co może być związane z inaktywacją komórek macierzystych krwi (HSC).
IPA zmienia wielkość komórek i złożoność cytoplazmatyczną w komórkach LX-2. Reprezentatywne obrazy z analizy cytometrii przepływowej. W analizie wykorzystano strategię bramkowania specyficzną dla komórek LX-2: SSC-A/FSC-A w celu zdefiniowania populacji komórek, FSC-H/FSC-A w celu identyfikacji dubletów oraz SSC-H/FSC-H do analizy wielkości komórek i złożoności. Komórki inkubowano z TGF-β1 (5 ng/ml) i 1 mM IPA w podłożu bez surowicy przez 24 godziny. Komórki LX-2 rozdzielono do lewego dolnego kwadrantu (SSC-H-/FSC-H-), lewego górnego kwadrantu (SSC-H+/FSC-H-), prawego dolnego kwadrantu (SSC-H-/FSC-H+) i prawego górnego kwadrantu (SSC-H+/FSC-H+) w celu analizy wielkości komórek i złożoności cytoplazmatycznej. B. Morfologię komórek analizowano metodą cytometrii przepływowej z użyciem FSC-H (rozproszenie do przodu, wielkość komórki) i SSC-H (rozproszenie boczne, złożoność cytoplazmatyczna) (30 000 zdarzeń). Dane przedstawiono jako średnia ± SD, n = 3 niezależne eksperymenty. Porównania statystyczne przeprowadzono z użyciem jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) i testu post hoc Bonferroniego. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 i ****p < 0,0001
Metabolity jelitowe, takie jak IPA, stały się gorącym tematem badań, sugerując, że nowe cele mogą być odkrywane w mikrobiomie jelitowej. Dlatego interesujące jest, że IPA, metabolit, który powiązaliśmy z włóknieniem wątroby u ludzi [15], okazał się potencjalnym związkiem przeciwwłóknieniowym w modelach zwierzęcych [13, 14]. Tutaj po raz pierwszy wykazujemy związek między surowiczym IPA a globalną transkryptomiką wątroby i metylacją DNA u osób otyłych bez cukrzycy typu 2 (T2D), podkreślając apoptozę, mitofagię i długowieczność, a także potencjalnego genu kandydującego AKT1 regulującego homeostazę wątroby. Kolejną nowością naszego badania jest to, że wykazaliśmy interakcję leczenia IPA z apoptozą, morfologią komórek, bioenergetyką mitochondrialną i dynamiką w komórkach LX-2, co wskazuje na niższe widmo energetyczne, które przesuwa fenotyp HSC w kierunku inaktywacji, co czyni IPA potencjalnym kandydatem na poprawę włóknienia wątroby.
Stwierdziliśmy, że apoptoza, mitofagia i długowieczność były najważniejszymi kanonicznymi szlakami wzbogaconymi w genach wątrobowych związanych z krążącym w surowicy IPA. Zaburzenie systemu kontroli jakości mitochondriów (MQC) może prowadzić do dysfunkcji mitochondriów, mitofagii i apoptozy, promując w ten sposób występowanie MASLD [33, 34]. Dlatego możemy spekulować, że IPA może być zaangażowana w utrzymanie dynamiki komórkowej i integralności mitochondriów poprzez apoptozę, mitofagię i długowieczność w wątrobie. Nasze dane wykazały, że dwa geny były wspólne dla trzech testów: YKT6 i AKT1. Warto zauważyć, że YKT6 jest białkiem SNARE zaangażowanym w proces fuzji błon komórkowych. Odgrywa rolę w autofagii i mitofagii, tworząc kompleks inicjacyjny z STX17 i SNAP29 na autofagosomie, promując w ten sposób fuzję autofagosomów i lizosomów [35]. Ponadto utrata funkcji YKT6 powoduje upośledzenie mitofagii[36], podczas gdy wzmożona ekspresja YKT6 jest związana z postępem raka wątrobowokomórkowego (HCC), wykazując zwiększoną przeżywalność komórek[37]. Z drugiej strony, AKT1 jest najważniejszym genem oddziałującym i odgrywa ważną rolę w chorobach wątroby, w tym w szlaku sygnałowym PI3K/AKT, cyklu komórkowym, migracji komórek, proliferacji, adhezji ogniskowej, funkcji mitochondriów i wydzielaniu kolagenu[38–40]. Aktywowany szlak sygnałowy PI3K/AKT może aktywować komórki macierzyste układu krwiotwórczego (HSC), które są komórkami odpowiedzialnymi za produkcję macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a jego dysregulacja może przyczyniać się do występowania i postępu włóknienia wątroby[40]. Ponadto AKT jest jednym z kluczowych czynników przeżycia komórek, który hamuje zależną od p53 apoptozę komórek, a aktywacja AKT może być związana z hamowaniem apoptozy komórek wątroby[41, 42]. Uzyskane wyniki sugerują, że IPA może brać udział w apoptozie związanej z mitochondriami wątrobowymi, wpływając na decyzję hepatocytów o wejściu w apoptozę lub przeżyciu. Efekty te mogą być regulowane przez geny kandydujące AKT i/lub YKT6, które są kluczowe dla homeostazy wątroby.
Nasze wyniki wykazały, że 1 mM IPA indukowało apoptozę i zmniejszało oddychanie mitochondrialne w komórkach LX-2 niezależnie od leczenia TGF-β1. Warto zauważyć, że apoptoza jest głównym szlakiem rozwiązywania włóknienia i aktywacji komórek macierzystych hematopoezy (HSC), a także kluczowym zdarzeniem w odwracalnej odpowiedzi fizjologicznej włóknienia wątroby [4, 43]. Ponadto, przywrócenie BHI w komórkach LX-2 po leczeniu skojarzonym dostarczyło nowych spostrzeżeń na temat potencjalnej roli IPA w regulacji bioenergetyki mitochondrialnej. W warunkach spoczynku i nieaktywności komórki hematopoetyczne normalnie wykorzystują mitochondrialną fosforylację oksydacyjną do produkcji ATP i mają niską aktywność metaboliczną. Z drugiej strony, aktywacja HSC nasila oddychanie i biosyntezę mitochondriów, aby zrekompensować zapotrzebowanie na energię wejścia w stan glikolizy [44]. Fakt, że IPA nie wpłynął na potencjał metaboliczny i ECAR sugeruje, że szlak glikolizy jest mniej priorytetowy. Podobnie, inne badanie wykazało, że 1 mM IPA było w stanie modulować aktywność łańcucha oddechowego mitochondriów w kardiomiocytach, linii komórkowej ludzkich hepatocytów (Huh7) i ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC); Jednakże nie stwierdzono wpływu IPA na glikolizę w kardiomiocytach, co sugeruje, że IPA może wpływać na bioenergetykę innych typów komórek [45]. Dlatego spekulujemy, że 1 mM IPA może działać jako łagodny chemiczny rozprzęgacz, ponieważ może znacząco zmniejszyć ekspresję genu fibrogenicznego, morfologię komórki i bioenergetykę mitochondrialną bez zmiany ilości mtDNA [46]. Mitochondrialne rozprzęgacze mogą hamować zwłóknienie wywołane hodowlą i aktywację HSC [47] oraz zmniejszać produkcję ATP w mitochondriach regulowaną lub indukowaną przez niektóre białka, takie jak białka rozprzęgające (UCP) lub translokaza nukleotydu adeninowego (ANT). W zależności od rodzaju komórki zjawisko to może chronić komórki przed apoptozą i/lub ją promować [46]. Konieczne są jednak dalsze badania, aby wyjaśnić rolę IPA jako odsprzęgacza mitochondriów w inaktywacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego.
