Niniejszy artykuł jest częścią tematu badawczego „Zastosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych, oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe i mikrobiom zwierząt rzeźnych”. Zobacz wszystkie 13 artykułów
Kwasy organiczne nadal cieszą się dużym popytem jako dodatki do pasz. Do tej pory nacisk kładziony był na bezpieczeństwo żywności, a w szczególności na ograniczenie występowania patogenów przenoszonych przez żywność u drobiu i innych zwierząt. Kilka kwasów organicznych jest obecnie badanych lub jest już w użyciu komercyjnym. Spośród wielu kwasów organicznych, które były przedmiotem intensywnych badań, jednym z nich jest kwas mrówkowy. Kwas mrówkowy jest dodawany do pasz dla drobiu w celu ograniczenia obecności Salmonelli i innych patogenów przenoszonych przez żywność w paszy i w przewodzie pokarmowym po spożyciu. Wraz z pogłębianiem się wiedzy na temat skuteczności i wpływu kwasu mrówkowego na żywiciela i patogeny przenoszone przez żywność, staje się jasne, że obecność kwasu mrówkowego może aktywować specyficzne szlaki u Salmonelli. Reakcja ta może stać się bardziej złożona, gdy kwas mrówkowy dostanie się do przewodu pokarmowego i wejdzie w interakcję nie tylko z Salmonellą już kolonizującą przewód pokarmowy, ale także z własną florą bakteryjną jelit. W niniejszym przeglądzie przeanalizowane zostaną aktualne wyniki i perspektywy dalszych badań nad mikrobiomem drobiu i paszy poddanej działaniu kwasu mrówkowego.
Zarówno w produkcji zwierzęcej, jak i drobiarskiej wyzwaniem jest opracowanie strategii zarządzania, które optymalizują wzrost i wydajność, jednocześnie ograniczając ryzyko dla bezpieczeństwa żywności. Historycznie, podawanie antybiotyków w stężeniach subterapeutycznych poprawiało zdrowie, dobrostan i wydajność zwierząt (1–3). Z perspektywy mechanizmu działania, zaproponowano, że antybiotyki podawane w stężeniach subinhibitorowych pośredniczą w odpowiedziach gospodarza poprzez modulację flory bakteryjnej przewodu pokarmowego (GI), a tym samym jej interakcje z gospodarzem (3). Jednak ciągłe obawy dotyczące potencjalnego rozprzestrzeniania się patogenów przenoszonych przez żywność opornych na antybiotyki i ich potencjalnego związku z zakażeniami opornymi na antybiotyki u ludzi doprowadziły do ​​stopniowego wycofywania antybiotyków u zwierząt hodowlanych (4–8). Dlatego też opracowanie dodatków paszowych i polepszaczy, które spełniają przynajmniej niektóre z tych wymagań (poprawa zdrowia, dobrostanu i wydajności zwierząt), jest przedmiotem dużego zainteresowania zarówno z punktu widzenia badań naukowych, jak i rozwoju komercyjnego (5, 9). Na rynku pasz dla zwierząt pojawiło się wiele komercyjnych dodatków paszowych, w tym probiotyki, prebiotyki, olejki eteryczne i pokrewne związki z różnych źródeł roślinnych oraz substancje chemiczne, takie jak aldehydy (10–14). Inne komercyjne dodatki paszowe powszechnie stosowane u drobiu to bakteriofagi, tlenek cynku, enzymy egzogenne, produkty wykluczenia konkurencyjnego oraz związki kwasowe (15, 16).
Spośród istniejących chemicznych dodatków paszowych, aldehydy i kwasy organiczne były historycznie najszerzej badanymi i stosowanymi związkami (12, 17–21). Kwasy organiczne, a zwłaszcza krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA), są dobrze znanymi antagonistami bakterii chorobotwórczych. Te kwasy organiczne są stosowane jako dodatki paszowe nie tylko w celu ograniczenia obecności patogenów w matrycy paszowej, ale także w celu wywierania aktywnego wpływu na funkcjonowanie przewodu pokarmowego (17, 20–24). Ponadto, SCFA są wytwarzane w procesie fermentacji przez florę jelitową w przewodzie pokarmowym i uważa się, że odgrywają mechanistyczną rolę w zdolności niektórych probiotyków i prebiotyków do przeciwdziałania patogenom spożywanym w przewodzie pokarmowym (21, 23, 25).
Na przestrzeni lat różne krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) zyskały dużą popularność jako dodatki paszowe. W szczególności propionian, maślan i mrówczan były przedmiotem licznych badań i zastosowań komercyjnych (17, 20, 21, 23, 24, 26). Podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się na kontroli patogenów przenoszonych przez żywność w paszach dla zwierząt i drobiu, nowsze badania przesunęły swoją uwagę na ogólną poprawę wydajności zwierząt i zdrowia przewodu pokarmowego (20, 21, 24). Octan, propionian i maślan zyskały dużą popularność jako organiczne dodatki paszowe z kwasami, wśród których kwas mrówkowy jest również obiecującym kandydatem (21, 23). Wiele uwagi poświęcono aspektom bezpieczeństwa żywności kwasu mrówkowego, w szczególności zmniejszeniu częstości występowania patogenów przenoszonych przez żywność w paszach dla zwierząt gospodarskich. Rozważane są jednak również inne możliwe zastosowania. Głównym celem niniejszego przeglądu jest zbadanie historii i aktualnego statusu kwasu mrówkowego jako polepszacza pasz dla zwierząt gospodarskich (rysunek 1). W niniejszym badaniu zbadamy mechanizm działania przeciwbakteryjnego kwasu mrówkowego. Ponadto przyjrzymy się bliżej jego wpływowi na zwierzęta gospodarskie i drób oraz omówimy możliwe metody zwiększenia jego skuteczności.
Rys. 1. Mapa myśli dotycząca tematów poruszanych w niniejszym przeglądzie. W szczególności, cele ogólne koncentrowały się na: opisaniu historii i aktualnego statusu kwasu mrówkowego jako polepszacza pasz dla zwierząt gospodarskich, mechanizmów przeciwdrobnoustrojowych kwasu mrówkowego i wpływu jego stosowania na zdrowie zwierząt i drobiu oraz potencjalnych metod poprawy skuteczności.
Produkcja pasz dla zwierząt gospodarskich i drobiu to złożona operacja obejmująca wiele etapów, w tym fizyczną obróbkę ziarna (np. mielenie w celu zmniejszenia wielkości cząstek), obróbkę termiczną w celu granulowania oraz dodawanie wielu składników odżywczych do diety w zależności od specyficznych potrzeb żywieniowych zwierzęcia (27). Biorąc pod uwagę tę złożoność, nie dziwi fakt, że przetwarzanie pasz naraża ziarno na działanie różnych czynników środowiskowych zanim dotrze ono do młyna paszowego, w trakcie mielenia, a następnie podczas transportu i karmienia w mieszankach paszowych (9, 21, 28). W związku z tym na przestrzeni lat w paszach zidentyfikowano bardzo zróżnicowaną grupę mikroorganizmów, obejmującą nie tylko bakterie, ale także bakteriofagi, grzyby i drożdże (9, 21, 28–31). Niektóre z tych zanieczyszczeń, takie jak niektóre grzyby, mogą wytwarzać mykotoksyny, które stanowią zagrożenie dla zdrowia zwierząt (32–35).
Populacje bakteryjne mogą być stosunkowo zróżnicowane i zależą w pewnym stopniu od metod stosowanych do izolacji i identyfikacji mikroorganizmów, a także od źródła próbki. Na przykład profil składu mikrobiologicznego może się różnić przed obróbką cieplną związaną z peletyzacją (36). Chociaż klasyczne metody hodowli i posiewu płytkowego dostarczyły pewnych informacji, niedawne zastosowanie metody sekwencjonowania nowej generacji (NGS) opartej na genie 16S rRNA umożliwiło bardziej kompleksową ocenę społeczności mikrobiomu paszowego (9). Kiedy Solanki i in. (37) zbadali mikrobiom bakteryjny ziaren pszenicy przechowywanych przez pewien czas w obecności fosfiny, fumigantu zwalczającego owady, stwierdzili, że mikrobiom był bardziej zróżnicowany po zbiorach i po 3 miesiącach przechowywania. Ponadto Solanki i in. (37) (37) wykazali, że Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes i Planctomyces to dominujące typy bakterii w ziarnach pszenicy, Bacillus, Erwinia i Pseudomonas to dominujące rodzaje, a Enterobacteriaceae stanowią niewielką część. Na podstawie porównań taksonomicznych doszli do wniosku, że fumigacja fosfiną znacząco zmienia populacje bakterii, ale nie wpływa na różnorodność grzybów.
