Sortowanie białek w szlaku wydzielniczym jest niezbędne do utrzymania kompartmentalizacji i homeostazy komórki. Oprócz sortowania za pośrednictwem powłoki, rola lipidów w sortowaniu kinezyny w procesie transportu wydzielniczego jest od dawna podstawowym pytaniem, na które nie ma jeszcze odpowiedzi. W niniejszym badaniu przeprowadziliśmy jednoczesne, wielokolorowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, aby udowodnić in vivo, że nowo zsyntetyzowane białka immobilizowane glikozylofosfatydyloinozytolem z bardzo długimi fragmentami lipidowymi ceramidu są klastrowane i klasyfikowane do wyspecjalizowanych miejsc wyjścia netto endoplazmy, które różnią się od miejsca wykorzystywanego przez białka transbłonowe. Ponadto wykazaliśmy, że długość łańcucha ceramidu w błonie siateczki śródplazmatycznej ma kluczowe znaczenie dla tej selektywności sortowania. Nasze badanie dostarcza pierwszych bezpośrednich dowodów in vivo na klasyfikację ładunków białkowych na podstawie długości łańcucha lipidowego do selektywnych miejsc eksportu w szlaku wydzielniczym.
W komórkach eukariotycznych białka syntetyzowane w siateczce śródplazmatycznej (ER) są następnie sortowane podczas transportu przez szlak wydzielniczy w celu dostarczenia do właściwego miejsca docelowego w komórce (1). Oprócz sortowania pośredniczonego przez otoczkę, od dawna spekulowano, że niektóre lipidy mogą również służyć jako selektywne punkty wyjścia, grupując je w specyficzne domeny błonowe, które są specyficzne dla określonych białek (2-5). Jednak nadal brakuje bezpośrednich dowodów in vivo potwierdzających ten możliwy mechanizm oparty na lipidach. Aby rozwiązać ten podstawowy problem, zbadaliśmy w drożdżach, w jaki sposób białka zakotwiczone w glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI) (GPI-AP) są różnicowo eksportowane z ER. GPI-AP to różnorodne białka powierzchniowe komórek połączone z lipidami (6, 7). GPI-AP to białko wydzielnicze przyłączone do zewnętrznych listków błony plazmatycznej poprzez fragment glikolipidowy (kotwica GPI). Akceptują one kotwice GPI jako konserwatywne modyfikacje potranslacyjne w świetle ER (8). Po przyłączeniu, GPI-AP przechodzi przez aparat Golgiego (5, 9) z ER do błony plazmatycznej. Obecność kotwic GPI powoduje, że GPI-AP jest transportowany oddzielnie od białek wydzielanych przez błonę transbłonową (w tym innych białek błony plazmatycznej) wzdłuż szlaku wydzielniczego (5, 9, 10). W komórkach drożdży GPI-AP są oddzielane od innych białek wydzielanych w siateczce śródplazmatycznej, a następnie pakowane w unikalne pęcherzyki owinięte kompleksem białek płaszcza II (COPII) (6, 7). Czynniki determinujące ten proces klasyfikacji w procesie eksportu ER są niejasne, ale spekuluje się, że mechanizm ten może wymagać lipidów, zwłaszcza strukturalnej przebudowy części lipidowej kotwicy GPI (5, 8). W drożdżach przebudowa lipidów GPI rozpoczyna się natychmiast po przyłączeniu GPI i w wielu przypadkach powoduje wiązanie się ceramidu z 26-węglowym długołańcuchowym nasyconym kwasem tłuszczowym (C26:0) (11, 12). Ceramid C26 jest głównym ceramidem produkowanym dotychczas przez komórki drożdży. Jest syntetyzowany w siateczce śródplazmatycznej (ER), a większość z niego jest eksportowana do aparatu Golgiego przez pęcherzyki COPII (13). Eksport GPI-AP z siateczki śródplazmatycznej (ER) wymaga ciągłej syntezy ceramidu (14, 15), a z kolei konwersja ceramidu do ceramidu fosforanu inozytolu (IPC) w aparacie Golgiego zależy od syntezy kotwicy GPI (16). Badania biofizyczne z wykorzystaniem sztucznych membran wykazały, że ceramidy o bardzo długich łańcuchach acylowych mogą łączyć się, tworząc uporządkowane domeny o unikalnych właściwościach fizycznych (17, 18). Dane te prowadzą do hipotezy, że ceramid C26 i GPI-AP z ceramidem C26 wykorzystują swoje właściwości fizyczne do łączenia się w uporządkowane regiony lub regiony w stosunkowo chaotycznym środowisku lipidowym błony śródplazmatycznej (ER). Składa się on głównie z krótkich i nienasyconych glicerolipidów (C16:1 i C18:1) (19, 20). Regiony te będą selektywnie skupione na określonych miejscach wyjścia z ER (ERES), gdzie ceramid i oparty na ceramidzie GPI-AP mogą być wspólnie transportowane do aparatu Golgiego w tym samym dedykowanym pęcherzyku COPII (5).
W tym badaniu bezpośrednio przetestowaliśmy ten oparty na lipidach mechanizm, wykorzystując superrozdzielczą mikroskopię konfokalną w czasie rzeczywistym (SCLIM), która jest najnowocześniejszą techniką mikroskopową umożliwiającą jednoczesną obserwację białek znakowanych fluorescencyjnie. Trójkolorowe i trójwymiarowe (3D) obrazy charakteryzują się niezwykle wysoką rozdzielczością i szybkością w żywych komórkach (21, 22).
Najpierw zastosowaliśmy technologię SCLIM, aby dokładniej określić, w jaki sposób normalny GPI-AP z grupą ceramidu C26 był przesiewany pod kątem białek wydzielanych przez błonę komórkową po opuszczeniu ER u S. cerevisiae. Aby sprawdzić klasyfikację ER, wykorzystaliśmy system genetyczny, który może bezpośrednio wizualizować nowo zsyntetyzowany ładunek (cargo) wchodzący do ERES in vivo (7, 23). Jako ładunek wybraliśmy GPI-AP oparty na ceramidzie C26, Gas1 znakowany zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) oraz białko wydzielane przez błonę komórkową Mid2 znakowane białkiem fluorescencyjnym bliskiej podczerwieni (iRFP), które celują w błonę komórkową (24–26). W mutancie wrażliwym na temperaturę sec31-1, te dwa ładunki są ekspresjonowane pod wpływem promotora indukowanego galaktozą i konstytutywnego markera ERES. W ekstremalnej temperaturze (37°C), ponieważ mutacja sec31-1 wpływa na funkcję składnika otoczki COPII Sec31, hamując kiełkowanie COPII i eksport ER, nowo zsyntetyzowany ładunek gromadzi się w ER (23). Po schłodzeniu do niskiej temperatury (24°C), zmutowane komórki sec31-1 odzyskiwały się z obszaru wydzielniczego, a zgromadzony nowy ładunek syntetyczny zaczął być eksportowany z ER. Wizualizacja CLIM wykazała, że ​​większość nowo zsyntetyzowanych Gas1-GFP i Mid2-iRFP nadal gromadziła się w ER zmutowanych komórek sec31-1 po inkubacji w 37°C, a następnie uwalniana w 24°C przez 5 minut (Rysunek 1). Ponieważ Mid2-iRFP jest rozprowadzony na całej błonie ER, a Gas1-GFP jest skoncentrowany i zebrany w nieciągłym obszarze błony ER, ich dystrybucja jest zupełnie inna (Rysunek 1, A do C i Film S1). Ponadto, jak pokazano na rysunku 1D, klaster Gas1-GFP nie zawiera Mid2-iRFP. Wyniki te wskazują, że białka GPI-AP i transbłonowe zostały wcześnie rozdzielone do różnych regionów błony ER. Klaster Gas1-GFP sąsiaduje ze specyficznym receptorem ERES znakowanym białkiem otoczki COPII mCherry'ego, Sec13 (rysunek 1, E i F oraz film S1) (23).
