Dziękujemy za odwiedzenie strony nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z najnowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Dodatkowo, aby zapewnić ciągłą obsługę, ta strona nie będzie zawierać stylów ani JavaScript.
Siarkowodór (H₂S) ma wielorakie fizjologiczne i patologiczne skutki dla organizmu człowieka. Wodorosiarczek sodu (NaHS) jest szeroko stosowany jako narzędzie farmakologiczne do oceny wpływu H₂S w eksperymentach biologicznych. Chociaż utrata H₂S z roztworów NaHS trwa zaledwie kilka minut, roztwory NaHS były wykorzystywane jako związki donorowe dla H₂S w wodzie pitnej w niektórych badaniach na zwierzętach. W niniejszym badaniu zbadano, czy woda pitna o stężeniu NaHS 30 μM przygotowana w butelkach dla szczurów/myszy może pozostać stabilna przez co najmniej 12–24 godzin, jak sugerują niektórzy autorzy. Przygotuj roztwór NaHS (30 μM) w wodzie pitnej i natychmiast wlej go do butelek dla szczurów/myszy. Próbki pobrano z końcówki i wnętrza butelki po wodzie po 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 i 24 godzinach w celu pomiaru zawartości siarczków metodą błękitu metylenowego. Dodatkowo, samcom i samicom szczurów wstrzykiwano NaHS (30 μM) przez dwa tygodnie, a stężenia siarczków w surowicy mierzono co drugi dzień w pierwszym tygodniu i pod koniec drugiego tygodnia. Roztwór NaHS w próbce pobranej z końcówki butelki z wodą był niestabilny; zmniejszył się o 72% i 75% odpowiednio po 12 i 24 godzinach. W próbkach pobranych z wnętrza butelek z wodą spadek NaHS nie był istotny statystycznie w ciągu 2 godzin; jednak zmniejszył się o 47% i 72% odpowiednio po 12 i 24 godzinach. Wstrzyknięcie NaHS nie wpłynęło na poziom siarczków w surowicy u samców i samic szczurów. Podsumowując, roztwory NaHS przygotowane z wody pitnej nie powinny być stosowane do donacji H2S, ponieważ roztwór jest niestabilny. Ta droga podania narazi zwierzęta na nieregularne i mniejsze niż oczekiwane ilości NaHS.
Siarkowodór (H2S) był stosowany jako toksyna od 1700 roku; jednak jego możliwą rolę jako endogennej cząsteczki biosygnałowej opisali w 1996 roku Abe i Kimura. W ciągu ostatnich trzech dekad wyjaśniono liczne funkcje H2S w różnych układach organizmu człowieka, co doprowadziło do wniosku, że cząsteczki będące donorami H2S mogą mieć zastosowanie kliniczne w leczeniu lub kontrolowaniu niektórych chorób; najnowszy przegląd prac można znaleźć w publikacji Chirino i in.
Wodorosiarczek sodu (NaHS) jest szeroko stosowany jako narzędzie farmakologiczne do oceny wpływu H2S w wielu hodowlach komórkowych i badaniach na zwierzętach5,6,7,8. Jednak NaHS nie jest idealnym donorem H2S, ponieważ w roztworze szybko przekształca się w H2S/HS-, łatwo ulega zanieczyszczeniu polisulfidami oraz łatwo utlenia się i ulatnia4,9. W wielu eksperymentach biologicznych NaHS rozpuszcza się w wodzie, co powoduje bierne ulatnianie i utratę H2S10,11,12, spontaniczne utlenianie H2S11,12,13 i fotolizę14. Siarczek w pierwotnym roztworze jest tracony bardzo szybko z powodu ulatniania się H2S11. W otwartym pojemniku okres półtrwania (t1/2) H2S wynosi około 5 minut, a jego stężenie spada o około 13% na minutę10. Chociaż utrata siarkowodoru z roztworów NaHS trwa tylko kilka minut, w niektórych badaniach na zwierzętach stosowano roztwory NaHS jako źródło siarkowodoru w wodzie pitnej przez 1–21 tygodni, wymieniając roztwór zawierający NaHS co 12–24 godzin.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Taka praktyka nie jest zgodna z zasadami badań naukowych, ponieważ dawkowanie leków powinno być ustalane na podstawie ich stosowania u innych gatunków, zwłaszcza u ludzi.27
Badania przedkliniczne w biomedycynie mają na celu poprawę jakości opieki nad pacjentem lub wyników leczenia. Jednak wyniki większości badań na zwierzętach nie zostały jeszcze przełożone na ludzi28,29,30. Jedną z przyczyn tego niepowodzenia translacyjnego jest brak dbałości o jakość metodologiczną badań na zwierzętach30. Dlatego celem niniejszego badania było sprawdzenie, czy roztwory NaHS o stężeniu 30 μM przygotowane w butelkach z wodą dla szczurów/myszy mogą zachować stabilność w wodzie pitnej przez 12–24 godziny, jak twierdzą lub sugerują niektórzy badacze.