Solanki i in. (37) wykazali, że źródła pasz mogą również zawierać patogeny przenoszone przez żywność, które mogą powodować problemy ze zdrowiem publicznym, na podstawie wykrycia Enterobacteriaceae w mikrobiomie. Patogeny przenoszone przez żywność, takie jak Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Salmonella, Campylobacter, Escherichia coli O157:H7 i Listeria monocytogenes, były powiązane z paszami dla zwierząt i kiszonkami (9, 31, 38). Trwałość innych patogenów przenoszonych przez żywność w paszach dla zwierząt i drobiu jest obecnie nieznana. Ge i in. (39) przebadali ponad 200 składników pasz dla zwierząt i wyizolowali Salmonellę, E. coli i Enterococci, ale nie wykryli E. coli O157:H7 ani Campylobacter. Jednakże matryce takie jak sucha pasza mogą stanowić źródło patogennej E. coli. W celu ustalenia źródła epidemii Escherichia coli (STEC) produkującej toksynę Shiga (STEC) w 2016 roku, związanej z chorobami u ludzi, Crowe i in. (40) wykorzystali sekwencjonowanie całego genomu do porównania izolatów klinicznych z izolatami uzyskanymi z produktów spożywczych. Na podstawie tego porównania doszli do wniosku, że prawdopodobnym źródłem była mąka pszenna surowa o niskiej wilgotności z młynów. Niska zawartość wilgoci w mące pszennej sugeruje, że STEC mogą przetrwać również w paszy dla zwierząt o niskiej wilgotności. Jednakże, jak zauważają Crowe i in. (40), izolacja STEC z próbek mąki jest trudna i wymaga metod separacji immunomagnetycznej w celu odzyskania wystarczającej liczby komórek bakteryjnych. Podobne procesy diagnostyczne mogą również komplikować wykrywanie i izolację rzadkich patogenów przenoszonych przez żywność w paszy dla zwierząt. Trudności w wykrywaniu mogą również wynikać z długiego utrzymywania się tych patogenów w matrycach o niskiej wilgotności. Forghani i in. (41) wykazano, że mąka pszenna przechowywana w temperaturze pokojowej i zaszczepiona mieszaniną serogrup Escherichia coli (EHEC) enterokrwotocznych O45, O121 i O145 oraz Salmonelli (S. Typhimurium, S. Agona, S. Enteritidis i S. Anatum) była możliwa do zmierzenia po 84 i 112 dniach i nadal wykrywalna po 24 i 52 tygodniach.
Historycznie rzecz biorąc, Campylobacter nigdy nie został wyizolowany z paszy dla zwierząt i drobiu tradycyjnymi metodami hodowli (38, 39), chociaż Campylobacter można łatwo wyizolować z przewodu pokarmowego drobiu i produktów drobiowych (42, 43). Pasza nadal ma jednak swoje zalety jako potencjalne źródło. Na przykład Alves i in. (44) wykazali, że zaszczepienie paszy dla tuczonych kurcząt bakterią C. jejuni, a następnie przechowywanie jej w dwóch różnych temperaturach przez 3 lub 5 dni skutkowało odzyskaniem żywych bakterii C. jejuni, a w niektórych przypadkach nawet ich proliferacją. Doszli do wniosku, że C. jejuni z pewnością może przetrwać w paszy dla drobiu i dlatego może być potencjalnym źródłem zakażenia dla kurcząt.
Zanieczyszczenie pasz dla zwierząt i drobiu Salmonellą wzbudziło w przeszłości wiele uwagi i nadal stanowi przedmiot trwających wysiłków zmierzających do opracowania metod wykrywania mających zastosowanie konkretnie do pasz oraz do znalezienia skuteczniejszych środków kontroli (12, 26, 30, 45–53). Na przestrzeni lat przeprowadzono wiele badań dotyczących izolacji i charakterystyki Salmonelli w różnych zakładach paszowych i młynach paszowych (38, 39, 54–61). Ogólnie rzecz biorąc, badania te wskazują, że Salmonellę można izolować z różnych składników pasz, źródeł pasz, rodzajów pasz i operacji produkcji pasz. Wskaźniki częstości występowania i dominujące wyizolowane serotypy Salmonelli również były zróżnicowane. Na przykład Li i in. (57) potwierdzili obecność Salmonelli spp. Wykryto ją w 12,5% z 2058 próbek pobranych z kompletnych pasz dla zwierząt, składników pasz, karm dla zwierząt domowych, przysmaków dla zwierząt domowych i suplementów dla zwierząt domowych w okresie gromadzenia danych od 2002 do 2009 roku. Ponadto, najpowszechniejsze serotypy wykryte w 12,5% próbek Salmonelli, które dały wynik pozytywny, to S. Senftenberg i S. Montevideo (57). W badaniu żywności gotowej do spożycia i produktów ubocznych pasz dla zwierząt w Teksasie, Hsieh i in. (58) podali, że najwyższą częstość występowania Salmonelli odnotowano w mączce rybnej, a następnie w białkach zwierzęcych, przy czym S. Mbanka i S. Montevideo były najpowszechniejszymi serotypami. Młyny paszowe również stanowią kilka potencjalnych punktów zanieczyszczenia paszy podczas mieszania i dodawania składników (9, 56, 61). Magossi i in. (61) byli w stanie wykazać, że podczas produkcji paszy w Stanach Zjednoczonych może wystąpić wiele punktów zanieczyszczenia. W rzeczywistości Magossi i in. (61) znaleźli co najmniej jedną dodatnią hodowlę Salmonelli w 11 młynach paszowych (łącznie 12 miejsc pobierania próbek) w ośmiu stanach w Stanach Zjednoczonych. Biorąc pod uwagę potencjalne ryzyko skażenia Salmonellą podczas obchodzenia się z paszą, jej transportu i codziennego karmienia, nie dziwi fakt, że podejmowane są znaczne wysiłki mające na celu opracowanie dodatków paszowych, które mogą ograniczyć i utrzymać niski poziom skażenia mikrobiologicznego w całym cyklu produkcji zwierzęcej.
Niewiele wiadomo o mechanizmie specyficznej odpowiedzi Salmonelli na kwas mrówkowy. Jednakże Huang i in. (62) wskazali, że kwas mrówkowy występuje w jelicie cienkim ssaków i że Salmonella spp. są zdolne do produkcji kwasu mrówkowego. Huang i in. (62) użyli serii mutantów delecyjnych kluczowych szlaków do wykrycia ekspresji genów wirulencji Salmonelli i odkryli, że mrówczan może działać jako dyfuzyjny sygnał, aby wywołać Salmonellę do inwazji komórek nabłonkowych Hep-2. Niedawno Liu i in. (63) wyizolowali transporter mrówczanu, FocA, z Salmonella typhimurium, który działa jako specyficzny kanał mrówczanowy przy pH 7,0, ale może również działać jako pasywny kanał eksportowy przy wysokim zewnętrznym pH lub jako drugorzędny aktywny kanał importu mrówczanu/jonów wodorowych przy niskim pH. Jednak badanie to przeprowadzono tylko na jednym serotypie S. Typhimurium. Pozostaje pytanie, czy wszystkie serotypy reagują na kwas mrówkowy za pomocą podobnych mechanizmów. Pozostaje to kluczowym pytaniem badawczym, które powinno zostać poruszone w przyszłych badaniach. Niezależnie od wyników, nadal rozsądne jest stosowanie wielu serotypów Salmonelli, a nawet wielu szczepów każdego serotypu, w eksperymentach przesiewowych podczas opracowywania ogólnych zaleceń dotyczących stosowania suplementów kwasowych w celu obniżenia poziomu Salmonelli w paszy. Nowsze podejścia, takie jak wykorzystanie genetycznego kodowania kreskowego do kodowania szczepów w celu rozróżnienia podgrup tego samego serotypu (9, 64), dają możliwość wykrycia drobniejszych różnic, które mogą wpłynąć na wnioski i interpretację różnic.