Komórki sec31-1 ekspresują wydzieliny indukowane galaktozą, ceramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zielony) o długim łańcuchu acylowym (C26) oraz białko transbłonowe Mid2-iRFP (TMP, niebieski). To konstruktywne znakowanie ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut, przeniesiono do 24°C i obrazowano za pomocą SCLIM 5 minut później. (A do C) przedstawia reprezentatywny, połączony lub pojedynczy obraz 2D płaszczyzny (A), obraz projekcji 2D 10 przekrojów z (B) lub obraz półkuli komórki 3D z markerami cargo i ERES (C). Podziałka 1 μm (A i B). Jednostką skali jest 0,551 μm (C). Gas1-GFP wykryto w odrębnych regionach lub klastrach ER, podczas gdy Mid2-iRFP wykryto i rozprowadzono w całej błonie ER (C). (D) Wykres przedstawia względną intensywność fluorescencji Gas1-GFP i Mid2-iRFP w klastrze Gas1-GFP wzdłuż białej linii strzałki (po lewej). AU, jednostka arbitralna. (E i F) reprezentują obraz 3D łączący towary i znak ERES. Klastry Gas1-GFP wykryto w pobliżu określonego ERES. Jednostka skali wynosi 0,551 μm. (F) Biała, ciągła strzałka oznacza klaster Gas1-GFP powiązany z ERES. Środkowy i prawy panel pokazują połączony powiększony obraz 3D i obrócony widok wybranego klastra Gas1-GFP.
Ścisły związek przestrzenny pomiędzy klastrem Gas1-GFP i określonym ERES wskazuje, że Gas1-GFP może wejść do selektywnego ERES, co różni się od selektywności wykorzystywanej przez Mid2-iRFP do opuszczenia ER. Aby uwzględnić tę możliwość, określiliśmy ilościowo stosunek ERES tylko dla jednego lub dwóch towarów (Rysunek 2, A do C). Odkryliśmy, że większość ERES (70%) zawiera tylko jeden rodzaj ładunku. Dolny obraz na Rysunku 2C przedstawia dwa typowe przykłady ERES tylko z Gas1-GFP (Rysunek 1) lub tylko z Mid2-iRFP (Rysunek 2). Natomiast około 20% ERES zawiera dwa ładunki, które nakładają się na ten sam obszar. Odkryto, że niektóre ERES (10%) zawierały dwa rodzaje ładunku, ale były one izolowane w wyraźnie różnych obszarach. Dlatego ta analiza statystyczna pokazuje, że po eksporcie ER, GPI-AP Gas1-GFP i ładunek transbłonowy Mid2-iRFP są dzielone na różne ERES (Rysunek 2D). Ta wydajność sortowania jest bardzo zgodna z poprzednią analizą biochemiczną (6) i ustaleniem morfologicznym (7). Możemy również zaobserwować zachowanie poddanego kwarantannie ładunku wchodzącego do ERES (rysunek 2E i film S2). Rysunek 2E pokazuje, że tylko niewielka część Gas1-GFP (panel 3) lub Mid2-iRFP (panel 4) wchodzi do ERES z jednej strony i jest ograniczona do odrębnego obszaru. Panel 5 rysunku 2E pokazuje, że Gas1-GFP i Mid2-iRFP czasami znajdują się w tym samym ERES, ale wchodzą z różnych stron i są skoncentrowane w oddzielnych regionach, które mogą reprezentować różne pęcherzyki COPII. Potwierdziliśmy również, że obserwowane rozdzielenie i klasyfikacja Gas1 GPI-AP opartego na ceramidzie C26 jako selektywnego ERES jest specyficzne, ponieważ inny transbłonowy ładunek wydzielniczy, białko błony plazmatycznej oznaczone GFP Axl2 (27), wykazuje podobne zachowanie do Mid2-iRFP. (rysunek S1 i film S3). Nowo zsyntetyzowany Axl2-GFP jest dystrybuowany przez błonę ER podobnie jak Mid2-iRFP (rysunek S1, A i B) i współlokalizuje się z Mid2-iRFP w większości ERES (rysunek S1, B do D). Panele 1 i 2 na rysunku 1. S1C przedstawiają dwa typowe przykłady ERES, w których dwa ładunki transbłonowe nakładają się na siebie. W takich przypadkach oba towary trafiają do ERES jednocześnie (rysunek S1E, panel 3 i film S3).
Komórki sec31-1 wyrażające wydzieliny indukowane galaktozą, Gas1-GFP (GPI-AP, zielony) i Mid2-iRFP (TMP, niebieski) oraz konstytutywne znakowanie ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) umieszczono w temperaturze 37°C. Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze °C, przeniesiono do 24°C, aby uwolnić blokadę wydzielniczą, i obrazowano za pomocą SCLIM po 20 minutach. (A do C) Reprezentatywne obrazy projekcji 2D (A; pasek skali, 1 μm) lub obrazy półkuli komórki 3D (B i C; jednostka skali, 0,456 μm) ładunku i 10 przekrojów z oznaczonych ERES. Dolny panel w (B) i panel w (C) pokazują przetworzone obrazy, aby wyświetlić tylko towary obecne w ERES (magenta) [Gas1-GFP (szary) i Mid2-iRFP (jasnoniebieski)]. (C) Otwarta strzałka: ERES przewozi tylko jeden ładunek (1 do 4). Szara strzałka: ERES zawiera ładunek posegregowany (5). Biała strzałka ciągła: ERES zawierający ładunek współlokalizowany. Poniżej: Wybrany pojedynczy ERES zawiera tylko Gas1-GFP (1) lub Mid2-iRFP (2). Podziałka: 100 nm. (D) Kwantyfikacja fotomikrografii opisanej w (C). Średni procent ERES zawierającego tylko jeden ładunek (Gas1-GFP lub Mid2-iRFP), ładunek posegregowany i ładunek nakładający się. W trzech niezależnych eksperymentach, n=432 w 54 komórkach. Błąd = SD. Dwustronny niesparowany test t. *** P = 0,0002. (E) Obraz 3D wybranego ERES ładunku poddanego kwarantannie oznaczonego (C). Gas1-GFP (zielony) (3) lub Mid2-iRFP (niebieski) (4) wnikają do ERES (magenta) z jednej strony i są ograniczone do niewielkiego obszaru w obrębie ERES. Czasami oba rodzaje ładunku wnikają do tego samego ERES (5) z tej samej strony i są ograniczone do odizolowanego obszaru w obrębie ERES. Podziałka: 100 nm.