Następnie zbadaliśmy, czy zmiany w oddychaniu mitochondrialnym znajdują odzwierciedlenie w morfologii mitochondriów w żywych komórkach LX-2. Co ciekawe, leczenie TGF-β1 zmienia proporcję mitochondriów z kulistej na pośrednią, ze zmniejszeniem rozgałęzień mitochondriów i zwiększoną ekspresją DRP1, kluczowego czynnika w podziale mitochondriów [48]. Ponadto fragmentacja mitochondriów jest związana z ogólną złożonością sieci, a przejście od fuzji do rozszczepienia jest krytyczne dla aktywacji komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC), podczas gdy hamowanie podziału mitochondriów prowadzi do apoptozy HSC [49]. Zatem nasze wyniki wskazują, że leczenie TGF-β1 może indukować zmniejszenie złożoności sieci mitochondrialnej ze zmniejszeniem rozgałęzień, co jest częstsze w podziale mitochondriów związanym z aktywowanymi komórkami macierzystymi układu krwiotwórczego (HSC). Co więcej, nasze dane wykazały, że IPA może zmieniać proporcję mitochondriów z kształtu kulistego na pośredni, zmniejszając w ten sposób ekspresję OPA1 i MFN2. Badania wykazały, że obniżenie ekspresji OPA1 może powodować spadek potencjału błonowego mitochondriów i wyzwalać apoptozę komórek [50]. Wiadomo, że MFN2 pośredniczy w fuzji i apoptozie mitochondriów [51]. Uzyskane wyniki sugerują, że indukcja komórek LX-2 przez TGF-β1 i/lub IPA wydaje się modulować kształt i rozmiar mitochondriów, a także stan aktywacji i złożoność sieci.
Nasze wyniki wskazują, że skojarzone leczenie TGFβ-1 i IPA może obniżyć poziom mtDNA i parametry morfologiczne komórek poprzez regulację ekspresji mRNA genów związanych z włóknieniem, apoptozą i przeżyciem w komórkach unikających apoptozy. IPA rzeczywiście zmniejszyła poziom ekspresji mRNA AKT1 i ważnych genów związanych z włóknieniem, takich jak COL1A2 i MMP2, ale zwiększyła poziom ekspresji CASP8, który jest związany z apoptozą. Nasze wyniki wykazały, że po leczeniu IPA ekspresja BAX spadła, a ekspresja mRNA podjednostek rodziny TIMP1, BCL-2 i NF-κB wzrosła, co sugeruje, że IPA może stymulować sygnały przeżycia w hematopoetycznych komórkach macierzystych (HSC) unikających apoptozy. Te cząsteczki mogą działać jako sygnały pro-przeżycia w aktywowanych hematopoetycznych komórkach macierzystych, co może być związane ze zwiększoną ekspresją białek antyapoptotycznych (takich jak Bcl-2), zmniejszoną ekspresją proapoptotycznego BAX i złożoną interakcją między TIMP i NF-κB [5, 7]. IPA wywiera swoje działanie poprzez PXR i odkryliśmy, że leczenie skojarzone TGF-β1 i IPA zwiększyło poziomy ekspresji mRNA PXR, co wskazuje na supresję aktywacji HSC. Wiadomo, że aktywowana sygnalizacja PXR hamuje aktywację HSC zarówno in vivo, jak i in vitro [52, 53]. Nasze wyniki wskazują, że IPA może uczestniczyć w usuwaniu aktywowanych HSC poprzez promowanie apoptozy, zmniejszanie zwłóknienia i metabolizmu mitochondriów oraz wzmacnianie sygnałów przeżycia, które są typowymi procesami, które przekształcają fenotyp aktywowanych HSC w fenotyp inaktywowanych. Innym możliwym wyjaśnieniem potencjalnego mechanizmu i roli IPA w apoptozie jest to, że usuwa ona dysfunkcyjne mitochondria głównie poprzez mitofagię (szlak wewnętrzny) oraz zewnętrzny szlak sygnałowy TNF (Tabela 1), który jest bezpośrednio powiązany ze szlakiem sygnałowym przeżycia NF-κB (Rysunek uzupełniający 7). Co ciekawe, wzbogacone geny związane z IPA są w stanie indukować sygnały proapoptotyczne i proprzeżyciowe w szlaku apoptotycznym [54], co sugeruje, że IPA może indukować szlak apoptotyczny lub przeżycie poprzez interakcję z tymi genami. Jednak sposób, w jaki IPA indukuje apoptozę lub przeżycie podczas aktywacji komórek macierzystych krwi (HSC), oraz jego mechanistyczne ścieżki pozostają niejasne.
