W Twojej przeglądarce wyłączona jest obsługa JavaScript. Niektóre funkcje tej witryny nie będą działać, gdy obsługa JavaScript będzie wyłączona.
Zarejestruj się, podając swoje szczegółowe dane i konkretny lek, który Cię interesuje, a my dopasujemy podane przez Ciebie informacje do artykułów w naszej obszernej bazie danych i niezwłocznie wyślemy Ci kopię w formacie PDF na adres e-mail.
Granulki Ban-Lan-Gen łagodzą przewlekłe nawracające zapalenie jelit wywołane siarczanem sodu dekstranu u myszy poprzez modulację mikrobiomu jelitowego i przywrócenie produkcji GLP-1 pochodzącego z SCFA w jelitach
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Szpital Uniwersytetu Pekińskiego w Shenzhen, Wydział Farmacji, Shenzhen, Chińska Republika Ludowa; 2Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu w Shenzhen, Wydział Farmacji, Shenzhen, Chińska Republika Ludowa; 3Centrum Badań Technologii Inżynieryjnych Uniwersytetu Medycznego w Guizhou, Rozwój i Zastosowanie Medycyny Etnicznej i Tradycyjnej Medycyny Chińskiej, Ministerstwo Edukacji, Kluczowe Laboratorium Farmacji Prowincji Guizhou, Uniwersytet Medyczny w Guizhou, Guiyang, Chińska Republika Ludowa; 4Wydział Gastroenterologii, Szpital Uniwersytetu Pekińskiego w Shenzhen, Shenzhen, Chińska Republika Ludowa; 5Wydział Farmacji, Uniwersytet Medyczny w Guizhou, Państwowe Kluczowe Laboratorium Funkcji i Zastosowań Roślin Leczniczych, Guiyang; 6 Wydział Medycyny Laboratoryjnej, Szpital Uniwersytetu Pekińskiego w Shenzhen, Shenzhen, Chiny [email protected] Shen Xiangchun, Wydział Farmacji, Uniwersytet Medyczny w Guizhou, Guizhou, Chińska Republika Ludowa, 550004, E-mail [email protected] Cel: Terapia oparta na GLP-1 jest nową opcją leczenia choroby zapalnej jelit. Granulki Ban-Lan-Gen (BLG) to znany preparat TCM o działaniu przeciwwirusowym, który wykazuje potencjalne działanie przeciwzapalne w leczeniu różnych stanów zapalnych. Jednak jego działanie przeciwzapalne na zapalenie okrężnicy i mechanizm działania są nadal niejasne. METODY: Aby ustalić przewlekłe nawracające zapalenie okrężnicy wywołane siarczanem sodu dekstranu (DSS) u myszy. Przeprowadzono badania wskaźników aktywności choroby, histologicznych markerów uszkodzenia i poziomów cytokin prozapalnych w celu oceny ochronnego działania BLG. Wpływ BLG na mikrobiotę jelitową i jelita scharakteryzowano na podstawie poziomów GLP-1 w surowicy i ekspresja Gcg, GPR41 i GRP43 w jelicie grubym, skład mikrobiomu jelitowego, poziom SCFA w kale oraz uwalnianie GLP-1 z pierwotnych komórek nabłonka jelita grubego u myszy, produkcja GLP-1 pochodzącego z SCFA. Wyniki: Leczenie BLG znacząco zmniejszyło utratę masy ciała, DAI, skrócenie jelita grubego, uszkodzenie tkanki jelita grubego oraz poziomy prozapalnych cytokin TNF-α, IL-1β i IL-6 w tkance jelita grubego. Ponadto leczenie BLG może znacząco przywrócić ekspresję Gcg, GPR41 i GRP43 w jelicie grubym oraz poziomy GLP-1 w surowicy u myszy z zapaleniem jelita grubego, a także poprzez zwiększenie bakterii produkujących SCFA, takich jak Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, oraz zmniejszenie liczebności bakterii, takich jak Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas i Oscillibacter. Ponadto leczenie BLG może znacząco zwiększyć poziom SCFA w kale myszy z zapaleniem jelita grubego. Jednocześnie