Następnie przetestowaliśmy hipotezę, że długi łańcuch acylowy ceramidu (C26) obecny w błonie ER napędza specyficzne grupowanie i sortowanie Gas1 do selektywnych ERES. W tym celu użyliśmy zmodyfikowanego szczepu drożdży GhLag1, w którym dwie endogenne syntazy ceramidu Lag1 i Lac1 zostały zastąpione przez GhLag1 (homolog Lag1 bawełny), co zaowocowało szczepem drożdży z ceramidem błony komórkowej krótszym niż typ dziki (rysunek 3A) (28). Analiza spektrometrii masowej (MS) wykazała, że ​​w szczepach typu dzikiego 95% całkowitego ceramidu to ceramid o bardzo długim (C26) łańcuchu, podczas gdy w GhLag1 85% ceramidu jest bardzo długie (C18 i C16). ), tylko 2% ceramidu to ceramid o bardzo długim (C26) łańcuchu. Chociaż ceramidy C18 i C16 są głównymi ceramidami wykrytymi do tej pory w błonie GhLag1, analiza MS potwierdziła również, że kotwica GPI Gas1-GFP wyrażona w szczepie GhLag1 zawiera ceramid C26, który jest porównywalny z lipidami typu dzikiego. Jakość jest taka sama (ryc. 3A) (26). Oznacza to zatem, że enzym remodelujący ceramid Cwh43 jest wysoce selektywny dla ceramidu C26, jak pokazano na ryc. 26, preferencyjnie włącza kotwicę GPI z niewielkiej ilości ceramidu C26 w szczepie GhLag1. S2 (29). Niemniej jednak błona komórkowa GhLag1 zasadniczo zawiera tylko ceramid C18-C16, podczas gdy Gas1-GFP nadal zawiera ceramid C26. Fakt ten czyni ten szczep idealnym narzędziem do specyficznego rozwiązania problemu długości łańcucha acylowego ceramidu błonowego w ER. Hipotetyczna rola klasy i sortowania. Następnie najpierw zbadaliśmy zdolność C26 Gas1-GFP do akumulacji w klastrach w GhLag1 z wrażliwym na temperaturę zmutowanym allelem sec31-1 za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej, gdzie tylko długi łańcuch (C18-C16) występuje w ceramidzie błony ER (rys. 3). Zaobserwowaliśmy, że w sec31-1 większość Gas1-GFP była skoncentrowana w klastrach, podczas gdy Gas1-GFP w sec31-1 GhLag1 z długą (C18-C16) ceramidą błony ER nie był głównie skupiony i rozproszony w całej błonie ER. Aby być precyzyjnym, ponieważ klastrowanie oparte na ceramidzie C26 jest ściśle związane ze specyficznymi ERES (rysunek 1), następnie zbadaliśmy, czy ten proces może również obejmować funkcję mechanizmu eksportu białka ER. GPI-AP wykorzystuje specjalny system COPII do eksportu ER, który jest aktywnie regulowany przez strukturalną przebudowę części glikanowej kotwicy GPI przez Ted1 (30, 31). Rekombinowany GPI-glikan jest następnie rozpoznawany przez kompleks receptora ładunku transbłonowego p24, który z kolei selektywnie rekrutuje Lst1, która jest specyficzną izoformą głównej podjednostki wiążącej ładunek COPII Sec24, tworząc bogate w GPI-AP pęcherzyki COPII są niezbędne (31-33). Dlatego skonstruowaliśmy podwójnego mutanta, który łączył delecję tych pojedynczych białek (składnika kompleksu p24 Emp24, enzymu remodelującego GPI-glikan Ted1 i specyficznej podjednostki COPII Lst1) ze szczepem zmutowanym sec31-1 i zbadaliśmy je Czy możliwe jest utworzenie klastra Gas1 GFP (Rysunek 3). Zaobserwowaliśmy, że w sec31-1emp24Δ i sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP jest głównie niesklastrowany i rozproszony w całej błonie ER, jak wcześniej widziano w sec31-1 GhLag1, podczas gdy w sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Podobnie jak sec31-1. Wyniki te wskazują, że oprócz obecności ceramidu C26 w błonie ER, klastrowanie Gas1-GFP musi również wiązać się z kompleksem p24 i nie wymaga specyficznej rekrutacji Lst1. Następnie zbadaliśmy możliwość, że długość łańcucha ceramidu w błonie ER może regulować wiązanie Gas1-GFP do p24. Jednakże odkryliśmy, że obecność ceramidu C18-C16 w błonie nie wpływa na GPI-glikany rekonstruowane przez kompleks p24 (rysunki S3 i S4, A i B) lub wiązanie się z GPI-AP i eksportowanie GPI-AP. zdolność. Recruit COPII subtype Lst1 (rysunek S4C). Zatem klasteryzacja zależna od ceramidu C26 nie wymaga interakcji białkowych z różnymi mechanizmami eksportu białek do ER, ale wspiera alternatywny mechanizm sortowania oparty na długości lipidów. Następnie przeanalizowaliśmy, czy długość łańcucha acylowego ceramidu w błonie ER ma znaczenie dla skutecznej klasyfikacji Gas1-GFP jako selektywnego ERES. Ponieważ Gas1 w szczepie GhLag1 z krótkim łańcuchem ceramidu opuszcza ER i wnika do błony plazmatycznej (rysunek S5), uważamy, że jeśli sortowanie jest napędzane długością łańcucha acylowego ceramidu, Gas1 w szczepie GhLag1 może zostać przekierowany i skrzyżowany. Towary ERES z tą samą błoną.