Wszystkie eksperymenty w tym badaniu przeprowadzono zgodnie z opublikowanymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania w Iranie31. Wszystkie raporty z eksperymentów w tym badaniu były również zgodne z wytycznymi ARRIVE32. Komisja Etyczna Instytutu Nauk Endokrynologicznych Uniwersytetu Nauk Medycznych im. Shahida Beheshtiego zatwierdziła wszystkie procedury eksperymentalne w tym badaniu.
Dwuwodny octan cynku (nr CAS: 5970-45-6) i bezwodny chlorek żelaza (nr CAS: 7705-08-0) zakupiono w firmie Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Francja). Hydrat wodorosiarczku sodu (nr CAS: 207683-19-0) i N,N-dimetylo-p-fenylenodiamina (DMPD) (nr CAS: 535-47-0) zakupiono w firmie Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Izofluran zakupiono w firmie Piramal (Bethlehem, PA, USA). Kwas solny (HCl) zakupiono w firmie Merck (Darmstadt, Niemcy).
Przygotuj roztwór NaHS (30 μM) w wodzie pitnej i natychmiast wlej go do butelek z wodą dla szczurów/myszy. To stężenie wybrano na podstawie licznych publikacji wykorzystujących NaHS jako źródło H₂S; patrz sekcja Dyskusja. NaHS to hydratowana cząsteczka, która może zawierać zmienną ilość wody hydratacyjnej (tj. NaHS•xH₂O); według producenta, procent NaHS użyty w naszym badaniu wynosił 70,7% (tj. NaHS•1,3 H₂O) i wzięliśmy tę wartość pod uwagę w naszych obliczeniach, gdzie zastosowaliśmy masę cząsteczkową 56,06 g/mol, która jest masą cząsteczkową bezwodnego NaHS. Woda hydratacyjna (zwana również wodą krystalizacyjną) to cząsteczki wody, które tworzą strukturę krystaliczną33. Hydraty mają inne właściwości fizyczne i termodynamiczne niż bezwodniki34.
Przed dodaniem NaHS do wody pitnej należy zmierzyć pH i temperaturę rozpuszczalnika. Natychmiast wlać roztwór NaHS do butelki z wodą dla szczurów/myszy w klatce. Próbki pobierano z końcówki i z wnętrza butelki po 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 i 24 godzinach w celu pomiaru zawartości siarczków. Pomiary siarczków wykonywano natychmiast po każdym pobraniu próbki. Próbki pobieraliśmy z końcówki probówki, ponieważ niektóre badania wykazały, że mały rozmiar porów w rurce z wodą może zminimalizować parowanie H2S15,19. Wydaje się, że problem ten dotyczy również roztworu w butelce. Jednak nie dotyczył on roztworu w szyjce butelki, który miał większą szybkość parowania i ulegał autoutlenianiu; w rzeczywistości zwierzęta piły tę wodę jako pierwsze.
W badaniu wykorzystano samce i samice szczurów rasy Wistar. Szczury trzymano w klatkach polipropylenowych (po 2–3 szczury w klatce) w standardowych warunkach (temperatura 21–26°C, wilgotność 32–40%) z 12 godzinami światła (od 7:00 do 19:00) i 12 godzinami ciemności (od 19:00 do 7:00). Szczury miały swobodny dostęp do wody z kranu i były karmione standardową karmą (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Samice (n=10, masa ciała: 190–230 g) i samce (n=10, masa ciała: 320–370 g) szczurów rasy Wistar dobranych w tym samym wieku (6 miesięcy) podzielono losowo na grupę kontrolną i grupę leczoną NaHS (30 μM) (n=5 w każdej grupie). Aby określić wielkość próby, zastosowaliśmy podejście KISS (Keep It Simple, Stupid), które łączy poprzednie doświadczenie i analizę mocy35. Najpierw przeprowadziliśmy badanie pilotażowe na 3 szczurach i określiliśmy średni całkowity poziom siarczków w surowicy oraz odchylenie standardowe (8,1 ± 0,81 μM). Następnie, biorąc pod uwagę moc 80% i zakładając dwustronny poziom istotności 5%, określiliśmy wstępną liczebność próby (n = 5 na podstawie wcześniejszej literatury), która odpowiadała standaryzowanej wielkości efektu 2,02 z predefiniowaną wartością sugerowaną przez Festinga do obliczenia liczebności próby zwierząt doświadczalnych35. Po pomnożeniu tej wartości przez odchylenie standardowe (SD) (2,02 × 0,81), przewidywana wykrywalna wielkość efektu (1,6 μM) wyniosła 20%, co jest wartością akceptowalną. Oznacza to, że n = 5/grupa jest wystarczające do wykrycia 20% średniej różnicy między grupami. Szczury podzielono losowo na grupę kontrolną i grupę leczoną NaSH, wykorzystując funkcję losową oprogramowania Excel36 (Rys. uzupełniający 1). Na poziomie wyników zastosowano metodę zaślepienia, a badacze wykonujący pomiary biochemiczne nie byli świadomi przydziału grup.