IPA jest metabolitem mikrobiologicznym powstającym z tryptofanu z pożywienia przez mikrobiotę jelitową. Badania wykazały, że ma właściwości przeciwzapalne, antyoksydacyjne i epigenetyczne regulujące środowisko jelitowe.[55] Badania wykazały, że IPA może modulować funkcję bariery jelitowej i zmniejszać stres oksydacyjny, co może przyczyniać się do jego lokalnych efektów fizjologicznych.[56] W rzeczywistości IPA jest transportowana do narządów docelowych poprzez krążenie, a ponieważ IPA ma podobną strukturę głównego metabolitu do pochodnych tryptofanu, serotoniny i indolu, IPA wywiera działania metaboliczne skutkujące konkurencyjnymi losami metabolicznymi.[52] IPA może konkurować z metabolitami pochodzącymi z tryptofanu o miejsca wiązania na enzymach lub receptorach, potencjalnie zakłócając normalne szlaki metaboliczne. Podkreśla to potrzebę dalszych badań nad jego farmakokinetyką i farmakodynamiką, aby lepiej zrozumieć jego okno terapeutyczne.[57] Pozostaje pytanie, czy może to również wystąpić w komórkach macierzystych układu krwiotwórczego (HSC).
Zdajemy sobie sprawę, że nasze badanie ma pewne ograniczenia. Aby szczegółowo zbadać powiązania związane z IPA, wykluczono pacjentów z cukrzycą typu 2 (T2DM). Zdajemy sobie sprawę, że ogranicza to szerokie zastosowanie naszych ustaleń do pacjentów z cukrzycą typu 2 i zaawansowaną chorobą wątroby. Chociaż fizjologiczne stężenie IPA w surowicy ludzkiej wynosi 1–10 μM [11, 20], stężenie 1 mM IPA wybrano na podstawie najwyższego nietoksycznego stężenia [15] i najwyższego wskaźnika apoptozy, bez różnicy w odsetku populacji komórek martwiczych. Chociaż w tym badaniu zastosowano ponadfizjologiczne poziomy IPA, obecnie nie ma konsensusu co do skutecznej dawki IPA [52]. Chociaż nasze wyniki są istotne, szerszy los metaboliczny IPA pozostaje aktywnym obszarem badań. Co więcej, nasze ustalenia dotyczące związku między poziomami IPA w surowicy a metylacją DNA transkryptów wątrobowych uzyskano nie tylko z komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC), ale także z tkanek wątroby. Zdecydowaliśmy się na wykorzystanie ludzkich komórek LX-2 w oparciu o nasze wcześniejsze ustalenia z analizy transkryptomu, zgodnie z którymi IPA jest związana z aktywacją komórek macierzystych układu krwiotwórczego (HSC) [15], a HSC są głównymi komórkami zaangażowanymi w postęp włóknienia wątroby. Wątroba składa się z wielu typów komórek, dlatego należy rozważyć inne modele komórkowe, takie jak układ współhodowli hepatocytów, HSC i komórek odpornościowych w połączeniu z aktywacją kaspazy i fragmentacją DNA, a także mechanizm działania, w tym poziom białka, aby zbadać rolę IPA i jego interakcję z innymi typami komórek wątroby.