(A) Błona komórkowa GhLag1 zawiera głównie krótsze ceramidy C18-C16, podczas gdy kotwica GPI Gas1-GFP nadal ma taką samą C26 IPC jak komórki dzikiego typu. Powyżej: analiza długości łańcucha acylowego ceramidu w błonie komórkowej szczepów dzikiego typu (Wt) i GhLag1p metodą spektrometrii masowej (MS). Dane przedstawiają procent całkowitego ceramidu. Średnia z trzech niezależnych eksperymentów. Słupek błędu = SD. Dwustronny test t dla niesparowanych prób. **** P ＜0,0001. Dolny panel: Analiza MS długości łańcucha acylowego IPC obecnego w kotwicy GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) wyrażonej w szczepach dzikiego typu i GhLag1p. Dane przedstawiają procent całkowitego sygnału IPC. Średnia z pięciu niezależnych eksperymentów. Słupek błędu = SD. Dwustronny test t dla niesparowanych prób. ns, nieistotne. P = 0,9134. (B) Mikrofotografie fluorescencyjne komórek sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ i sec31-1lst1Δ wyrażających Gas1-GFP indukowane galaktozą inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut i przekazano do Wykonaj rutynową mikroskopię fluorescencyjną po 24°C. Biała strzałka: Klaster Gas1-GFP w ER. Otwarta strzałka: Niesklastrowany Gas1-GFP jest rozmieszczony na całej błonie ER, pokazując charakterystyczne barwienie pierścienia jądrowego ER. Podziałka 5 μm. (C) Kwantyfikacja mikrofotografii opisanej w (B). Średni odsetek komórek o punktowej strukturze Gas1-GFP. W trzech niezależnych eksperymentach, n ≥ 300 komórek. Błąd = SD. Dwustronny test t dla niesparowanych prób. **** P ＜0,0001.
Aby bezpośrednio rozwiązać ten problem, przeprowadziliśmy wizualizację SCLIM Gas1-GFP i Mid2-iRFP w GhLag1 z allelem sec31-1 wrażliwym na temperaturę (rysunek 4 i film S4). Po zatrzymaniu ER w temperaturze 37°C i późniejszym uwolnieniu w temperaturze 24°C większość nowo syntetyzowanego Gas1-GFP nie była skupiona i rozproszona w błonie ER, jak zaobserwowano za pomocą konwencjonalnych mikroskopów (rysunek 4, A i B). Ponadto duży odsetek ERES (67%) zawiera dwa rodzaje ładunku współlokalizowanego w nim (rysunek 4D). Panele 1 i 2 rysunku 4C przedstawiają dwa typowe przykłady ERES z nakładającymi się Gas1-GFP i Mid2-GFP. Ponadto oba towary zostały zrekrutowane do tego samego ERES (rysunek 4E, panel 3 i film S4). Zatem nasze wyniki wskazują, że długość łańcucha acylowego ceramidu w błonie ER jest ważnym czynnikiem determinującym agregację i klasyfikację białek ER.
Komórki Sec31-1 GhLag1 wyrażające wydzieliny indukowane galaktozą, Gas1-GFP (GPI-AP, zielony) i Mid2-iRFP (TMP, niebieski) oraz konstytutywne znakowane ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) Inkubować w 37°C. Kontynuować przez 30 minut, obniżyć do 24°C, aby uwolnić wydzieliny i obrazować za pomocą SCLIM po 20 minutach. (A do C) Reprezentatywne obrazy projekcji 2D (A; pasek skali, 1 μm) lub obrazy półkuli komórki 3D (B i C; jednostka skali, 0,45 μm) 10 przekrojów z oznaczonych ładunkiem i ERES. Dolny panel w (B) i panel w (C) pokazują przetworzone obrazy, aby wyświetlić tylko towary obecne w ERES (magenta) [Gas1-GFP (szary) i Mid2-iRFP (jasnoniebieski)]. (C) Biała wypełniona strzałka: ERES, nakładające się towary. Otwarta strzałka: ERES zawiera tylko jeden element. Dolny panel: Wybrany ERES ma nakładające się towary (1 i 2) zaznaczone w (C). Podziałka: 100 nm. (D) Kwantyfikacja fotomikrografii opisanej w (C). W jednostkach sec31-1 i sec31-1 GhLag1 uwzględniono tylko jeden ładunek (Gas1-GFP lub Mid2-iRFP) oraz średni procent ERES dla ładunku izolowanego i nakładającego się ładunku. W trzech niezależnych eksperymentach n = 432 w 54 komórkach (sec31-1) i n = 430 w 47 komórkach (sec31-1 GhLag1). Błąd = SD. Dwustronny test t dla prób niezależnych. *** P = 0,0002 (sec31-1) i ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Obraz 3D wybranego ERES z nakładającym się ładunkiem (3) oznaczonym w (C). Gas1-GFP (zielony) i Mid2-iRFP (niebieski) zbliżają się do ERES (magenta) z tej samej strony i pozostają w tym samym obszarze ograniczonym ERES. Podziałka: 100 nm.
Niniejsze badanie dostarcza bezpośrednich dowodów in vivo, że ładunki białkowe oparte na lipidach są klasyfikowane do selektywnych miejsc eksportu w szlaku wydzielniczym i ujawnia znaczenie długości łańcucha acylowego dla selektywności klasyfikacji. Wykorzystując zaawansowaną i nowatorską technikę mikroskopową o nazwie SCLIM, zademonstrowaliśmy nowo zsyntetyzowany Gas1-GFP (główny GPI-AP błony plazmatycznej z bardzo długim łańcuchem acylowym (C26) ceramidowym lipidem) w drożdżach. Regiony skupione w odrębnych ER są powiązane ze specyficznymi receptorami ERES, podczas gdy białka wydzielane przez błonę są rozmieszczone w całej błonie ER (ryc. 1). Ponadto te dwa rodzaje produktów wchodzą do różnych receptorów ERES selektywnie (ryc. 2). Długość łańcucha acylowego ceramidu komórkowego w błonie ulega zmniejszeniu z C26 do C18-C16, klaster Gas1-GFP zostaje rozbity w oddzielnym regionie ER, a Gas1-GFP zostaje przekierowany, aby opuścić ER wraz z białkiem transbłonowym przez ten sam ERES (ryc. 3 i ryc. 3). 4).
Chociaż GPI-AP wykorzystuje wyspecjalizowany mechanizm białkowy do wyjścia z ER, odkryliśmy, że zależna od ceramidu C26 separacja nie opiera się na zróżnicowanych interakcjach białkowych, które mogą prowadzić do specjalizacji ERES (rysunki S4 i S5). Zamiast tego, nasze odkrycia wspierają alternatywny mechanizm klasyfikacji napędzany przez klastrowanie białek oparte na lipidach i późniejsze wykluczanie innych ładunków. Nasze obserwacje wskazują, że region Gas1-GFP lub klaster związany ze specyficznym ERES nie zawiera białka wydzielanego przez błonę Mid2-iRFP, co wskazuje, że zależny od ceramidu C26 klaster GPI-AP ułatwi ich wejście do odpowiedniego ERES, a jednocześnie wykluczy transbłonowe Wydzieliny wchodzą do tego konkretnego ERES (rysunki 1 i 2). Natomiast obecność ceramidów C18-C16 w błonie ER nie powoduje, że GPI-AP tworzy regiony lub klastry, więc nie wykluczają one ani nie zastępują białek wydzielanych przez błonę do tego samego ERES (rysunki 3 i 4). Dlatego też proponujemy, że ceramid C26 odpowiada za separację i klasyfikację poprzez ułatwianie grupowania białek połączonych ze specyficznymi białkami ERES.