Grupy NaHS obu płci traktowano 30 μM roztworem NaHS przygotowanym w wodzie pitnej przez 2 tygodnie; świeży roztwór dostarczano co 24 godziny, w trakcie których mierzono masę ciała. Próbki krwi pobierano z końcówek ogonów wszystkich szczurów w znieczuleniu izofluranowym co drugi dzień pod koniec pierwszego i drugiego tygodnia. Próbki krwi wirowano przy 3000 g przez 10 minut, surowicę oddzielono i przechowywano w temperaturze –80°C w celu późniejszego pomiaru mocznika w surowicy, kreatyniny (Cr) i całkowitego siarczku. Mocznik w surowicy oznaczano metodą enzymatyczną z ureazą, a kreatyninę w surowicy oznaczano fotometryczną metodą Jaffe'a, używając zestawów dostępnych w handlu (Man Company, Teheran, Iran) i automatycznego analizatora (Selectra E, numer seryjny 0-2124, Holandia). Współczynniki zmienności wewnątrz- i międzytestowej dla mocznika i Cr były mniejsze niż 2,5%.
Metoda błękitu metylenowego (MB) służy do pomiaru całkowitej zawartości siarczków w wodzie pitnej i surowicy zawierającej NaHS; MB jest najczęściej stosowaną metodą pomiaru siarczków w roztworach zbiorczych i próbkach biologicznych11,37. Metodę MB można wykorzystać do oszacowania całkowitej puli siarczków38 oraz pomiaru nieorganicznych siarczków w postaci H2S, HS- i S2 w fazie wodnej39. W tej metodzie siarka jest wytrącana jako siarczek cynku (ZnS) w obecności octanu cynku11,38. Wytrącanie octanem cynku jest najczęściej stosowaną metodą oddzielania siarczków od innych chromoforów11. ZnS ponownie rozpuszczono za pomocą HCl11 w silnie kwaśnych warunkach. Siarczek reaguje z DMPD w stosunku stechiometrycznym 1:2 w reakcji katalizowanej chlorkiem żelazowym (Fe3+ działa jako utleniacz), tworząc barwnik MB, który jest wykrywany spektrofotometrycznie przy długości fali 670 nm40,41. Granica wykrywalności metody MB wynosi około 1 μM11.
W niniejszym badaniu do probówki dodano 100 μl każdej próbki (roztworu lub surowicy); następnie dodano 200 μl octanu cynku (1% w/v w wodzie destylowanej), 100 μl DMPD (20 mM w 7,2 M HCl) i 133 μl FeCl3 (30 mM w 1,2 M HCl). Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C w ciemności przez 30 minut. Roztwór wirowano z prędkością 10 000 g przez 10 minut, a absorbancję supernatantu odczytywano przy długości fali 670 nm za pomocą czytnika mikropłytek (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Stężenia siarczków określono za pomocą krzywej kalibracyjnej NaHS (0–100 μM) w ddH2O (rys. uzupełniający 2). Wszystkie roztwory użyte do pomiarów zostały świeżo przygotowane. Współczynniki zmienności wewnątrz- i międzytestowej dla pomiarów siarczków wyniosły odpowiednio 2,8% i 3,4%. Określiliśmy również całkowitą ilość siarczków odzyskanych z próbek wody pitnej i surowicy zawierających tiosiarczan sodu, stosując metodę wzbogaconej próbki42. Odzysk dla próbek wody pitnej i surowicy zawierających tiosiarczan sodu wyniósł odpowiednio 91 ± 1,1% (n = 6) i 93 ± 2,4% (n = 6).
Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism w wersji 8.0.2 dla systemu Windows (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA, www.graphpad.com). Do porównania temperatury i pH wody pitnej przed i po dodaniu NaHS zastosowano sparowany test t. Utratę H2S w roztworze zawierającym NaHS obliczono jako procentowy spadek w stosunku do wartości początkowej, a aby ocenić, czy utrata ta była statystycznie istotna, przeprowadziliśmy jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami, a następnie test wielokrotnych porównań Dunnetta. Masę ciała, stężenie mocznika w surowicy, stężenie kreatyniny w surowicy i całkowite stężenie siarczków w surowicy w czasie porównano między szczurami kontrolnymi i szczurami leczonymi NaHS, obu płci, przy użyciu dwukierunkowej mieszanej analizy wariancji (ANOVA) z następowym testem post hoc Bonferroniego. Dwustronne wartości p < 0,05 uznano za statystycznie istotne.
Wartość pH wody pitnej wynosiła 7,60 ± 0,01 przed dodaniem NaHS i 7,71 ± 0,03 po dodaniu NaHS (n = 13, p = 0,0029). Temperatura wody pitnej wynosiła 26,5 ± 0,2 i spadła do 26,2 ± 0,2 po dodaniu NaHS (n = 13, p = 0,0128). Przygotuj 30 μM roztwór NaHS w wodzie pitnej i przechowuj go w butelce na wodę. Roztwór NaHS jest niestabilny, a jego stężenie zmniejsza się z czasem. Podczas pobierania próbek z szyjki butelki na wodę zaobserwowano znaczny spadek (68,0%) w ciągu pierwszej godziny, a zawartość NaHS w roztworze zmniejszyła się odpowiednio o 72% i 75% po 12 i 24 godzinach. W próbkach pobranych z butelek z wodą, spadek zawartości NaHS nie był istotny do 2 godzin, ale po 12 i 24 godzinach zmniejszył się odpowiednio o 47% i 72%. Dane te wskazują, że zawartość NaHS w roztworze o stężeniu 30 μM przygotowanym w wodzie pitnej spadła do około jednej czwartej wartości początkowej po 24 godzinach, niezależnie od miejsca pobrania próbki (rysunek 1).
Stabilność roztworu NaHS (30 μM) w wodzie pitnej w butelkach dla szczurów/myszy. Po przygotowaniu roztworu pobrano próbki z końcówki i wnętrza butelki. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n = 6/grupa). * i #, P < 0,05 w porównaniu z czasem 0. Zdjęcie butelki przedstawia końcówkę (z otworem) i korpus butelki. Objętość końcówki wynosi około 740 μl.
Stężenie NaHS w świeżo przygotowanym roztworze o stężeniu 30 μM wynosiło 30,3 ± 0,4 μM (zakres: 28,7–31,9 μM, n = 12). Jednak po 24 godzinach stężenie NaHS spadło do niższej wartości (średnio: 3,0 ± 0,6 μM). Jak pokazano na rysunku 2, stężenia NaHS, na które narażone były szczury, nie były stałe w okresie badania.
Masa ciała samic szczurów istotnie wzrosła w czasie (od 205,2 ± 5,2 g do 213,8 ​​± 7,0 g w grupie kontrolnej i od 204,0 ± 8,6 g do 211,8 ± 7,5 g w grupie leczonej NaHS); jednak leczenie NaHS nie miało wpływu na masę ciała (ryc. 3). Masa ciała samców szczurów istotnie wzrosła w czasie (od 338,6 ± 8,3 g do 352,4 ± 6,0 g w grupie kontrolnej i od 352,4 ± 5,9 g do 363,2 ± 4,3 g w grupie leczonej NaHS); jednak leczenie NaHS nie miało wpływu na masę ciała (ryc. 3).
Zmiany masy ciała u samic i samców szczurów po podaniu NaHS (30 μM). Dane przedstawiono jako średnią ± SEM i porównano za pomocą dwukierunkowej mieszanej (wewnątrz-pomiędzy) analizy wariancji z testem post hoc Bonferroniego. n = 5 osobników każdej płci w każdej grupie.
Stężenia mocznika i fosforanu kreatyny w surowicy były porównywalne u szczurów z grupy kontrolnej i szczurów otrzymujących NaSH w trakcie całego badania. Co więcej, leczenie NaSH nie wpłynęło na stężenia mocznika i chromu kreatynowego w surowicy (Tabela 1).
Stężenia siarczków całkowitych w surowicy na początku badania były porównywalne u samców szczurów w grupie kontrolnej i szczurów leczonych NaHS (8,1 ± 0,5 μM w porównaniu z 9,3 ± 0,2 μM) oraz u samic szczurów (9,1 ± 1,0 μM w porównaniu z 6,1 ± 1,1 μM). Podawanie NaHS przez 14 dni nie miało wpływu na stężenie siarczków całkowitych w surowicy ani u samców, ani u samic szczurów (ryc. 4).