eksperymenty in vitro wykazały również, że ekstrakt kałowy myszy leczonych BLG może znacznie stymulować wydzielanie GLP-1 przez pierwotne małe komórki nabłonka jelita grubego myszy. Wnioski: Odkrycia te sugerują, że BLG ma działanie przeciw zapaleniu jelita grubego. BLG ma potencjał, aby rozwinąć się jako terapia, przynajmniej częściowo poprzez modulację mikrobiomu jelitowego i przywrócenie produkcji GLP-1 pochodzącego z SCFA w jelitach Obiecujące leki na przewlekłe nawracające zapalenie jelita grubego. Słowa kluczowe: zapalenie jelita grubego, granulki Ban-Lan-Gen, mikrobiota jelitowa, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, GLP-1
Wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC) to przewlekła choroba zapalna okrężnicy i odbytnicy charakteryzująca się nawracającą biegunką, bólem brzucha, utratą masy ciała i krwawymi stolcami z zawartością śluzu i ropą.1 Ostatnio częstość występowania UC wzrosła w krajach o dotychczas niskiej zapadalności, w tym w Chinach, wraz ze wzrostem popularności zachodniego stylu życia.2 Ten wzrost stwarza poważne problemy dla zdrowia publicznego i ma poważne implikacje dla zdolności pacjentów do pracy i jakości życia. Co istotne, patogeneza UC pozostaje w dużej mierze niejasna, ale ogólnie przyjmuje się, że genetyka, czynniki środowiskowe, mikrobiota jelitowa i układ odpornościowy przyczyniają się do rozwoju UC.3 Nawet teraz nie ma lekarstwa na UC, a celem leczenia jest kliniczna kontrola objawów klinicznych, indukowanie i utrzymywanie remisji, wspomaganie gojenia błony śluzowej i zmniejszanie nawrotów. Klasyczne metody leczenia obejmują aminosalicylany, kortykosteroidy, leki immunosupresyjne i leki biologiczne. Jednak leki te nie mogą osiągnąć pożądanego efektu ze względu na ich różne działania niepożądane efekty.4 Ostatnio wiele badań przypadków wykazało, że tradycyjna medycyna chińska (TCM) ma duży potencjał w łagodzeniu WZJG przy niskiej toksyczności, co sugeruje, że rozwój nowych terapii TCM jest obiecującą strategią leczenia WZJG.5-7​​​
Granulki Banlangen (BLG) to tradycyjny chiński preparat medyczny wytwarzany z wodnego ekstraktu korzenia Banlangen.8 Oprócz skuteczności przeciwwirusowej BLG wykazuje potencjalną aktywność przeciwzapalną w leczeniu różnych stanów zapalnych.9,10 Ponadto glukozynolany (R,S-goitryna, progoitryna, epiprorubina i glukozyd zostały wyizolowane i zidentyfikowane z wodnych ekstraktów Radix isatidis) i nukleozydy (hipoksantyna, adenozyna, urydyna i guanozyna) oraz alkaloidy indygo, takie jak indygo i indyrubina.11,12 Poprzednie badania dobrze udokumentowały, że związki adenozyna, urydyna i indyrubina wykazują silne działanie przeciw zapaleniu okrężnicy w różnych zwierzęcych modelach zapalenia okrężnicy.13-17 Jednakże nie przeprowadzono żadnych badań opartych na dowodach, aby ocenić skuteczność BLG w zapaleniu okrężnicy. W niniejszym badaniu zbadaliśmy ochronny wpływ BLG na przewlekłe nawracające zapalenie jelita grubego wywołane siarczanem sodu dekstranu (DSS) u myszy C57BL/6 i stwierdzono, że doustne podanie BLG znacząco osłabiło przewlekłe nawracające zapalenie jelita grubego wywołane DSS u myszy. Zapalenie, jego mechanizmy regulacyjne są związane z modulacją mikrobioty jelitowej i przywróceniem produkcji glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1) pochodzącego z jelit.