Istotna może być również natura chemiczna i forma dysocjacji mrówczanu. W serii badań Beyer i in. (65–67) wykazali, że hamowanie Enterococcus faecium, Campylobacter jejuni i Campylobacter coli było skorelowane z ilością zdysocjowanego kwasu mrówkowego i było niezależne od pH lub niezdysocjowanego kwasu mrówkowego. Istotna wydaje się również forma chemiczna mrówczanu, na którą narażone są bakterie. Kovanda i in. (68) przebadali kilka organizmów Gram-ujemnych i Gram-dodatnich i porównali minimalne stężenia hamujące (MIC) mrówczanu sodu (500–25 000 mg/l) oraz mieszaninę mrówczanu sodu i wolnego mrówczanu (40/60 m/v; 10–10 000 mg/l). Na podstawie wartości MIC stwierdzono, że mrówczan sodu hamował wzrost jedynie Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Streptococcus suis i Streptococcus pneumoniae, ale nie Escherichia coli, Salmonella typhimurium ani Enterococcus faecalis. Natomiast mieszanina mrówczanu sodu i wolnego mrówczanu sodu hamowała wzrost wszystkich mikroorganizmów, co doprowadziło autorów do wniosku, że wolny kwas mrówkowy posiada większość właściwości przeciwdrobnoustrojowych. Interesujące byłoby zbadanie różnych proporcji tych dwóch form chemicznych w celu ustalenia, czy zakres wartości MIC koreluje z poziomem kwasu mrówkowego w mieszance i reakcją na 100% kwas mrówkowy.
Gomez-Garcia i in. (69) przetestowali kombinacje olejków eterycznych i kwasów organicznych (takich jak kwas mrówkowy) na wielu izolatach Escherichia coli, Salmonelli i Clostridium perfringens uzyskanych od świń. Przetestowali skuteczność sześciu kwasów organicznych, w tym kwasu mrówkowego, i sześciu olejków eterycznych na izolatach świńskich, stosując formaldehyd jako kontrolę pozytywną. Gomez-García i in. (69) określili wartości MIC50, MBC50 i MIC50/MBC50 kwasu mrówkowego na Escherichia coli (600 i 2400 ppm, 4), Salmonelli (600 i 2400 ppm, 4) i Clostridium perfringens (1200 i 2400 ppm, 2), spośród których kwas mrówkowy okazał się skuteczniejszy niż wszystkie kwasy organiczne na E. coli i Salmonellę. (69) Kwas mrówkowy jest skuteczny przeciwko Escherichia coli i Salmonelli ze względu na małą masę cząsteczkową i długi łańcuch (70).
Beyer i in. przebadali szczepy Campylobacter wyizolowane od świń (66) oraz szczepy Campylobacter jejuni wyizolowane od drobiu (67) i wykazali, że kwas mrówkowy dysocjuje w stężeniach zgodnych z odpowiedziami MIC zmierzonymi dla innych kwasów organicznych. Jednakże względne potencjały tych kwasów, w tym kwasu mrówkowego, zostały zakwestionowane, ponieważ Campylobacter może wykorzystywać te kwasy jako substraty (66, 67). Wykorzystanie kwasów przez C. jejuni nie jest zaskakujące, ponieważ wykazano, że ma ona metabolizm nieglikolityczny. Zatem C. jejuni ma ograniczoną zdolność do katabolizmu węglowodanów i opiera się na glukoneogenezie z aminokwasów i kwasów organicznych w większości swojego metabolizmu energetycznego i aktywności biosyntezy (71, 72). Wczesne badanie przeprowadzone przez Line i in. (73) wykorzystali macierz fenotypową zawierającą 190 źródeł węgla i wykazali, że C. jejuni 11168(GS) może wykorzystywać kwasy organiczne jako źródła węgla, z których większość to produkty pośrednie cyklu kwasów trikarboksylowych. Dalsze badania Wagli i in. (74) z wykorzystaniem macierzy fenotypowej wykorzystania węgla wykazały, że szczepy C. jejuni i E. coli badane w ich badaniu są zdolne do wzrostu na kwasach organicznych jako źródle węgla. Mrówczan jest głównym donorem elektronów w metabolizmie energii oddechowej C. jejuni, a zatem głównym źródłem energii dla C. jejuni (71, 75). C. jejuni jest w stanie wykorzystywać mrówczan jako donor wodoru poprzez związany z błoną kompleks dehydrogenazy mrówczanowej, który utlenia mrówczan do dwutlenku węgla, protonów i elektronów i służy jako donor elektronów w oddychaniu (72).
Kwas mrówkowy ma długą historię stosowania jako środek poprawiający właściwości paszy o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, ale niektóre owady mogą również wytwarzać kwas mrówkowy do stosowania jako środek chemiczny obronny przed drobnoustrojami. Rossini i in. (76) zasugerowali, że kwas mrówkowy może być składnikiem kwaśnego soku mrówek opisanego przez Raya (77) prawie 350 lat temu. Od tego czasu nasza wiedza na temat produkcji kwasu mrówkowego u mrówek i innych owadów znacznie się poszerzyła i obecnie wiadomo, że proces ten jest częścią złożonego systemu obrony przed toksynami u owadów (78). Wiadomo, że różne grupy owadów, w tym pszczoły bezżądłe, mrówki ostroskrzydłe (Hymenoptera: Apidae), chrząszcze biegacze (Galerita lecontei i G. janus), mrówki bezżądłe (Formicinae) i niektóre larwy motyli (Lepidoptera: Myrmecophaga), wytwarzają kwas mrówkowy jako środek chemiczny obronny (76, 78–82).
Mrówki są prawdopodobnie najlepiej scharakteryzowane, ponieważ posiadają acidocyty – wyspecjalizowane otwory, które pozwalają im rozpylać jad składający się głównie z kwasu mrówkowego (82). Mrówki wykorzystują serynę jako prekursor i magazynują duże ilości mrówczanu w swoich gruczołach jadowych, które są wystarczająco izolowane, aby chronić mrówki żywicielki przed cytotoksycznością mrówczanu do momentu jego rozpylenia (78, 83). Wydzielany przez nie kwas mrówkowy może (1) służyć jako feromon alarmowy, przyciągający inne mrówki; (2) być substancją chemiczną obronną przed konkurentami i drapieżnikami; oraz (3) działać jako środek przeciwgrzybiczy i przeciwbakteryjny w połączeniu z żywicą stanowiącą część materiału gniazda (78, 82, 84–88). Kwas mrówkowy wytwarzany przez mrówki ma właściwości przeciwdrobnoustrojowe, co sugeruje, że mógłby być stosowany jako dodatek do stosowania miejscowego. Wykazali to Bruch i in. (88), którzy dodali syntetyczny kwas mrówkowy do żywicy i znacząco poprawili działanie przeciwgrzybicze. Dalszym dowodem skuteczności kwasu mrówkowego i jego przydatności biologicznej jest fakt, że mrówkojady olbrzymie, które nie potrafią wytwarzać kwasu żołądkowego, zjadają mrówki zawierające kwas mrówkowy, aby zapewnić sobie stężony kwas mrówkowy jako alternatywny kwas trawienny (89).
Praktyczne zastosowanie kwasu mrówkowego w rolnictwie jest rozważane i badane od wielu lat. W szczególności kwas mrówkowy może być stosowany jako dodatek do pasz i kiszonek. Mrówczan sodu, zarówno w postaci stałej, jak i płynnej, jest uważany za bezpieczny dla wszystkich gatunków zwierząt, konsumentów i środowiska (90). Na podstawie ich oceny (90), maksymalne stężenie 10 000 mg ekwiwalentu kwasu mrówkowego/kg paszy uznano za bezpieczne dla wszystkich gatunków zwierząt, podczas gdy maksymalne stężenie 12 000 mg ekwiwalentu kwasu mrówkowego/kg paszy uznano za bezpieczne dla świń. Zastosowanie kwasu mrówkowego jako polepszacza paszy dla zwierząt jest badane od wielu lat. Uważa się, że ma on wartość komercyjną jako środek konserwujący kiszonki i środek przeciwdrobnoustrojowy w paszach dla zwierząt i drobiu.