Jak osiągnąć to zależne od ceramidu C26 skupienie w określonym obszarze ER? Tendencja ceramidu błonowego do bocznego rozdzielania może powodować, że GPI-AP i ceramid C26 tworzą małe i natychmiastowo uporządkowane lipidy w bardziej nieregularnym środowisku lipidowym błony ER, zawierającym krótsze i nienasycone glicerolipidy. Wysokiej jakości klastry (17, 18). Te małe, tymczasowe klastry mogą być dalej łączone w większe, bardziej stabilne klastry po związaniu z kompleksem p24 (34). Zgodnie z tym wykazaliśmy, że C26 Gas1-GFP musi oddziaływać z kompleksem p24, aby utworzyć większe widoczne klastry (ryc. 3). Kompleks p24 jest heterozygotycznym oligomerem złożonym z czterech różnych białek transbłonowych p24 w drożdżach (35), co zapewnia wiązanie wielowartościowe, które może prowadzić do usieciowania małych klastrów GPI-AP, generując w ten sposób większe, stabilne klastry (34). Interakcja między ektodomenami białkowymi GPI-AP może również przyczyniać się do ich agregacji, co wykazano podczas ich transportu w aparacie Golgiego w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych ssaków (36). Jednakże, gdy ceramid C18-C16 jest obecny w błonie ER, a kompleks p24 wiąże się z Gas1-GFP, nie powstają duże, oddzielne klastry. Podstawowy mechanizm może zależeć od specyficznych właściwości fizycznych i chemicznych ceramidu o długim łańcuchu acylowym. Badania biofizyczne sztucznych membran pokazują, że chociaż zarówno ceramidy o długim (C24), jak i krótkim (C18-C16) łańcuchu acylowym mogą powodować separację faz, tylko ceramidy o długim łańcuchu acylowym (C24) mogą promować wysoką krzywiznę i zginanie filmu, aby zmienić jego kształt. Poprzez wzajemne odniesienie (17, 37, 38). Wykazano, że transbłonowa helisa TMED2, ludzkiego homologa Emp24, selektywnie oddziałuje ze sfingomieliną opartą na ceramidzie C18 w zrazikach cytoplazmatycznych (39). Wykorzystując symulacje dynamiki molekularnej (MD), odkryliśmy, że ceramidy C18 i C26 gromadzą się wokół zrazików cytoplazmatycznych transbłonowej helisy Emp24 i mają podobne preferencje (Rysunek S6). Warto zauważyć, że wskazuje to, iż transbłonowa helisa Emp24 może prowadzić do asymetrycznego rozmieszczenia lipidów w błonie. Jest to niedawny wynik oparty na komórkach ssaczych. Podobne symulacje MD pokazują również obecność lipidów eterowych (40). Dlatego spekulujemy, że ceramid C26 w dwóch zrazikach ER26 jest lokalnie wzbogacony. Bezpośrednie wiązanie GPI-AP w zrazikach światła z wielowartościowym p24 i akumulacja ceramidu C26 wokół p24 w zrazikach cytoplazmatycznych może sprzyjać towarzyszącej temu agregacji białek i krzywiźnie błony komórkowej (41), co powoduje rozdzielenie GPI-AP na odrębne obszary przylegające do ERES, co również sprzyja silnie zakrzywionym obszarom błony ER (42). Wcześniejsze doniesienia potwierdziły proponowany mechanizm (43, 44). Wielowartościowe wiązanie oligolektyn, patogenów lub przeciwciał z glikosfingolipidami na bazie ceramidu (GSL) na błonie plazmatycznej wywołuje dużą agregację GSL, nasila separację faz oraz powoduje deformację i internalizację błony (44). Iwabuchi i inni (43) Stwierdzono, że w obecności długich (C24), ale nie krótkich (C16) łańcuchów acylowych, wielowartościowy ligand związany z laktozyloceramidem GSL indukował tworzenie dużych skupisk i wpuklenie błony, a przekazywanie sygnału przez cytoplazmę za pośrednictwem Lyn na listkach jest przeplatane łańcuchami acylowymi w sprzężonych neutrofilach.
W spolaryzowanych komórkach nabłonka ssaków, stężenie sieci anty-Golgiego (TGN) do poziomu błony wierzchołkowej kontroluje separację i sortowanie GPI-AP (10, 45). Ta agregacja jest napędzana przez oligomeryzację GPI-AP (36), ale może również zależeć od długości łańcucha ceramidu, który znajdujemy w drożdżach. Chociaż ssaczy GPI-AP ma kotwicę opartą na lipidach eterowych, a jego struktura chemiczna jest bardzo różna od bardzo długiego łańcucha acylowego ceramidu, niedawne badanie wykazało, że oba lipidy mają ewolucyjnie podobne właściwości fizyczne i chemiczne oraz funkcję (40). Dlatego część lipidowa eterowa w komórkach ssaków może być podobna do ceramidu C26 w drożdżach, a jej rolą jest łączenie się z długołańcuchowym ceramidem w błonie w celu promowania agregacji i sortowania GPI-AP. Chociaż ta możliwość wciąż wymaga bezpośredniego przetestowania, wcześniejsze odkrycia potwierdzają, że transport ceramidu o długim łańcuchu acylowym do aparatu Golgiego nie odbywa się za pośrednictwem cytoplazmatycznych białek transportujących, lecz zależy od syntezy kotwic GPI, podobnie jak w drożdżach. Zatem ewolucyjnie zachowawczy mechanizm wydaje się być zdolny do selektywnego współtransportu ceramidu o bardzo długim łańcuchu acylowym i GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) w tym samym pęcherzyku transportowym.
W drożdżach i ssaczych spolaryzowanych układach komórek nabłonkowych, agregacja i separacja GPI-AP od innych białek błony plazmatycznej zachodzą przed dotarciem do powierzchni komórki. Paladino i in. (48) stwierdzili, że na TGN ssaczych spolaryzowanych komórek nabłonkowych, klastrowanie GPI-AP jest nie tylko niezbędne do selektywnej klasyfikacji GPI-AP do apikalnej błony plazmatycznej, ale także reguluje organizację klastrowania GPI-AP i jego aktywność biologiczną. Powierzchnia komórki. W drożdżach badanie to wykazało, że zależny od ceramidu C26 klaster GPI-AP na ER może regulować organizację klastrów i aktywność funkcjonalną GPI-AP na błonie plazmatycznej (24, 49). Zgodnie z tym modelem, komórki GhLag1 są uczulone na inhibitory GPI lub leki, które wpływają na integralność ściany komórkowej (28), a potrzeba funkcjonalnych klastrów Gas1-GFP (49) ceramidu szczytowego rzutowanego podczas krycia komórek drożdży wskazuje na G​​​ Możliwe fizjologiczne konsekwencje komórek hLag1. Błąd GPI-AP. Jednak dalsze testy, czy organizacja funkcjonalna powierzchni komórki została zaprogramowana z siateczki śródplazmatycznej (ER) metodą sortowania opartą na długości lipidów, będą przedmiotem naszych przyszłych badań.