Granulki BLG (bez cukru, zatwierdzone przez NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pekin, Chiny; numer partii: 20110966) zakupiono w aptekach. DSS (masa cząsteczkowa: 36 000–50 000 daltonów) zakupiono w MP Biologicals (Santa Ana, USA). Sulfasalazynę (SASP) (≥ 98% czystości), hematoksylinę i eozynę zakupiono w Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Zestawy do testów ELISA dla myszy TNF-α, IL-1β i IL-6 luminex zakupiono w R&D systems (Minneapolis, MN, USA). Kwas octowy, kwas propionowy i kwas masłowy zakupiono w Aladdin Industries (Szanghaj, Kwas 2-etylomasłowy zakupiono od firmy Merck KGaA (Darmstadt, Niemcy).
Samce myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni (masa ciała 18-22 g) zakupiono od Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pekin, Chiny) i przetrzymywano w środowisku o temperaturze 22 ± 2 °C z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności. Myszy karmiono standardową dietą dla gryzoni z wolnym dostępem do wody pitnej przez tydzień, aby przyzwyczaiły się do nowego środowiska. Następnie myszy podzielono losowo na cztery grupy: grupę kontrolną, grupę modelową DSS, grupę leczoną SASP (200 mg/kg, doustnie) i grupę leczoną BLG (1 g/kg, doustnie). Jak pokazano na rysunku 1A, zgodnie z naszymi poprzednimi badaniami, eksperymentalne przewlekłe nawracające zapalenie jelit wywołano u myszy trzema cyklami 1,8% DSS przez 5 dni, a następnie wodą destylowaną przez 7 dni, zgodnie z naszymi poprzednimi badaniami.18 Myszy w grupach leczonych SASP i BLG leczono SASP i BLG, odpowiednio, każdego dnia, począwszy od dnia 0. Zgodnie ze wstępnymi eksperymentami, dawka BLG została ustalona na 1 g/kg. Tymczasem dawka SASP została ustalona na 200 mg/kg, zgodnie z literaturą.4 Grupa kontrolna i grupa modelu DSS otrzymywały taką samą objętość wody przez cały okres trwania eksperymentu.
Rycina 1 BLG łagodzi przewlekłe nawracające zapalenie okrężnicy wywołane przez DSS u myszy. (A) Projekt eksperymentalny przewlekłego nawracającego zapalenia okrężnicy i leczenie, (B) zmiana masy ciała, (C) wynik indeksu aktywności choroby (DAI), (D) długość jelita grubego, (E) reprezentatywny obraz jelita grubego, (F) barwienie H&E jelita grubego (powiększenie ×100) i (G) wynik histologiczny. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 lub ###p < 0,001 w porównaniu z grupą kontrolną (Con); *p < 0,05 lub **p < 0,01 lub ***p < 0,001 w porównaniu z grupą DSS.
Codziennie odnotowywano masę ciała, konsystencję stolca i krwawienie z odbytu. Wskaźnik aktywności choroby (DAI) określono poprzez połączenie wyników masy ciała, konsystencji stolca i krwawienia z odbytu, jak opisano wcześniej.19 Po zakończeniu eksperymentu wszystkie myszy uśpiono, a krew, kał i jelito grube pobrano do dalszych eksperymentów.
Tkankę jelita grubego utrwalono w formalinie i zatopiono w parafinie. Wykonano skrawki o grubości 5 mikronów, barwiono je hematoksyliną i eozyną (H&E), a następnie zaślepiono i oceniono w sposób opisany wcześniej.19
Całkowity RNA z tkanki jelita grubego wyekstrahowano odczynnikiem Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia), a następnie przeprowadzono ekstrakcję cDNA za pomocą odwrotnej transkryptazy (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japonia). Ilościową reakcję PCR przeprowadzono przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym z systemem SYBR Green Master (Roche, Bazylea, Szwajcaria). Transkrypty genu docelowego znormalizowano do β-aktyny, a dane analizowano metodą 2-ΔΔCT. Sekwencje starterów genu przedstawiono w tabeli 1.