Dodatki chemiczne, takie jak kwasy, zawsze stanowiły integralny element produkcji kiszonki i zarządzania paszą (91, 92). Borreani i in. (91) zauważyli, że aby osiągnąć optymalną produkcję wysokiej jakości kiszonki, konieczne jest utrzymanie jakości paszy przy jednoczesnym zachowaniu jak największej ilości suchej masy. Rezultatem takiej optymalizacji jest minimalizacja strat na wszystkich etapach procesu kiszenia: od początkowych warunków tlenowych w silosie, poprzez późniejszą fermentację, magazynowanie, aż po ponowne otwarcie silosu w celu zakiszenia. Konkretne metody optymalizacji produkcji kiszonki polowej i jej późniejszej fermentacji zostały szczegółowo omówione w innym miejscu (91, 93-95) i nie będą tutaj szczegółowo omawiane. Głównym problemem jest degradacja oksydacyjna powodowana przez drożdże i pleśnie, gdy w kiszonce obecny jest tlen (91, 92). Dlatego wprowadzono szczepionki biologiczne i dodatki chemiczne, aby przeciwdziałać niekorzystnym skutkom psucia się kiszonki (91, 92). Inne kwestie, które należy brać pod uwagę przy dodatkach do kiszonek, obejmują ograniczenie rozprzestrzeniania się patogenów, które mogą być obecne w kiszonce (np. patogennej E. coli, Listerii i Salmonelli), a także grzybów wytwarzających mykotoksyny (96–98).
Mack i in. (92) podzielili dodatki kwaśne na dwie kategorie. Kwasy takie jak propionowy, octowy, sorbowy i benzoesowy utrzymują stabilność tlenową kiszonki podawanej przeżuwaczom poprzez ograniczenie wzrostu drożdży i pleśni (92). Mack i in. (92) oddzielili kwas mrówkowy od innych kwasów i uznali go za bezpośredni zakwaszacz, który hamuje rozwój Clostridium i mikroorganizmów powodujących psucie się paszy, jednocześnie zachowując integralność białka kiszonki. W praktyce ich formy soli są najpowszechniejszymi formami chemicznymi, co pozwala uniknąć korozyjnych właściwości kwasów w formie niesolnej (91). Wiele grup badawczych badało również kwas mrówkowy jako dodatek kwaśny do kiszonek. Kwas mrówkowy znany jest ze swojego szybkiego potencjału zakwaszającego i hamującego wpływu na wzrost szkodliwych mikroorganizmów kiszonkowych, które zmniejszają zawartość białka i rozpuszczalnych w wodzie węglowodanów w kiszonce (99). Dlatego He i in. (92) porównali kwas mrówkowy z dodatkami kwaśnymi w kiszonkach. (100) wykazali, że kwas mrówkowy może hamować Escherichia coli i obniżać pH kiszonki. Kultury bakteryjne produkujące kwas mrówkowy i mlekowy dodawano również do kiszonki w celu stymulacji zakwaszania i produkcji kwasów organicznych (101). W rzeczywistości Cooley i in. (101) stwierdzili, że po zakwaszeniu kiszonki 3% (w/v) kwasem mrówkowym produkcja kwasu mlekowego i mrówkowego przekroczyła odpowiednio 800 i 1000 mg kwasu organicznego/100 g próbki. Mack i in. (92) szczegółowo przeanalizowali literaturę naukową dotyczącą dodatków do kiszonek, w tym badania opublikowane od 2000 r., które koncentrowały się na kwasie mrówkowym i innych kwasach i/lub je obejmowały. Dlatego niniejszy przegląd nie będzie szczegółowo omawiał poszczególnych badań, a jedynie podsumuje kilka kluczowych punktów dotyczących skuteczności kwasu mrówkowego jako chemicznego dodatku do kiszonek. Badano zarówno niebuforowany, jak i buforowany kwas mrówkowy, a w większości przypadków Clostridium spp. Jego względne aktywności (pobieranie węglowodanów, białka i mleczanu oraz wydalanie maślanu) mają tendencję do spadku, podczas gdy produkcja amoniaku i maślanu spada, a retencja suchej masy wzrasta (92). Istnieją ograniczenia dotyczące skuteczności kwasu mrówkowego, ale jego zastosowanie jako dodatku do kiszonek w połączeniu z innymi kwasami wydaje się przezwyciężać niektóre z tych problemów (92).
Kwas mrówkowy może hamować rozwój bakterii chorobotwórczych stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzkiego. Na przykład Pauly i Tam (102) zaszczepili małe silosy laboratoryjne L. monocytogenes zawierającymi trzy różne poziomy suchej masy (200, 430 i 540 g/kg) życicy, a następnie uzupełnili kwasem mrówkowym (3 ml/kg) lub bakteriami kwasu mlekowego (8 × 105/g) i enzymami celulolitycznymi. Zgłosili, że oba zabiegi zmniejszyły L. monocytogenes do poziomów niewykrywalnych w kiszonce o niskiej zawartości suchej masy (200 g/kg). Jednakże w kiszonce o średniej zawartości suchej masy (430 g/kg), L. monocytogenes była nadal wykrywalna po 30 dniach w kiszonce traktowanej kwasem mrówkowym. Redukcja L. monocytogenes wydawała się być związana z niższym pH, kwasem mlekowym i połączonymi niezdysocjowanymi kwasami. Na przykład Pauly i Tam (102) zauważyli, że szczególnie ważne były poziomy kwasu mlekowego i połączonych niezdysocjowanych kwasów, co może być powodem, dla którego nie zaobserwowano redukcji L. monocytogenes w pożywkach traktowanych kwasem mrówkowym z kiszonek o wyższej zawartości suchej masy. Podobne badania powinny zostać przeprowadzone w przyszłości dla innych powszechnych patogenów kiszonek, takich jak Salmonella i patogenna E. coli. Bardziej kompleksowa analiza sekwencji 16S rDNA całej społeczności mikroorganizmów kiszonkowych może również pomóc w identyfikacji zmian w ogólnej populacji mikroorganizmów kiszonkowych, które zachodzą na różnych etapach fermentacji kiszonki w obecności kwasu mrówkowego (103). Uzyskanie danych dotyczących mikrobiomu może zapewnić wsparcie analityczne dla lepszego przewidywania postępu fermentacji kiszonek i opracowania optymalnych kombinacji dodatków w celu utrzymania wysokiej jakości kiszonki.
W paszach dla zwierząt na bazie zbóż kwas mrówkowy jest stosowany jako środek przeciwdrobnoustrojowy w celu ograniczenia poziomu patogenów w różnych matrycach paszowych pochodzących ze zbóż, a także w niektórych składnikach paszowych, takich jak produkty uboczne pochodzenia zwierzęcego. Wpływ na populacje patogenów u drobiu i innych zwierząt można ogólnie podzielić na dwie kategorie: bezpośredni wpływ na populację patogenów w samej paszy oraz pośredni wpływ na patogeny kolonizujące przewód pokarmowy zwierząt po spożyciu paszy poddanej działaniu preparatu (20, 21, 104). Oczywiste jest, że te dwie kategorie są ze sobą powiązane, ponieważ redukcja liczby patogenów w paszy powinna skutkować redukcją kolonizacji po spożyciu paszy przez zwierzę. Jednak na właściwości przeciwdrobnoustrojowe konkretnego kwasu dodanego do matrycy paszowej może wpływać kilka czynników, takich jak skład paszy i forma, w jakiej kwas jest dodawany (21, 105).