Szczepy Saccharomyces cerevisiae użyte w tej pracy wymieniono w tabeli S1. Szczepy MMY1583 i MMY1635 SCLIM do obrazowania żywych komórek skonstruowano na podłożu W303. Te szczepy ekspresujące Sec13-mCherry z fluorescencyjnym znacznikiem białkowym skonstruowano metodą opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z plazmidem pFA6a jako matrycą (23). Szczep ekspresujący Mid2-iRFP znakowany białkiem fluorescencyjnym pod kontrolą promotora GAL1 skonstruowano w następujący sposób. Amplifikacja PCR sekwencji iRFP-KanMx z wektora pKTiRFP-KAN (dar E. O'Shea, numer plazmidu Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identyfikator zasobu badawczego (RRID): Addgene_64687) i wstawienie do C-końca endogennego Mid2. Po amplifikacji i sklonowaniu sekwencji genomu Mid2-iRFP do promotora GAL1, została ona zintegrowana z miejscem Not I-Sac I plazmidu integracyjnego pRS306. Powstały plazmid pRGS7 został zlinearyzowany z Pst I w celu integracji z miejscem URA3.
Gen fuzyjny Gas1-GFP jest wyrażany pod kontrolą promotora GAL1 w plazmidzie centromeru (CEN), który jest skonstruowany w następujący sposób. Sekwencję Gas1-GFP amplifikowano metodą PCR z plazmidu pRS416-GAS1-GFP (24) (dar L. Popolo) i sklonowano w miejscu Xma I–Xho I plazmidu CEN pBEVY-GL LEU2 (dar C). Miller; numer plazmidu Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Powstały plazmid nazwano pRGS6. Gen fuzyjny Axl2-GFP jest również wyrażany pod kontrolą promotora GAL1 wektora pBEVY-GL LEU2, a jego konstrukcja jest następująca. Sekwencję Axl2-GFP zamplifikowano z plazmidu pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) metodą PCR i sklonowano w miejscu Bam HI-Pst I wektora pBEVY-GL LEU2. Powstały plazmid nazwano pRGS12. Sekwencję oligonukleotydów użytych w tym badaniu przedstawiono w tabeli S2.
Szczep uzupełniono 0,2% adeniny i 2% glukozy [YP-dekstroza (YPD)], 2% rafinozą [YP-rafinoza], bogatym w białko ekstraktem drożdżowym (YP) medium (1% ekstrakt drożdżowy i 2% białko ept). (YPR)] lub 2% galaktozą [YP-galaktoza (YPG)] jako źródłem węgla lub w syntetycznym medium minimalnym (0,15% drożdżowej zasady azotowej i 0,5% siarczanu amonu) w celu uzupełnienia odpowiednich aminokwasów i zasad wymaganych do odżywiania, zawierającym 2% glukozy (syntetyczne medium minimalne z glukozą) lub 2% galaktozy (syntetyczne medium minimalne z galaktozą) jako źródło węgla.
Do obrazowania w czasie rzeczywistym, wrażliwe na temperaturę komórki mutanta sec31-1 z ekspresją konstruktu pod wpływem promotora GAL1 hodowano w pożywce YPR w temperaturze 24°C przez noc do osiągnięcia fazy środkowej logarytmicznej. Po indukcji w YPG w temperaturze 24°C przez 1 godzinę, komórki inkubowano w SG w temperaturze 37°C przez 30 minut, a następnie przeniesiono do 24°C w celu uwolnienia z bloku wydzielniczego. Konkanawalina A została użyta do utrwalenia komórek na szkiełku podstawowym i obrazowania metodą SCLIM. SCLIM to połączenie odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Olympus IX-71 i obiektywu olejowego UPlanSApo 100×1,4 o aperturze numerycznej (Olympus), szybkiego skanera konfokalnego z wirującym dyskiem o wysokim stosunku sygnału do szumu (Yokogawa Electric), niestandardowego spektrometru i niestandardowego chłodzenia. Wzmacniacz obrazu systemu (Hamamatsu Photonics) może zapewnić układ soczewek powiększających o końcowym powiększeniu ×266,7 oraz kamerę z urządzeniem o sprzężeniu ładunkowym, która mnoży elektrony (Hamamatsu Photonics) (21). Akwizycja obrazu jest wykonywana przez niestandardowe oprogramowanie (Yokogawa Electric). W przypadku obrazów 3D użyliśmy niestandardowego siłownika piezoelektrycznego do wibracji obiektywu w pionie i zebraliśmy części optyczne w stosie co 100 nm. Obraz stosu Z jest konwertowany na dane wokselowe 3D, a teoretyczna funkcja rozproszenia punktów używana w mikroskopie konfokalnym z obrotowym dyskiem jest wykorzystywana do przetwarzania dekonwolucji przez oprogramowanie Volocity (PerkinElmer). Wykorzystując oprogramowanie Volocity do automatycznego progu dla analizy kolokacji, zmierzono ERES, w tym ładunek. Analizę skanowania liniowego przeprowadzono za pomocą oprogramowania MetaMorph (Molecular Devices).
Użyj oprogramowania GraphPad Prism do określenia istotności statystycznej. W przypadku dwustronnego testu t-Studenta i standardowego testu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), różnice między grupami uznaje się za mające istotny wpływ na p <0,05 (*).
Do mikroskopii fluorescencyjnej Gas1-GFP komórki w fazie logarytmicznej hodowano przez noc w YPD, a następnie zebrano przez wirowanie, przemyto dwukrotnie buforowanym roztworem soli fizjologicznej fosforanowej i inkubowano na lodzie przez co najmniej 15 minut, a następnie poddano obróbce mikroskopowej zgodnie z wcześniejszym opisem (24). Do akwizycji użyto mikroskopu Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/olej 1,40 PH3 CS) wyposażonego w obiektyw, filtr L5 (GFP), kamerę Hamamatsu i oprogramowanie Application Suite X (LAS X).