Izolację i hodowlę pierwotnych komórek nabłonka jelita grubego myszy przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem.20 W skrócie, jelita grube 6-8 tygodniowych myszy wycięto po uśmierceniu przez zwichnięcie szyi, a następnie otwarto wzdłużnie, potraktowano zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS, bez wapnia i magnezu) i pocięto na kawałki o wielkości 0,5-1 mm. Następnie tkanki strawiono 0,4 mg/ml kolagenazy XI (Sigma, Poole, Wielka Brytania) w wolnym podłożu DMEM i wirowano przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić ponownie osad w podłożu DMEM (uzupełnionym 10% surowicy płodowej bydlęcej, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 µg/ml streptomycyny) w temperaturze 37 °C i przepuścić przez siatkę nylonową (wielkość porów ~250 µm). Alikwoty jelita grubego Komórki nabłonkowe umieszczono w naczyniach o szklanym dnie i inkubowano z kwasem octowym, kwasem propionowym, kwasem masłowym i wyciągami z kału myszy przez 2 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO2.
Tkankę jelita grubego zhomogenizowano z PBS, a poziomy cytokin IL-6, TNF-α i IL-1β w tkance jelita grubego oznaczano przy użyciu zestawów ELISA Luminex (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Podobnie, poziomy GLP-1 w surowicy i podłożu hodowlanym pierwotnych mysich komórek nabłonka jelita grubego oznaczano przy użyciu zestawu ELISA (Bioswamp, Wuhan, Chiny) zgodnie z instrukcją producenta.
Całkowite DNA z kału wyekstrahowano przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA (Tiangen, Chiny). Jakość i ilość DNA mierzono odpowiednio w stosunkach 260 nm/280 nm i 260 nm/230 nm. Następnie, używając każdego wyekstrahowanego DNA jako matrycy, zastosowano specyficzne startery 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) i 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) do amplifikacji regionów V3-V4 genu 16S rRNA w różnych regionach. Produkty PCR oczyszczono przy użyciu zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Niemcy), określono ilościowo metodą PCR w czasie rzeczywistym i zsekwencjonowano przy użyciu platformy sekwencjonowania IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., Kalifornia, USA). Do analizy bioinformatycznej przetwarzanie danych przeprowadzono zgodnie z wcześniej zgłoszonymi protokołami.21,22 Krótko mówiąc, użyj Cutadapt (wersja 1.9.1) do filtrowania surowych plików ekspresowych. Jednostki OTU zostały pogrupowane przy użyciu UPARSE (wersja 7.0.1001) z progiem podobieństwa wynoszącym 97%, a do usunięcia sekwencji chimerycznych zastosowano UCHIME. Analizę składu społeczności i klasyfikację przeprowadzono przy użyciu klasyfikatora RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) opartego na bazie danych genów rybosomalnego RNA SILVA.
Poziomy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (kwas octowy, kwas propionowy i kwas masłowy) mierzono zgodnie z wcześniejszym opisem Tao i in., z pewnymi modyfikacjami.23 W skrócie, 100 mg kału najpierw zawieszono w 0,4 ml dejonizowanej wody, następnie w 0,1 ml 50% kwasu siarkowego i 0,5 ml kwasu 2-etylomasłowego (standard wewnętrzny), a następnie homogenizowano i ogrzewano w temperaturze 4°C. Wirować przy 12 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze C. Supernatant ekstrahowano 0,5 ml eteru i wstrzykiwano do GC w celu analizy. Do analizy chromatografii gazowej (GC) próbki analizowano przy użyciu chromatografu gazowego GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) wyposażonego w detektor z płomieniową jonizacją (FID). Rozdział uzyskano przy użyciu kolumny ZKAT-624 o wymiarach 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Chiny). Dane uzyskano przy użyciu oprogramowania do analizy roztworów GC (Shimadzu, Inc.). Stosunek podziału wynosił 10:1, gazem nośnym był azot, a szybkość przepływu wynosiła 6 ml/min. Objętość wtrysku wynosiła 1 μl. Temperatura wtryskiwacza i detektora wynosiła 300°C. Temperaturę pieca utrzymywano na poziomie 140°C przez 13,5 minuty, a następnie zwiększono do 250°C z szybkością 120°C/min; temperaturę utrzymywano przez 5 minut.