Historycznie, stosowanie kwasu mrówkowego i innych pokrewnych kwasów koncentrowało się przede wszystkim na bezpośredniej kontroli Salmonelli w paszach dla zwierząt i drobiu (21). Wyniki tych badań zostały szczegółowo podsumowane w kilku przeglądach opublikowanych w różnym czasie (18, 21, 26, 47, 104–106), dlatego w niniejszym przeglądzie omówiono tylko niektóre z kluczowych ustaleń z tych badań. Kilka badań wykazało, że aktywność przeciwdrobnoustrojowa kwasu mrówkowego w matrycach paszowych zależy od dawki i czasu ekspozycji na kwas mrówkowy, zawartości wilgoci w matrycy paszowej oraz stężenia bakterii w paszy i przewodzie pokarmowym zwierzęcia (19, 21, 107–109). Rodzaj matrycy paszowej i źródło składników paszy dla zwierząt również mają wpływ na te czynniki. Tak więc, wiele badań wykazało, że poziomy toksyn bakteryjnych Salmonella izolowanych z produktów ubocznych pochodzenia zwierzęcego mogą różnić się od tych izolowanych z produktów ubocznych pochodzenia roślinnego (39, 45, 58, 59, 110–112). Jednakże różnice w reakcji na kwasy, takie jak kwas mrówkowy, mogą być związane z różnicami w przeżywalności serowarów w diecie i temperaturą, w której dieta jest przetwarzana (19, 113, 114). Różnice w odpowiedzi serowarów na traktowanie kwasem mogą być również czynnikiem skażenia drobiu zanieczyszczoną paszą (113, 115), a różnice w ekspresji genów wirulencji (116) mogą również odgrywać rolę. Różnice w tolerancji na kwas mogą z kolei wpływać na wykrywanie Salmonella w pożywkach hodowlanych, jeśli kwasy przenoszone przez paszę nie są odpowiednio buforowane (21, 105, 117–122). Forma fizyczna diety (pod względem wielkości cząsteczek) może również wpływać na względną dostępność kwasu mrówkowego w przewodzie pokarmowym (123).
Kluczowe znaczenie mają również strategie optymalizacji aktywności przeciwdrobnoustrojowej kwasu mrówkowego dodawanego do paszy. Sugerowano wyższe stężenia kwasu w przypadku składników pasz o wysokim stopniu zanieczyszczenia przed mieszaniem, aby zminimalizować potencjalne uszkodzenia urządzeń w młynie paszowym i problemy ze smakowitością paszy (105). Jones (51) stwierdził, że Salmonella obecna w paszy przed czyszczeniem chemicznym jest trudniejsza do zwalczania niż Salmonella w kontakcie z paszą po obróbce chemicznej. Sugerowano, aby obróbka termiczna paszy podczas przetwarzania w młynie paszowym była interwencją mającą na celu ograniczenie zanieczyszczenia paszy Salmonellą, ale zależy to od składu paszy, wielkości cząstek i innych czynników związanych z procesem mielenia (51). Aktywność przeciwdrobnoustrojowa kwasów jest również zależna od temperatury, a podwyższone temperatury w obecności kwasów organicznych mogą mieć synergistyczny efekt hamujący na Salmonellę, co zaobserwowano w przypadku płynnych kultur Salmonelli (124, 125). Kilka badań dotyczących pasz zanieczyszczonych Salmonellą potwierdza tezę, że podwyższone temperatury zwiększają skuteczność kwasów w matrycy paszowej (106, 113, 126). Amado i in. (127) zastosowali centralny układ złożony do badania interakcji temperatury i kwasu (mrówkowego lub mlekowego) u 10 szczepów Salmonella enterica i Escherichia coli wyizolowanych z różnych pasz dla bydła i zaszczepionych w zakwaszonych peletach dla bydła. Stwierdzili, że ciepło było dominującym czynnikiem wpływającym na redukcję drobnoustrojów, obok kwasu i rodzaju izolatu bakteryjnego. Nadal dominuje efekt synergistyczny z kwasem, dlatego można stosować niższe temperatury i stężenia kwasu. Zauważyli jednak również, że efekty synergistyczne nie zawsze były obserwowane w przypadku stosowania kwasu mrówkowego, co doprowadziło ich do podejrzenia, że ​​czynnikiem tym było ulatnianie się kwasu mrówkowego w wyższych temperaturach lub buforujące działanie składników matrycy paszy.
Ograniczenie okresu przydatności paszy przed podaniem jej zwierzętom jest jednym ze sposobów kontroli wprowadzania patogenów przenoszonych przez żywność do organizmu zwierzęcia podczas karmienia. Jednakże, gdy kwas zawarty w paszy dostanie się do przewodu pokarmowego, może on nadal wywierać działanie przeciwdrobnoustrojowe. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa egzogennie podawanych substancji kwaśnych w przewodzie pokarmowym może zależeć od wielu czynników, w tym od stężenia kwasu żołądkowego, miejsca aktywnego w przewodzie pokarmowym, pH i zawartości tlenu w przewodzie pokarmowym, wieku zwierzęcia oraz względnego składu populacji drobnoustrojów przewodu pokarmowego (który zależy od umiejscowienia przewodu pokarmowego i dojrzałości zwierzęcia) (21, 24, 128–132). Ponadto stała populacja mikroorganizmów beztlenowych w przewodzie pokarmowym (która staje się dominująca w dolnym odcinku przewodu pokarmowego zwierząt monogastrycznych w miarę ich dojrzewania) aktywnie produkuje kwasy organiczne poprzez fermentację, co z kolei może mieć również antagonistyczny wpływ na przejściowe patogeny przedostające się do przewodu pokarmowego (17, 19–21).
Wiele wczesnych badań koncentrowało się na stosowaniu kwasów organicznych, w tym mrówczanu, w celu ograniczenia Salmonelli w przewodzie pokarmowym drobiu, co zostało szczegółowo omówione w kilku pracach przeglądowych (12, 20, 21). Łącząc te badania, można poczynić kilka kluczowych obserwacji. McHan i Shotts (133) donieśli, że podawanie kwasu mrówkowego i propionowego zmniejszyło poziom Salmonelli Typhimurium w jelicie ślepym kurczaków zaszczepionych bakteriami i oznaczyli je ilościowo w wieku 7, 14 i 21 dni. Jednakże, gdy Hume i in. (128) monitorowali propionian znakowany C-14, doszli do wniosku, że bardzo mała ilość propionianu w diecie może dotrzeć do jelita ślepego. Pozostaje do ustalenia, czy dotyczy to również kwasu mrówkowego. Jednak ostatnio Bourassa i in. (134) podali, że podawanie kwasu mrówkowego i propionowego zmniejszyło poziom bakterii Salmonella Typhimurium w jelicie ślepym kurczaków zaszczepionych bakteriami, co zostało określone ilościowo w 7., 14. i 21. dniu życia. (132) zauważyli, że podawanie kurczakom brojlerom kwasu mrówkowego w dawce 4 g/t w 6-tygodniowym okresie wzrostu zmniejszyło stężenie bakterii S. Typhimurium w jelicie ślepym poniżej poziomu wykrywalności.
Obecność kwasu mrówkowego w diecie może mieć wpływ na inne części przewodu pokarmowego drobiu. Al-Tarazi i Alshavabkeh (134) wykazali, że mieszanina kwasu mrówkowego i propionowego może zmniejszyć zanieczyszczenie wola i jelita ślepego Salmonella pullorum (S. PRlorum). Thompson i Hinton (129) zaobserwowali, że komercyjnie dostępna mieszanina kwasu mrówkowego i propionowego zwiększała stężenie obu kwasów w wolu i żołądku oraz była bakteriobójcza wobec Salmonella Enteritidis PT4 w modelu in vitro w reprezentatywnych warunkach chowu. Pogląd ten potwierdzają dane in vivo uzyskane przez Bird i in. (135), którzy dodawali kwas mrówkowy do wody pitnej kurczaków brojlerów podczas symulowanego okresu postu przed wysyłką, podobnego do okresu postu, któremu poddawane są kurczaki brojlery przed transportem do zakładu przetwórstwa drobiu. Dodatek kwasu mrówkowego do wody pitnej spowodował zmniejszenie liczby bakterii S. Typhimurium w wolu i najądrzu oraz zmniejszenie częstości występowania wołów z obecnością bakterii S. Typhimurium, ale nie liczby najądrzy z obecnością bakterii (135). Opracowanie systemów dostarczania, które mogą chronić kwasy organiczne podczas ich aktywności w dolnym odcinku przewodu pokarmowego, może pomóc w zwiększeniu skuteczności. Na przykład wykazano, że mikrokapsułkowanie kwasu mrówkowego i jego dodanie do paszy zmniejsza liczbę bakterii Salmonella Enteritidis w treści jelita ślepego (136). Może to jednak różnić się w zależności od gatunku zwierzęcia. Na przykład Walia i in. (137) nie zaobserwowano zmniejszenia ilości Salmonelli w jelicie ślepym lub węzłach chłonnych 28-dniowych świń karmionych mieszanką kwasu mrówkowego, kwasu cytrynowego i kapsułek z olejkiem eterycznym, a chociaż wydalanie Salmonelli w kale zmniejszyło się 14. dnia, nie zmniejszyło się ono 28. dnia. Wykazano, że zapobiegano poziomemu przenoszeniu Salmonelli między świniami.