Próbki denaturowano buforem SDS w temperaturze 65°C przez 10 minut, a następnie rozdzielono metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS (PAGE). Do analizy immunoblottingowej na każdą ścieżkę nanoszono 10 μl próbki. Przeciwciało pierwszorzędowe: Zastosowano królicze przeciwciało poliklonalne anty-Gas1 w rozcieńczeniu 1:3000, królicze przeciwciało poliklonalne anty-Emp24 w rozcieńczeniu 1:500 oraz królicze przeciwciało poliklonalne anty-GFP (dar od H. Riezmana) w rozcieńczeniu 1:3000. Mysie przeciwciało monoklonalne anty-Pgk1 zastosowano w rozcieńczeniu 1:5000 (dar od J. de la Cruz). Przeciwciało drugorzędowe: Kozia immunoglobulina G (IgG) sprzężona z peroksydazą chrzanową (HRP) w rozcieńczeniu 1:3000 (Pierce). Zastosowano sprzężone z HRP przeciwciała kozie antymysie IgG w rozcieńczeniu 1:3000 (Pierce). Strefę odpowiedzi immunologicznej obserwowano metodą chemiluminescencji z użyciem odczynnika SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Jak opisano w (31), przeprowadzono eksperyment naturalnej immunoprecypitacji na wzbogaconej frakcji ER. W skrócie, przemyto komórki drożdży buforem TNE [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu i mieszaniny inhibitorów proteazy] przy 600 nm (OD600) przy gęstości optycznej 100 dwukrotnie. Rozbito go za pomocą szklanych kulek, a następnie resztki komórek i szklane kulki usunięto przez wirowanie. Supernatant wirowano następnie przy 17 000 g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Osad ponownie zawieszono w TNE i dodano saponinę naparstnicy do końcowego stężenia 1%. Zawiesinę inkubowano przez 1 godzinę z wirowaniem w temperaturze 4°C, a następnie usunięto nierozpuszczalne składniki przez wirowanie przy 13 000 g w temperaturze 4°C przez 60 minut. W przypadku immunoprecypitacji Gas1-GFP, próbkę należy najpierw wstępnie inkubować z pustymi kulkami agarozowymi (ChromoTek) w temperaturze 4°C przez 1 godzinę, a następnie inkubować z GFP-Trap_A (ChromoTek) w temperaturze 4°C przez 3 godziny. Immunoprecypitowane kulki przemyto pięciokrotnie roztworem TNE zawierającym 0,2% digoksygeniny, eluowano buforem do próbek SDS, rozdzielono na elektroforezie SDS-PAGE i przeanalizowano metodą immunoblottingu.
Jak opisano w (31), przeprowadzono oznaczenie sieciowania na wzbogaconej frakcji ER. W skrócie, wzbogaconą frakcję ER inkubowano z 0,5 mM ditiobis(sukcynimidylopropionianu) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). Reakcję sieciowania zatrzymano przez dodanie glicyny (50 mM stężenia końcowego, 5 minut, 20°C).
Jak opisano wcześniej (50), przeprowadzono analizę MS ceramidu w szczepach dzikiego typu i GhLag1. W skrócie, komórki hodowano do fazy wykładniczej (3 do 4 jednostek OD600/ml) w YPD w temperaturze 30°C i zebrano 25×107 komórek. Ich metabolizm został zahamowany kwasem trichlorooctowym. Do ekstrakcji użyto rozpuszczalnika [etanolu, wody, eteru, pirydyny i 4,2 N wodorotlenku amonu (15:15:5:1:0,018 v/v)] oraz 1,2 nmola wewnętrznego wzorca ceramidu C17 (860517, jakość polar lipid Avanti). Do przeprowadzenia łagodnej hydrolizy alkalicznej ekstraktu użyto odczynnika monometyloaminowego [metanolu, wody, n-butanolu i roztworu metyloaminy (4:3:1:5 v/v)], a następnie do odsalania użyto nasyconego wodą n-butanolu. Na koniec ekstrakt zawieszono w rozpuszczalniku w trybie dodatnim [chloroform/metanol/woda (2:7:1) + 5 mM octanu amonu] i wstrzyknięto do spektrometru mas. W celu identyfikacji i kwantyfikacji cząsteczek sfingolipidów przeprowadzono monitorowanie wieloreakcyjne (MRM). Spektrometr masowy TSQ Vantage z trzeciorzędowym kwadrupolem (Thermo Fisher Scientific) jest wyposażony w robotyczne źródło jonów Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) do analizy lipidów. Energia zderzeń jest optymalizowana dla każdej kategorii ceramidów. Dane MS uzyskano w trybie dodatnim. Dla każdej replikacji biologicznej sygnał lipidowy jest medianą z trzech niezależnych pomiarów.
Jak opisano w (31), komórki (800×107) wyrażające Gas1-GFP poddano naturalnej immunoprecypitacji. Oczyszczony Gas1-GFP rozdzielono metodą SDS-PAGE i przeniesiono na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF). Białko uwidoczniono przez barwienie PVDF czernią amidową. Pasmo Gas1-GFP wycięto z PVDF i przemyto 5 razy metanolem i raz wodą o jakości chromatografii cieczowej-MS (LC-MS). Inkubując pasek membrany z 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buforem i 500 μl świeżo rozpuszczonej 1 M mieszaniny azotynu sodu w temperaturze 37°C przez 3 godziny, frakcja lipidowa została uwolniona z Gas1-GFP i zlizyzowana Uwalnianie ceramidu fosforanu inozyny pomiędzy glukozaminą i inozytolem (51). Następnie pasek membrany przemyto czterokrotnie wodą o jakości LC-MS, wysuszono w temperaturze pokojowej i przechowywano w atmosferze azotu w temperaturze -80°C do momentu analizy. Jako kontrolę w każdym eksperymencie użyto pustej próbki membrany PVDF. Lipid wyekstrahowany z Gas1-GFP analizowano następnie metodą MS, jak opisano (50). W skrócie, paski PVDF zawierające lipid GPI zawieszono ponownie w 75 μl ujemnego rozpuszczalnika do pleśni [chloroform/metanol (1:2) + 5 mM octanu amonu] i poddano analizie sfingolipidów metodą elektrorozpylania (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). W tym przypadku dane MS uzyskano w trybie jonów ujemnych.
Jak wspomniano wcześniej, lipidowa część kotwicy GPI została oddzielona od GPI-AP znakowanego [3H]-inozytolem (16). Lipidy rozdzielono metodą chromatografii cienkowarstwowej z użyciem układu rozpuszczalników (55:45:10 chloroform-metanol-0,25% KCl) i uwidoczniono za pomocą FLA-7000 (Fujifilm).
Komórki wyrażające Gas1-GFP (600×107) przemyto dwukrotnie buforem TNE i rozbito szklanymi kulkami, a następnie wirowano w celu usunięcia resztek komórek i szklanych kulek. Supernatant wirowano następnie z prędkością 17000 g przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Osad przemyto w TNE i inkubowano z 1 U PI-PLC (Invitrogen) w TNE zawierającym 0,2% saponiny naparstnicy przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po obróbce enzymatycznej membranę usunięto przez wirowanie z prędkością 17000 g w temperaturze 4°C przez 1 godzinę. W celu immunoprecypitacji Gas1-GFP, supernatant inkubowano z GFP-Trap_A (ChromoTek) w temperaturze 4°C przez noc. Oczyszczony Gas1-GFP oddzielony metodą SDS-PAGE barwiono błękitem brylantowym Coomassie. Pasmo barwienia Gas1-GFP odcięto od szarej warstwy otaczającej akwedukt, a następnie po alkilacji jodoacetamidem i redukcji ditiotreitolem przeprowadzono trawienie w żelu trypsyną. Wyekstrahowano i wysuszono peptydy trypsynowe oraz peptydy z GPI-glikanami. Wysuszony peptyd rozpuszczono w 20 μl wody. Wstrzyknięto porcję (8 μl) do chromatografii cieczowej (LC). Do rozdziału peptydów w określonych warunkach gradientu użyto kolumny oktadecylosilanowej (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; średnica wewnętrzna 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, prefektura Aichi, Japonia). Fazę ruchomą stanowi rozpuszczalnik A (0,08% kwas mrówkowy) i rozpuszczalnik B (0,15% kwas mrówkowy w 80% acetonitrylu). Do elucji kolumny rozpuszczalnikiem A w ciągu 55 minut przy szybkości przepływu 50 μl min-1 przez 5 minut użyto systemu Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts), a następnie stężenie rozpuszczalnika B zwiększono do 40%. Eluat był w sposób ciągły wprowadzany do źródła jonów ESI, a peptydy tryptyczne i peptydy z glikozaminoglikanowymi (GPI) analizowano za pomocą LTQ Orbitrap XL (hybrydowy liniowy spektrometr masowy z pułapką jonową i orbitrapem; Thermo Fisher Scientific). W układzie MS napięcie źródła kapilary ustawiono na 4,5 kV, a temperaturę kapilary transferowej utrzymywano na poziomie 300°C. Napięcie kapilary i napięcie soczewki lampy ustawiono odpowiednio na 15 V i 50 V. Dane MS uzyskano w trybie jonów dodatnich (rozdzielczość 60 000, dokładność pomiaru masy 10 części na milion) w zakresie mas 300/m/z, stosunek masy do ładunku (m/z) 3000. Dane MS/MS uzyskano za pomocą pułapki jonowej w LTQ Orbitrap XL [pierwsze 3 cyfry, od których zależą dane, to dysocjacja indukowana kolizją (CID)].