Dane przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Istotność danych oceniono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji, a następnie wielozakresowego testu Duncana. Do wszystkich obliczeń wykorzystano oprogramowanie GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornia, USA), a za wartość statystycznie istotną uznano p < 0,05.
Wiadomo, że UC jest przewlekłą nawracającą chorobą zapalenia okrężnicy z silnym bólem brzucha, biegunką i krwawieniem. Dlatego też, aby ocenić skuteczność przeciwzapalną BLG, ustalono przewlekłe nawracające zapalenie okrężnicy wywołane przez DSS u myszy (ryc. 1A). W porównaniu z grupą kontrolną, myszy w grupie modelowej DSS miały znacznie zmniejszoną masę ciała i wyższy DAI, a zmiany te zostały znacząco odwrócone po 24 dniach leczenia BLG (ryc. 1B i C). Skracanie okrężnicy jest ważną cechą charakterystyczną UC. Jak pokazano na ryc. 1D i E, długość okrężnicy myszy, które otrzymały DSS, była znacznie skrócona, ale została złagodzona przez leczenie BLG. Następnie przeprowadzono analizę histopatologiczną w celu oceny stanu zapalnego okrężnicy. Obrazy barwione H&E i wyniki patologiczne wykazały, że podanie DSS znacznie zaburzyło architekturę okrężnicy i spowodowało zniszczenie krypt, podczas gdy leczenie BLG znacznie zmniejszyło zniszczenie krypt i wyniki patologiczne (ryc. 1F i G). Co godne uwagi, efekt ochronny BLG w dawce 1 g/kg był porównywalny z efektem ochronnym SASP w dawce 200 mg/kg. Łącznie wyniki te wskazują, że BLG jest skuteczny w zmniejszaniu nasilenia przewlekłego nawracającego zapalenia okrężnicy wywołanego przez DSS u myszy.
TNF-α, IL-1β i IL-6 są ważnymi markerami zapalnymi jelita grubego. Jak pokazano na rysunku 2A, DSS wywołało istotny wzrost ekspresji genów TNF-α, IL-1β i IL-6 w jelicie grubym w porównaniu z grupą kontrolną. Podanie BLG może znacząco odwrócić te zmiany wywołane przez DSS. Następnie użyliśmy testu ELISA do określenia poziomów cytokin zapalnych TNF-α, IL-1β i IL-6 w tkance jelita grubego. Wyniki pokazały również, że poziomy TNF-α, IL-1β i IL-6 w jelicie grubym były istotnie zwiększone u myszy leczonych DSS, podczas gdy leczenie BLG złagodziło te wzrosty (rysunek 2B).
Rycina 2 BLG hamuje ekspresję genów i produkcję prozapalnych cytokin TNF-α, IL-1β i IL-6 w okrężnicy myszy leczonych DSS. (A) Ekspresja genów TNF-α, IL-1β i IL-6 w okrężnicy; (B) poziomy białek TNF-α, IL-1β i IL-6 w okrężnicy. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 lub ##p < 0,01 lub ###p < 0,001 w porównaniu z grupą kontrolną (Con); *p < 0,05 lub **p < 0,01 w porównaniu z grupą DSS.