Chociaż badania nad kwasem mrówkowym jako środkiem przeciwdrobnoustrojowym w hodowli zwierząt koncentrowały się głównie na Salmonelli przenoszonej przez żywność, istnieją również badania ukierunkowane na inne patogeny przewodu pokarmowego. Badania in vitro przeprowadzone przez Kovandę i in. (68) sugerują, że kwas mrówkowy może być również skuteczny przeciwko innym patogenom przewodu pokarmowego przenoszonym przez żywność, w tym Escherichia coli i Campylobacter jejuni. Wcześniejsze badania wykazały, że kwasy organiczne (np. kwas mlekowy) i komercyjne mieszanki zawierające kwas mrówkowy jako składnik mogą redukować poziom Campylobacter u drobiu (135, 138). Jednakże, jak zauważyli wcześniej Beyer i in. (67), stosowanie kwasu mrówkowego jako środka przeciwdrobnoustrojowego przeciwko Campylobacter może wymagać ostrożności. Odkrycie to jest szczególnie problematyczne w przypadku suplementacji diety u drobiu, ponieważ kwas mrówkowy jest głównym źródłem energii oddechowej dla C. jejuni. Ponadto uważa się, że część jej niszy żołądkowo-jelitowej wynika z metabolicznego krzyżowego karmienia z mieszanymi produktami fermentacji kwasowej wytwarzanymi przez bakterie przewodu pokarmowego, takimi jak mrówczan (139). Pogląd ten ma pewne podstawy. Ponieważ mrówczan jest chemoatraktantem dla C. jejuni, podwójne mutanty z defektami zarówno dehydrogenazy mrówczanowej, jak i hydrogenazy wykazują niższe wskaźniki kolonizacji jelita ślepego u kurcząt brojlerów w porównaniu ze szczepami C. jejuni typu dzikiego (140, 141). Nadal nie jest jasne, w jakim stopniu zewnętrzna suplementacja kwasem mrówkowym wpływa na kolonizację przewodu pokarmowego przez C. jejuni u kurcząt. Rzeczywiste stężenia mrówczanu w przewodzie pokarmowym mogą być niższe ze względu na katabolizm mrówczanu przez inne bakterie przewodu pokarmowego lub wchłanianie mrówczanu w górnym odcinku przewodu pokarmowego, więc na to może wpływać kilka zmiennych. Ponadto mrówczan jest potencjalnym produktem fermentacji wytwarzanym przez niektóre bakterie przewodu pokarmowego, co może wpływać na całkowity poziom mrówczanu w przewodzie pokarmowym. Kwantyfikacja mrówczanu w treści przewodu pokarmowego i identyfikacja genów dehydrogenazy mrówczanowej za pomocą metagenomiki mogą rzucić światło na niektóre aspekty ekologii mikroorganizmów produkujących mrówczan.
Roth i wsp. (142) porównali wpływ podawania brojlerom antybiotyku enrofloksacyny lub mieszaniny kwasów mrówkowego, octowego i propionowego na częstość występowania opornych na antybiotyki bakterii Escherichia coli. Całkowitą liczbę izolatów E. coli i opornych na antybiotyki zliczono w zbiorczych próbkach kału od 1-dniowych brojlerów oraz w próbkach zawartości jelita ślepego od 14- i 38-dniowych brojlerów. Oporność izolatów E. coli na ampicylinę, cefotaksym, cyprofloksacynę, streptomycynę, sulfametoksazol i tetracyklinę zbadano zgodnie z wcześniej ustalonymi punktami krytycznymi dla każdego antybiotyku. Po ilościowym oznaczeniu i scharakteryzowaniu poszczególnych populacji E. coli, ani enrofloksacyna, ani suplementacja koktajlem kwasów nie zmieniły całkowitej liczby E. coli wyizolowanych z jelita ślepego 17- i 28-dniowych kurcząt brojlerów. U ptaków karmionych dietą z dodatkiem enrofloksacyny stwierdzono wzrost liczby bakterii E. coli opornych na cyprofloksacynę, streptomycynę, sulfametoksazol i tetracyklinę oraz spadek liczby bakterii E. coli opornych na cefotaksym w jelicie ślepym. U ptaków karmionych koktajlem stwierdzono zmniejszenie liczby bakterii E. coli opornych na ampicylinę i tetracyklinę w jelicie ślepym w porównaniu z grupą kontrolną i ptakami suplementowanymi enrofloksacyną. U ptaków karmionych mieszanką kwasów zaobserwowano również zmniejszenie liczby bakterii E. coli opornych na cyprofloksacynę i sulfametoksazol w jelicie ślepym w porównaniu z ptakami karmionymi enrofloksacyną. Mechanizm, poprzez który kwasy zmniejszają liczbę opornych na antybiotyki bakterii E. coli bez redukcji całkowitej liczby tych bakterii, jest nadal niejasny. Jednakże wyniki badania Rotha i in. są zgodne z wynikami grupy enrofloksacyny. (142) Może to wskazywać na zmniejszone rozprzestrzenianie się genów oporności na antybiotyki u bakterii E. coli, takich jak inhibitory sprzężone z plazmidami opisane przez Cabezon i in. (143). Interesujące byłoby przeprowadzenie bardziej szczegółowej analizy oporności na antybiotyki zależnej od plazmidów w populacji przewodu pokarmowego drobiu w obecności dodatków paszowych, takich jak kwas mrówkowy, oraz dalsze udoskonalenie tej analizy poprzez ocenę rezystomu przewodu pokarmowego.
Opracowanie optymalnych dodatków paszowych o działaniu przeciwdrobnoustrojowym przeciwko patogenom powinno w idealnym przypadku mieć minimalny wpływ na ogólną florę przewodu pokarmowego, a w szczególności na mikrobiotę uważaną za korzystną dla gospodarza. Jednakże egzogennie podawane kwasy organiczne mogą mieć szkodliwy wpływ na rezydentną mikrobiotę przewodu pokarmowego i do pewnego stopnia zniwelować jej właściwości ochronne przed patogenami. Na przykład Thompson i Hinton (129) zaobserwowali obniżony poziom kwasu mlekowego w wolach u kur niosek karmionych mieszanką kwasu mrówkowego i propionowego, co sugeruje, że obecność tych egzogennych kwasów organicznych w wolach spowodowała redukcję bakterii kwasu mlekowego w wolach. Bakterie kwasu mlekowego w wolach są uważane za barierę dla Salmonelli, a zatem zaburzenie tej rezydentnej mikrobioty w wolach może być szkodliwe dla skutecznej redukcji kolonizacji przewodu pokarmowego przez Salmonellę (144). Açıkgöz i in. stwierdzili, że wpływ na dolny odcinek przewodu pokarmowego u ptaków może być mniejszy. (145) Nie stwierdzono różnic w całkowitej florze jelitowej ani w liczebności Escherichia coli u 42-dniowych brojlerów pijących wodę zakwaszoną kwasem mrówkowym. Autorzy sugerują, że może to wynikać z metabolizowania mrówczanu w górnym odcinku przewodu pokarmowego, co zaobserwowano u innych badaczy w przypadku egzogennie podawanych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) (128, 129).