Zmiany całkowitego stężenia siarczków w surowicy u samców i samic szczurów po podaniu NaHS (30 μM). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM i porównano za pomocą dwukierunkowej, mieszanej (wewnątrz-wewnątrz) analizy wariancji z testem post hoc Bonferroniego. Każda płeć, n = 5/grupa.
Głównym wnioskiem z tego badania jest to, że woda pitna zawierająca NaHS jest niestabilna: zaledwie około jednej czwartej początkowej całkowitej zawartości siarczków można wykryć po 24 godzinach od pobrania próbek z końcówki i wnętrza butelek z wodą dla szczurów/myszy. Ponadto szczury były narażone na niestabilne stężenia NaHS z powodu utraty H2S w roztworze NaHS, a dodanie NaHS do wody pitnej nie wpłynęło na masę ciała, stężenie mocznika i chromu w surowicy ani całkowite stężenie siarczków w surowicy.
W niniejszym badaniu szybkość utraty H₂S z 30 μM roztworów NaHS przygotowanych w wodzie pitnej wynosiła około 3% na godzinę. W roztworze buforowanym (100 μM siarczku sodu w 10 mM PBS, pH 7,4) odnotowano spadek stężenia siarczków o 7% w czasie w ciągu 8 godzin11. Wcześniej broniliśmy dootrzewnowego podania NaHS, podając, że szybkość utraty siarczków z 54 μM roztworu NaHS w wodzie pitnej wynosiła około 2,3% na godzinę (4%/godzinę w ciągu pierwszych 12 godzin i 1,4%/godzinę w ciągu ostatnich 12 godzin po przygotowaniu)8. Wcześniejsze badania43 wykazały stałą utratę H₂S z roztworów NaHS, głównie z powodu ulatniania się i utleniania. Nawet bez dodawania pęcherzyków powietrza, siarczki w roztworze macierzystym szybko tracą się z powodu ulatniania się H₂S11. Badania wykazały, że podczas procesu rozcieńczania, trwającego około 30–60 sekund, około 5–10% H₂S ulega utracie w wyniku parowania6. Aby zapobiec parowaniu H₂S z roztworu, naukowcy podjęli szereg działań, w tym delikatne mieszanie roztworu12, przykrycie roztworu macierzystego folią plastikową6 oraz minimalizowanie ekspozycji roztworu na działanie powietrza, ponieważ szybkość parowania H₂S zależy od granicy faz powietrze-ciecz13. Spontaniczne utlenianie H₂S zachodzi głównie za sprawą jonów metali przejściowych, zwłaszcza żelaza(III), które stanowią zanieczyszczenia w wodzie13. Utlenianie H₂S prowadzi do tworzenia polisulfidów (atomów siarki połączonych wiązaniami kowalencyjnymi)11. Aby uniknąć utleniania, roztwory zawierające H2S przygotowuje się w odtlenionych rozpuszczalnikach44,45, a następnie przepłukuje argonem lub azotem przez 20–30 minut w celu zapewnienia odtlenienia.11,12,37,44,45,46 Kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA) jest chelatorem metali (10–4 M), który zapobiega samoutlenianiu HS- w roztworach tlenowych. W przypadku braku DTPA, szybkość samoutleniania HS- wynosi około 50% w ciągu około 3 godzin w temperaturze 25°C37,47. Ponadto, ponieważ utlenianie 1e-siarczku jest katalizowane światłem ultrafioletowym, roztwór należy przechowywać w lodzie i chronić przed światłem11.
Jak pokazano na rysunku 5, NaHS dysocjuje na Na+ i HS-6 po rozpuszczeniu w wodzie; dysocjacja ta jest określona przez pK1 reakcji, które zależy od temperatury: pK1 = 3,122 + 1132/T, gdzie T waha się od 5 do 30°C i jest mierzone w stopniach Kelvina (K), K = °C + 273,1548. HS- ma wysokie pK2 (pK2 = 19), więc przy pH < 96,49, S2- nie powstaje lub powstaje w bardzo małych ilościach. Natomiast HS- działa jak zasada i przyjmuje H+ z cząsteczki H2O, a H2O działa jak kwas i jest przekształcany w H2S i OH-.
Powstawanie rozpuszczonego gazowego H2S w roztworze NaHS (30 µM). aq, roztwór wodny; g, gaz; l, ciecz. Wszystkie obliczenia zakładają pH wody = 7,0 i temperaturę wody = 20°C. Stworzone z BioRender.com.