Symulacje MD przeprowadzono przy użyciu oprogramowania GROMACS (52) i pola siłowego MARTINI 2 (53-55). Następnie użyto CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) do skonstruowania dwuwarstwy zawierającej dioleoilofosfatydylocholinę (DOPC) i Cer C18 lub DOPC i Cer C26. Topologia i współrzędne Cer C26 pochodzą z DXCE poprzez usunięcie dodatkowych kulek z ogona sfingozyny. Użyj procesu opisanego poniżej, aby zrównoważyć warstwę podwójną i uruchomić ją, a następnie użyj ostatnich współrzędnych systemu, aby zbudować system zawierający Emp24. Domenę transbłonową drożdżowego Emp24 (reszty 173 do 193) skonstruowano jako α-helisę przy użyciu narzędzia wizualnego MD (VMD) do analizy struktury molekularnej (58). Następnie, po usunięciu nakładających się lipidów, białko zostało grubo zgranulowane i wstawione do dwuwarstwy przy użyciu CHARMM GUI. Ostateczny układ zawiera 1202 DOPC i 302 Cer C26 lub 1197 DOPC i 295 Cer C18 oraz Emp24. Zjonizuj układ do stężenia 0,150 M. Wykonano cztery niezależne powtórzenia dla dwóch kompozycji dwuwarstwowych.
Dwuwarstwa lipidowa jest równoważona za pomocą procesu CHARMM GUI, który obejmuje minimalizację, a następnie równoważenie 405 000 kroków, w których ograniczenia położenia są stopniowo zmniejszane i eliminowane, a krok czasowy zwiększany z 0,005 ps do 0,02 ps. Po osiągnięciu równowagi, generuje 6 µs z krokiem czasowym 0,02 ps. Po wstawieniu Emp24, użyj tego samego procesu CHARMM GUI, aby zminimalizować i zrównoważyć system, a następnie uruchom go na 8 s w trybie produkcyjnym.
We wszystkich układach, podczas procesu wyważania, ciśnienie jest kontrolowane przez barostat Berendsena (59), a podczas procesu produkcyjnego przez barostat Parrinello-Rahmana (60). We wszystkich przypadkach średnie ciśnienie wynosi 1 bar, a stosowany jest półizotropowy schemat sprzężenia ciśnienia. W procesie wyważania i produkcji termostat (61) z rekalibracją prędkości jest używany do sprzężenia temperatury odpowiednio cząstek białka, lipidu i rozpuszczalnika. Podczas całej operacji temperatura docelowa wynosi 310 K. Oddziaływanie niewiążące jest obliczane poprzez wygenerowanie listy parowania przy użyciu schematu Verleta z tolerancją bufora 0,005. Człon Coulomba jest obliczany przy użyciu pola reakcji i odległości odcięcia 1,1 nm. Człon Vander Waalsa wykorzystuje schemat odcięcia z odległością odcięcia 1,1 nm, a schemat odcięcia Verleta jest używany do dryftu potencjału (62).
Za pomocą VMD, granica długości fali między kulkami fosforanowymi DOPC lub ceramidowymi AM1 a białkiem wynosi 0,7 nm, a następnie obliczana jest liczba lipidów oddziałujących z białkiem. Zgodnie z poniższym wzorem, oblicz współczynnik zubożenia-wzbogacenia (DE), jak w równaniu (63): Współczynnik DE = (całkowita ilość lipidów w białku 0,7) w białku 0,7 (ilość Cer w całkowitych lipidach)
Podana wartość jest uzyskiwana jako średnia, a słupki błędów stanowią cztery niezależne kopie błędu standardowego (SE). Istotność statystyczną współczynnika DE oblicza się za pomocą testu t [(średni współczynnik DE-1)/SE]. Oblicz wartość p na podstawie rozkładu jednostronnego.
Narzędzie GROMACS zostało użyte do obliczenia dwuwymiarowej mapy gęstości bocznej układu zawierającego Emp24 w ciągu ostatnich 250 ns śladu. Aby uzyskać mapę wzbogacenia/zubożenia ceramidu, mapę gęstości Cer podzielono przez sumę mapy Cer i DOPC, a następnie podzielono przez stężenie Cer w organizmie. Zastosowano tę samą skalę mapy kolorów.
Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć na stronie http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Niniejszy artykuł jest udostępniany w otwartym dostępie na warunkach licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne, która zezwala na używanie, rozpowszechnianie i reprodukcję w dowolnym medium, pod warunkiem, że ostateczne wykorzystanie nie ma na celu osiągnięcia korzyści komercyjnych, a założeniem jest, że oryginalne dzieło jest poprawne. Źródło.
Uwaga: Prosimy o podanie adresu e-mail tylko po to, aby osoba, którą polecasz na stronie, wiedziała, że ​​chcesz, aby otrzymała wiadomość e-mail i że nie jest to spam. Nie będziemy przechwytywać żadnych adresów e-mail.
To pytanie służy do sprawdzenia, czy jesteś gościem, i zapobiegania automatycznemu wysyłaniu spamu.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Trójwymiarowe obrazowanie o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym ujawnia, jak istotna jest długość łańcucha ceramidowego dla sortowania białek w selektywnych miejscach wyjściowych.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Trójwymiarowe obrazowanie o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym ujawnia, jak istotna jest długość łańcucha ceramidowego dla sortowania białek w selektywnych miejscach wyjściowych.
©2020 Amerykańskie Stowarzyszenie na rzecz Postępu Nauki. wszelkie prawa zastrzeżone. AAAS jest partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.