Zabezpieczenie kwasu mrówkowego poprzez jakąś formę enkapsulacji może pomóc mu dotrzeć do dolnego odcinka przewodu pokarmowego. (146) zauważyli, że mikrokapsułkowany kwas mrówkowy znacząco zwiększył całkowitą zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) w jelicie ślepym świń w porównaniu ze świniami karmionymi niechronionym kwasem mrówkowym. Wynik ten skłonił autorów do sugestii, że kwas mrówkowy może skutecznie dotrzeć do dolnego odcinka przewodu pokarmowego, jeśli jest odpowiednio chroniony. Jednak kilka innych parametrów, takich jak stężenia mrówczanu i mleczanu, chociaż wyższe niż u świń karmionych dietą kontrolną, nie różniło się statystycznie od tych u świń karmionych niechronioną dietą mrówczanową. Chociaż świnie karmione zarówno niechronionym, jak i chronionym kwasem mrówkowym wykazały prawie trzykrotny wzrost kwasu mlekowego, liczba pałeczek kwasu mlekowego nie uległa zmianie pod wpływem żadnego z tych zabiegów. Różnice mogą być bardziej widoczne w przypadku innych mikroorganizmów wytwarzających kwas mlekowy w jelicie ślepym (1), których nie wykrywa się tymi metodami i/lub (2), których aktywność metaboliczna ulega zmianie, co zmienia wzorzec fermentacji w taki sposób, że rezydujące tam bakterie kwasu mlekowego produkują więcej kwasu mlekowego.
Aby dokładniej zbadać wpływ dodatków paszowych na przewód pokarmowy zwierząt gospodarskich, potrzebne są metody identyfikacji mikroorganizmów o wyższej rozdzielczości. W ciągu ostatnich kilku lat sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) genu 16S RNA zostało wykorzystane do identyfikacji taksonów mikrobiomu i porównania różnorodności społeczności mikroorganizmów (147), co pozwoliło na lepsze zrozumienie interakcji między dodatkami paszowymi a mikrobiotą przewodu pokarmowego zwierząt rzeźnych, takich jak drób.
W kilku badaniach wykorzystano sekwencjonowanie mikrobiomu do oceny reakcji mikrobiomu przewodu pokarmowego kurcząt na suplementację mrówczanem. Oakley i in. (148) przeprowadzili badanie na 42-dniowych kurczętach brojlerach, którym podawano różne kombinacje kwasu mrówkowego, propionowego i średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych w wodzie pitnej lub paszy. Zaszczepione kurczęta poddano prowokacji szczepem Salmonella typhimurium opornym na kwas nalidyksowy, a ich jelita ślepe pobrano w wieku 0, 7, 21 i 42 dni. Próbki jelita ślepego przygotowano do pirosekwencjonowania 454, a wyniki sekwencjonowania oceniono pod kątem klasyfikacji i porównania podobieństwa. Ogólnie rzecz biorąc, metody leczenia nie wpłynęły znacząco na mikrobiom jelita ślepego ani na poziom S. Typhimurium. Jednakże, ogólne wskaźniki wykrywania Salmonelli spadały wraz z wiekiem ptaków, co potwierdziła analiza taksonomiczna mikrobiomu, a względna liczebność sekwencji Salmonelli również malała z czasem. Autorzy zauważają, że wraz z wiekiem brojlerów wzrastała różnorodność populacji mikroorganizmów jelita ślepego, przy czym najistotniejsze zmiany we florze bakteryjnej przewodu pokarmowego zaobserwowano we wszystkich grupach poddanych leczeniu. W niedawnym badaniu Hu i in. (149) porównali wpływ picia wody i karmienia dietą uzupełnioną mieszanką kwasów organicznych (kwasu mrówkowego, kwasu octowego, kwasu propionowego i mrówczanu amonu) oraz wirginiamycyny na próbki mikrobiomu jelita ślepego od kurcząt brojlerów pobrane w dwóch etapach (1–21 dni i 22–42 dni). Chociaż zaobserwowano pewne różnice w różnorodności mikrobiomu jelita ślepego między grupami poddanymi leczeniu w wieku 21 dni, nie wykryto różnic w różnorodności bakterii α lub β w wieku 42 dni. Biorąc pod uwagę brak różnic w wieku 42 dni, autorzy postawili hipotezę, że przewaga wzrostowa może wynikać z wcześniejszego ukształtowania się optymalnie zróżnicowanego mikrobiomu.
Analiza mikrobiomu skupiająca się wyłącznie na społeczności mikroorganizmów jelita ślepego może nie odzwierciedlać miejsc w przewodzie pokarmowym, w których występuje najwięcej efektów kwasów organicznych w diecie. Mikrobiom górnego odcinka przewodu pokarmowego kurcząt brojlerów może być bardziej wrażliwy na działanie kwasów organicznych w diecie, co sugerują wyniki Hume i in. (128). Hume i in. (128) wykazali, że większość egzogennie dodanego propionianu wchłaniała się w górnym odcinku przewodu pokarmowego ptaków. Najnowsze badania nad charakterystyką mikroorganizmów przewodu pokarmowego również potwierdzają ten pogląd. Nava i in. (150) wykazali, że połączenie mieszaniny kwasów organicznych [kwasu DL-2-hydroksy-4(metylotio)masłowego], kwasu mrówkowego i kwasu propionowego (HFP) wpływało na mikrobiotę jelitową i zwiększało kolonizację Lactobacillus w jelicie krętym kurcząt. Niedawno Goodarzi Borojeni i in. (150) wykazano, że połączenie mieszaniny kwasów organicznych [kwasu DL-2-hydroksy-4(metylotio)masłowego], kwasu mrówkowego i kwasu propionowego (HFP) wpłynęło na mikroflorę jelitową i zwiększyło kolonizację Lactobacillus w jelicie krętym kurczaków. (151) badali karmienie kurczaków brojlerów mieszaniną kwasu mrówkowego i propionowego w dwóch stężeniach (0,75% i 1,50%) przez 35 dni. Pod koniec eksperymentu usunięto wole, żołądek, dystalne dwie trzecie jelita krętego i jelito ślepe i pobrano próbki do ilościowej analizy specyficznej flory przewodu pokarmowego i metabolitów przy użyciu RT-PCR. W hodowli stężenie kwasów organicznych nie wpłynęło na liczebność Lactobacillus lub Bifidobacterium, ale zwiększyło populację Clostridium. W jelicie krętym jedynymi zmianami był spadek Lactobacillus i Enterobacter, podczas gdy w jelicie ślepym flora ta pozostała niezmieniona (151). Przy najwyższym stężeniu suplementacji kwasami organicznymi, całkowite stężenie kwasu mlekowego (D i L) uległo obniżeniu w wolu, stężenie obu kwasów organicznych uległo obniżeniu w żołądku mięśniowym, a stężenie kwasów organicznych było niższe w jelicie ślepym. Nie zaobserwowano zmian w jelicie krętym. W odniesieniu do krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), jedyną zmianą w wolu i żołądku ptaków karmionych kwasami organicznymi był poziom propionianu. Ptaki karmione niższym stężeniem kwasu organicznego wykazywały prawie dziesięciokrotny wzrost propionianu w wolu, podczas gdy ptaki karmione dwoma stężeniami kwasu organicznego wykazywały odpowiednio ośmio- i piętnastokrotny wzrost propionianu w żołądku mięśniowym. Wzrost octanu w jelicie krętym był mniejszy niż dwukrotny. Ogólnie rzecz biorąc, dane te potwierdzają pogląd, że większość efektów zewnętrznego stosowania kwasów organicznych była widoczna w plonie, podczas gdy kwasy organiczne miały minimalny wpływ na mikroflorę dolnego odcinka przewodu pokarmowego, co sugeruje, że wzorce fermentacji flory bakteryjnej górnego odcinka przewodu pokarmowego mogły ulec zmianie.