Pomimo dowodów na niestabilność roztworów NaHS, w kilku badaniach na zwierzętach wykorzystano roztwory NaHS w wodzie pitnej jako donor H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, przy czasie trwania interwencji od 1 do 21 tygodni (Tabela 2). Podczas tych badań roztwór NaHS wymieniano co 12, 15, 17, 18, 24, 25 lub 24, 19, 20, 21, 22, 23 godziny. Nasze wyniki pokazały, że szczury były narażone na niestabilne stężenia leku z powodu utraty H2S z roztworu NaHS, a zawartość NaHS w wodzie pitnej szczurów ulegała znacznym wahaniom w ciągu 12 lub 24 godzin (patrz Rysunek 2). Dwa z tych badań wykazały, że poziomy H2S w wodzie pozostały stabilne przez 24 godziny lub że zaobserwowano jedynie 2–3% strat H2S w ciągu 12 godzin, ale nie dostarczyły danych potwierdzających ani szczegółów pomiarów. Dwa badania wykazały, że mała średnica butelek z wodą może zminimalizować parowanie H2S15,19. Jednak nasze wyniki pokazały, że może to opóźnić utratę H2S z butelki z wodą jedynie o 2 godziny, a nie o 12–24 godziny. Oba badania zauważają, że zakładamy, że poziom NaHS w wodzie pitnej nie zmienił się, ponieważ nie zaobserwowaliśmy zmiany koloru wody; dlatego utlenianie H2S przez powietrze nie było istotne19,20. Co zaskakujące, ta subiektywna metoda ocenia stabilność NaHS w wodzie, a nie mierzy zmianę jego stężenia w czasie.
Utrata H2S w roztworze NaHS jest związana z pH i temperaturą. Jak zauważono w naszych badaniach, rozpuszczenie NaHS w wodzie powoduje powstanie roztworu alkalicznego50. Gdy NaHS rozpuszcza się w wodzie, powstawanie rozpuszczonego gazu H2S zależy od wartości pH6. Im niższe pH roztworu, tym większy udział NaHS obecnego w postaci cząsteczek gazu H2S i tym więcej siarczku jest tracone z roztworu wodnego11. Żadne z tych badań nie podało pH wody pitnej używanej jako rozpuszczalnik dla NaHS. Zgodnie z zaleceniami WHO, które są przyjmowane przez większość krajów, pH wody pitnej powinno mieścić się w zakresie 6,5–8,551. W tym zakresie pH szybkość spontanicznego utleniania H2S wzrasta około dziesięciokrotnie13. Rozpuszczenie NaHS w wodzie w tym zakresie pH spowoduje stężenie rozpuszczonego gazu H2S wynoszące od 1 do 22,5 μM, co podkreśla znaczenie monitorowania pH wody przed rozpuszczeniem NaHS. Ponadto zakres temperatur podany w powyższym badaniu (18–26°C) skutkowałby zmianą stężenia rozpuszczonego H₂S w roztworze o około 10%, ponieważ zmiany temperatury zmieniają pK₂, a niewielkie zmiany pK₂ mogą mieć znaczący wpływ na stężenie rozpuszczonego H₂S48. Dodatkowo, długi czas trwania niektórych badań (5 miesięcy)22, podczas którego spodziewana jest duża zmienność temperatury, dodatkowo pogłębia ten problem.
We wszystkich badaniach, z wyjątkiem jednego21, użyto 30 μM roztworu NaHS w wodzie pitnej. Aby wyjaśnić zastosowaną dawkę (tj. 30 μM), niektórzy autorzy wskazali, że NaHS w fazie wodnej wytwarza dokładnie takie samo stężenie gazu H2S, a zakres fizjologiczny H2S wynosi od 10 do 100 μM, więc dawka ta mieści się w zakresie fizjologicznym15,16. Inni wyjaśnili, że 30 μM NaHS może utrzymać poziom H2S w osoczu w zakresie fizjologicznym, tj. 5–300 μM19,20. Rozważamy stężenie NaHS w wodzie wynoszące 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), które było stosowane w niektórych badaniach do badania wpływu H2S. Możemy obliczyć, że stężenie rozpuszczonego gazu H2S wynosi 14,7 μM, co stanowi około 50% początkowego stężenia NaHS. Wartość ta jest zbliżona do wartości obliczonej przez innych autorów w tych samych warunkach13,48.
W naszym badaniu podanie NaHS nie zmieniło masy ciała; wynik ten jest zgodny z wynikami innych badań przeprowadzonych na samcach myszy22,23 i samcach szczurów18. Jednakże dwa badania wykazały, że NaSH przywrócił zmniejszoną masę ciała u szczurów po nefrektomii24,26, podczas gdy inne badania nie wykazały wpływu podawania NaSH na masę ciała15,16,17,19,20,21,25. Co więcej, w naszym badaniu podanie NaSH nie wpłynęło na poziom mocznika i chromu w surowicy, co jest zgodne z wynikami innego raportu25.
Badanie wykazało, że dodanie NaHS do wody pitnej przez 2 tygodnie nie wpłynęło na całkowite stężenie siarczków w surowicy u szczurów płci męskiej i żeńskiej. Odkrycie to jest zgodne z wynikami Sen i in. (16): 8 tygodni leczenia 30 μM NaHS w wodzie pitnej nie wpłynęło na stężenie siarczków w osoczu u szczurów kontrolnych; jednakże zgłosili, że ta interwencja przywróciła obniżone stężenie H2S w osoczu u myszy po nefrektomii. Li i in. (22) również zgłosili, że leczenie 30 μM NaHS w wodzie pitnej przez 5 miesięcy zwiększyło stężenie wolnych siarczków w osoczu u starych myszy o około 26%. Inne badania nie wykazały zmian w krążącym siarczku po dodaniu NaHS do wody pitnej.
Siedem badań dotyczyło zastosowania Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, ale nie zawierało dalszych szczegółów na temat wody hydratacyjnej, a pięć badań nie wspominało o źródle NaHS użytym w metodach przygotowania17,18,24,25,26. NaHS jest cząsteczką hydratowaną, a jego zawartość wody hydratacyjnej może się różnić, co wpływa na ilość NaHS potrzebną do przygotowania roztworu o danym stężeniu molowym. Na przykład, zawartość NaHS w naszym badaniu wynosiła NaHS•1,3·H2O. Zatem rzeczywiste stężenia NaHS w tych badaniach mogą być niższe niż podane.
„Jak tak krótkotrwały związek może mieć tak długotrwały efekt?” Pozgay i wsp.21 zadali to pytanie, oceniając wpływ NaHS na zapalenie jelita grubego u myszy. Mają nadzieję, że przyszłe badania pozwolą na odpowiedź na to pytanie i spekulują, że roztwory NaHS mogą zawierać bardziej stabilne polisulfidy oprócz H₂S i disulfidów, które pośredniczą w działaniu NaHS₂1. Inną możliwością jest to, że bardzo niskie stężenia NaHS pozostające w roztworze mogą również mieć korzystny wpływ. W rzeczywistości Olson i wsp. dostarczyli dowodów na to, że mikromolowe stężenia H₂S we krwi nie są fizjologiczne i powinny mieścić się w zakresie nanomoli lub być całkowicie nieobecne13. H₂S może działać poprzez siarczanowanie białek, odwracalną modyfikację potranslacyjną, która wpływa na funkcję, stabilność i lokalizację wielu białek52,53,54. W rzeczywistości, w warunkach fizjologicznych, około 10% do 25% wielu białek wątrobowych jest sulfylowanych53. Oba badania potwierdzają szybki rozkład NaHS19,23, ale zaskakująco stwierdzają, że „kontrolowaliśmy stężenie NaHS w wodzie pitnej, wymieniając ją codziennie”.23 W jednym z badań przypadkowo stwierdzono, że „NaHS jest standardowym donorem H2S i jest powszechnie stosowany w praktyce klinicznej w celu zastąpienia samego H2S”.18
Powyższa dyskusja pokazuje, że NaHS jest tracony z roztworu poprzez ulatnianie, utlenianie i fotolizę, dlatego też przedstawiono pewne sugestie mające na celu zmniejszenie utraty H2S z roztworu. Po pierwsze, parowanie H2S zależy od granicy faz gaz-ciecz13 i pH roztworu11; dlatego też, aby zminimalizować utratę przez parowanie, szyjkę butelki z wodą można wykonać tak małą, jak to możliwe, jak opisano wcześniej15,19, a pH wody można dostosować do akceptowalnej górnej granicy (tj. 6,5–8,551), aby zminimalizować utratę przez parowanie11. Po drugie, spontaniczne utlenianie H2S następuje z powodu działania tlenu i obecności jonów metali przejściowych w wodzie pitnej13, więc odtlenienie wody pitnej argonem lub azotem44,45 i zastosowanie chelatorów metali37,47 może zmniejszyć utlenianie siarczków. Po trzecie, aby zapobiec fotorozkładowi H2S, butelki z wodą można owinąć folią aluminiową; Praktyka ta dotyczy również materiałów światłoczułych, takich jak streptozotocyna55. Wreszcie, nieorganiczne sole siarczkowe (NaHS, Na2S i CaS) można podawać przez zgłębnik, a nie rozpuszczać w wodzie pitnej, jak wcześniej zgłaszano56,57,58; badania wykazały, że radioaktywny siarczek sodu podawany szczurom przez zgłębnik jest dobrze wchłaniany i dystrybuowany do praktycznie wszystkich tkanek59. Do tej pory w większości badań podawano nieorganiczne sole siarczkowe dootrzewnowo; jednak ta droga jest rzadko stosowana w warunkach klinicznych60. Z drugiej strony, droga doustna jest najczęstszą i preferowaną drogą podawania u ludzi61. Dlatego zalecamy ocenę wpływu donorów H2S na gryzonie po podaniu doustnym.