Oczywiste jest, że dogłębniejsza charakterystyka mikrobiomu jest niezbędna, aby w pełni wyjaśnić reakcje mikroorganizmów na mrówczan w całym przewodzie pokarmowym. Bardziej szczegółowa analiza taksonomii mikroorganizmów w poszczególnych przedziałach przewodu pokarmowego, a w szczególności w górnych, takich jak wole, może dostarczyć dalszych informacji na temat selekcji określonych grup mikroorganizmów. Ich aktywność metaboliczna i enzymatyczna może również determinować ich antagonistyczny wpływ na patogeny wnikające do przewodu pokarmowego. Interesujące byłoby również przeprowadzenie analiz metagenomicznych w celu ustalenia, czy ekspozycja na kwaśne dodatki chemiczne w ciągu życia ptaków sprzyja selekcji bakterii rezydentnych o większej „tolerancji kwasu” oraz czy obecność i/lub aktywność metaboliczna tych bakterii stanowiłaby dodatkową barierę dla kolonizacji patogenów.
Kwas mrówkowy jest stosowany od wielu lat jako dodatek chemiczny do pasz dla zwierząt oraz jako zakwaszacz kiszonki. Jednym z jego głównych zastosowań jest działanie przeciwdrobnoustrojowe, ograniczające liczbę patogenów w paszy i ich późniejszą kolonizację w przewodzie pokarmowym ptaków. Badania in vitro wykazały, że kwas mrówkowy jest stosunkowo skutecznym środkiem przeciwdrobnoustrojowym przeciwko Salmonelli i innym patogenom. Jednak stosowanie kwasu mrówkowego w matrycach paszowych może być ograniczone ze względu na dużą ilość materii organicznej w składnikach paszowych i ich potencjalną zdolność buforującą. Kwas mrówkowy wydaje się mieć antagonistyczne działanie na Salmonellę i inne patogeny po spożyciu z paszą lub wodą pitną. Jednak antagonizm ten występuje głównie w górnym odcinku przewodu pokarmowego, ponieważ stężenie kwasu mrówkowego może być zmniejszone w dolnym odcinku przewodu pokarmowego, podobnie jak w przypadku kwasu propionowego. Koncepcja ochrony kwasu mrówkowego poprzez enkapsulację oferuje potencjalne podejście do dostarczania większej ilości kwasu do dolnego odcinka przewodu pokarmowego. Co więcej, badania wykazały, że mieszanina kwasów organicznych jest skuteczniejsza w poprawie wydajności drobiu niż podawanie pojedynczego kwasu (152). Bakterie Campylobacter w przewodzie pokarmowym mogą reagować inaczej na mrówczan, ponieważ wykorzystują mrówczan jako donor elektronów, a mrówczan jest ich głównym źródłem energii. Nie jest jasne, czy zwiększenie stężenia mrówczanu w przewodzie pokarmowym byłoby korzystne dla Campylobacter, a może to nie nastąpić w zależności od obecności innej flory przewodu pokarmowego, która może wykorzystywać mrówczan jako substrat.
Potrzebne są dalsze badania w celu zbadania wpływu kwasu mrówkowego z przewodu pokarmowego na niepatogenne, rezydentne mikroorganizmy przewodu pokarmowego. Preferujemy selektywne zwalczanie patogenów bez zakłócania funkcjonowania tych członków mikrobiomu przewodu pokarmowego, którzy są korzystni dla gospodarza. Wymaga to jednak bardziej dogłębnej analizy sekwencji mikrobiomu tych rezydentnych społeczności mikroorganizmów przewodu pokarmowego. Chociaż opublikowano już kilka badań dotyczących mikrobiomu jelita ślepego ptaków leczonych kwasem mrówkowym, należy poświęcić więcej uwagi społeczności mikroorganizmów górnego odcinka przewodu pokarmowego. Identyfikacja mikroorganizmów i porównanie podobieństw między społecznościami mikroorganizmów przewodu pokarmowego w obecności lub nieobecności kwasu mrówkowego może być niepełnym opisem. Konieczne są dodatkowe analizy, w tym metabolomika i metagenomika, aby scharakteryzować różnice funkcjonalne między grupami o podobnym składzie. Taka charakterystyka ma kluczowe znaczenie dla ustalenia związku między społecznością mikroorganizmów przewodu pokarmowego a odpowiedzią ptaków na polepszacze na bazie kwasu mrówkowego. Połączenie wielu podejść w celu dokładniejszej charakterystyki funkcji układu pokarmowego powinno umożliwić opracowanie skuteczniejszych strategii suplementacji kwasami organicznymi i ostatecznie poprawić prognozy optymalnego stanu zdrowia i wydajności ptaków, jednocześnie ograniczając ryzyko dla bezpieczeństwa żywności.
SR napisał tę recenzję z pomocą DD i KR. Wszyscy autorzy wnieśli znaczący wkład w pracę przedstawioną w tej recenzji.
Autorzy oświadczają, że niniejszy przegląd otrzymał dofinansowanie od Anitox Corporation na rozpoczęcie prac nad nim i jego publikację. Fundatorzy nie mieli wpływu na poglądy i wnioski wyrażone w niniejszym artykule przeglądowym ani na decyzję o jego publikacji.
Pozostali autorzy oświadczają, że badania przeprowadzono bez jakichkolwiek powiązań komercyjnych lub finansowych, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów.
Dr DD pragnie podziękować za wsparcie ze strony Wydziału Podyplomowego Uniwersytetu Arkansas w ramach stypendium Distinguished Teaching Fellowship, a także za stałe wsparcie ze strony Programu Biologii Komórkowej i Molekularnej Uniwersytetu Arkansas oraz Wydziału Nauk o Żywności. Ponadto autorzy pragną podziękować firmie Anitox za wstępne wsparcie w pisaniu niniejszej recenzji.
1. Dibner JJ, Richards JD. Zastosowanie antybiotykowych stymulatorów wzrostu w rolnictwie: historia i mechanizmy działania. Poultry Science (2005) 84:634–43. doi: 10.1093/ps/84.4.634
2. Jones FT, Rick SC. Historia rozwoju i nadzoru nad środkami przeciwdrobnoustrojowymi w paszach dla drobiu. Poultry Science (2003) 82:613–7. doi: 10.1093/ps/82.4.613
3. Broom LJ. Teoria subinhibitoryczna antybiotykowych stymulatorów wzrostu. Poultry Science (2017) 96:3104–5. doi: 10.3382/ps/pex114
4. Sorum H, L'Abe-Lund TM. Oporność na antybiotyki u bakterii przenoszonych przez żywność – konsekwencje zakłóceń w globalnych sieciach genetycznych bakterii. International Journal of Food Microbiology (2002) 78:43–56. doi: 10.1016/S0168-1605(02)00241-6
5. Van Immerseel F, Cauwaerts K, Devriese LA, Heesebroek F, Ducatel R. Dodatki paszowe do zwalczania salmonelli w paszy. World Journal of Poultry Science (2002) 58:501–13. doi: 10.1079/WPS20020036
6. Angulo FJ, Baker NL, Olsen SJ, Anderson A, Barrett TJ. Zastosowanie leków przeciwdrobnoustrojowych w rolnictwie: kontrola przenoszenia oporności na leki przeciwdrobnoustrojowe na ludzi. Seminars in Pediatric Infectious Diseases (2004) 15:78–85. doi: 10.1053/j.spid.2004.01.010
7. Lekshmi M, Ammini P, Kumar S, Varela MF. Środowiska produkcji żywności i ewolucja oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe u patogenów ludzkich pochodzenia zwierzęcego. Mikrobiologia (2017) 5:11. doi: 10.3390/microorganisms5010011
8. Lourenço JM, Seidel DS, Callaway TR. Rozdział 9: Antybiotyki i funkcja jelit: historia i stan obecny. W: Ricke SC, red. Poprawa zdrowia jelit u drobiu. Cambridge: Burley Dodd (2020). Strony 189–204. DOI: 10.19103/AS2019.0059.10
9. Rick SC. Nr 8: Higiena pasz. W: Dewulf J., van Immerzeel F., wyd. Bezpieczeństwo biologiczne w produkcji zwierzęcej i medycynie weterynaryjnej. Leuven: ACCO (2017). Strony 144–76.