Ograniczeniem jest to, że zmierzyliśmy siarczek w roztworze wodnym i surowicy metodą MB. Metody pomiaru siarczków obejmują miareczkowanie jodem, spektrofotometrię, metodę elektrochemiczną (potencjometria, amperometria, metoda kulometryczna i metoda amperometryczna) oraz chromatografię (chromatografia gazowa i wysokosprawna chromatografia cieczowa), spośród których najczęściej stosowaną metodą jest metoda spektrofotometryczna MB62. Ograniczeniem metody MB do pomiaru H2S w próbkach biologicznych jest to, że mierzy ona wszystkie związki zawierające siarkę, a nie wolny H2S63, ponieważ jest przeprowadzana w warunkach kwaśnych, co powoduje ekstrakcję siarki ze źródła biologicznego64. Jednak według Amerykańskiego Stowarzyszenia Zdrowia Publicznego (American Public Health Association), MB jest standardową metodą pomiaru siarczków w wodzie65. Dlatego to ograniczenie nie wpływa na nasze główne wyniki dotyczące niestabilności roztworów zawierających NaHS. Co więcej, w naszym badaniu odzysk pomiarów siarczków w próbkach wody i surowicy zawierających NaHS wyniósł odpowiednio 91% i 93%. Wartości te są zgodne z wcześniej raportowanymi zakresami (77–92)66, co wskazuje na akceptowalną precyzję analityczną42. Warto zauważyć, że wykorzystaliśmy zarówno samce, jak i samice szczurów zgodnie z wytycznymi Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH), aby uniknąć nadmiernego polegania na badaniach wyłącznie na samcach zwierząt w badaniach przedklinicznych67 i w miarę możliwości uwzględnić zarówno samce, jak i samice szczurów68. Kwestia ta została podkreślona przez innych badaczy69,70,71.
Podsumowując, wyniki niniejszego badania wskazują, że roztwory NaHS przygotowane z wody pitnej nie mogą być używane do generowania siarkowodoru (H₂S) ze względu na ich niestabilność. Taka droga podania narażałaby zwierzęta na niestabilne i niższe niż oczekiwane stężenia NaHS; dlatego wyniki te mogą nie mieć zastosowania u ludzi.
Zestawy danych wykorzystane i/lub przeanalizowane w trakcie niniejszego badania są dostępne u autora korespondencyjnego na uzasadnioną prośbę.
Szabo, K. Chronologia badań nad siarkowodorem (H2S): od toksyny środowiskowej do mediatora biologicznego. Biochemia i Farmakologia 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. i Kimura, H. Możliwa rola siarkowodoru jako endogennego neuromodulatora. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. i Papapetropoulos, A. Fizjologiczna rola siarkowodoru w komórkach, tkankach i narządach ssaków. Recenzje w Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB i Kashfi, K. Rozwijające się możliwości komórkowych systemów dostarczania tlenku azotu i siarkowodoru: nowa era medycyny spersonalizowanej. Biochemia i Farmakologia 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X. i in. Długotrwałe podawanie wolno uwalniającego się donora siarkowodoru może zapobiegać uszkodzeniu mięśnia sercowego w wyniku niedokrwienia/reperfuzji. ​​Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM i Hermann, A. Fosforylacja kanału BK reguluje wrażliwość na siarkowodór (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM i Hermann, A. Siarkowodór zwiększa aktywność kanału potasowego aktywowanego wapniem (BK) w komórkach guza przysadki mózgowej szczura. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S. i in. Siarkowodór wzmacnia działanie ochronne azotynu przed uszkodzeniem mięśnia sercowego w wyniku niedokrwienia i reperfuzji u szczurów z cukrzycą typu 2. Tlenek azotu 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A. i in. Trendy w chemii donorów H2S i ich wpływ na choroby układu krążenia. Antyoksydanty 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF i Olson, KR (2012). Pasywne straty siarkowodoru w eksperymentach biologicznych. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P. i in. Chemiczne aspekty pomiarów siarkowodoru w próbkach fizjologicznych. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometryczne oznaczanie siarkowodoru w wodach naturalnych. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Szkolenie praktyczne z chemii i biologii siarkowodoru. „Antyoksydanty”. Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).