Dysbioza jelitowa ma kluczowe znaczenie w patogenezie UC.24 Aby zbadać, czy BLG moduluje mikrobiotę jelitową myszy leczonych DSS, wykonano sekwencjonowanie 16S rRNA w celu analizy społeczności bakteryjnej zawartości jelit. Diagram Venna pokazuje, że trzy grupy mają 385 wspólnych jednostek OTU. Jednocześnie każda grupa miała unikalne jednostki OTU (ryc. 3A). Ponadto indeks Chao1 i indeks Shannona przedstawione na ryc. 3B i C wykazały, że różnorodność społeczności mikrobioty jelitowej była zmniejszona u myszy leczonych BLG, ponieważ indeks Shannona był znacząco zmniejszony w grupie leczonej BLG. Analiza głównych składowych (PCA) i analiza głównych współrzędnych (PCoA) zostały użyte do określenia wzorców klastrowania między trzema grupami i wykazały, że struktura społeczności myszy leczonych DSS była wyraźnie oddzielona po leczeniu BLG (ryc. 3D i E). Dane te sugerują, że leczenie BLG znacząco wpłynęło na strukturę społeczności myszy z zapaleniem okrężnicy wywołanym przez DSS.
Rycina 3. BLG zmienia różnorodność mikrobiomu jelitowego u myszy z zapaleniem jelita grubego wywołanym przez DSS. (A) Diagram Venna dla OTU, (B) Wskaźnik Chao1, (C) Wskaźnik bogactwa Shannona, (D) Wykres wyników analizy głównych składowych (PCA) dla OTU, (E) Wynik analizy głównych współrzędnych (PCoA) dla OTU. Rycina. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 6).**p < 0,01 w porównaniu z grupą DSS.
Aby ocenić konkretne zmiany w mikrobiomie kałowym, przeanalizowaliśmy skład mikrobiomu jelitowego na wszystkich poziomach taksonomicznych. Jak pokazano na rysunku 4A, głównymi typami we wszystkich grupach były Firmicutes i Bacteroidetes, a następnie Verrucomicrobia. Względna liczebność Firmicutes i stosunek Firmicutes/Bacteroidetes była istotnie zwiększona w społecznościach mikroorganizmów kałowych myszy leczonych DSS w porównaniu z myszami kontrolnymi, a zmiany te zostały istotnie odwrócone po leczeniu BLG. W szczególności leczenie BLG istotnie zwiększyło względną liczebność Verrucobacterium w kale myszy z zapaleniem okrężnicy wywołanym DSS. Na poziomie gospodarstwa domowego społeczności mikroorganizmów kałowych były zajmowane przez Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae i Prevotellaceae (rys. 4B). W porównaniu z grupą DSS, wyczerpanie BLG zwiększyło liczebność Akkermansiaceae, ale zmniejszyła liczebność Lachnospiraceae i Ruminococcaceae. Warto zauważyć, że na poziomie rodzaju mikrobiotę kałową zajmowały Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001 (ryc. 4C). Odkrycie to wykazało również, że leczenie BLG skutecznie odwróciło nierównowagę mikrobiomu w odpowiedzi na wyzwanie DSS, charakteryzującą się zmniejszeniem Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas i Oscillibacter oraz zwiększeniem Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001.
Rycina 4 BLG zmienia liczebność mikrobioty jelitowej u myszy z zapaleniem okrężnicy wywołanym przez DSS. (A) Liczebność mikrobioty jelitowej na poziomie typu; (B) Liczebność mikrobioty jelitowej na poziomie rodziny; (C) Liczebność mikrobioty jelitowej na poziomie rodzaju. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM (n = 6). #p < 0,05 lub ###p < 0,001 w porównaniu z grupą kontrolną (Con); *p < 0,05 lub **p < 0,01 lub ***p < 0,001 w porównaniu z grupą DSS.
Biorąc pod uwagę, że krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA) są głównymi metabolitami Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, podczas gdy octan, propionian i maślan są najobficiej występującymi SCFA w świetle jelita, 25-27 nadal jesteśmy na etapie naszych badań. Jak pokazano na rysunku 5, stężenia octanu, propionianu i maślanu w kale uległy znacznemu zmniejszeniu w grupie leczonej DSS, podczas gdy leczenie BLG mogło w dużym stopniu zahamować tę redukcję.
Rycina 5. BLG zwiększa poziom krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w kale myszy z zapaleniem okrężnicy wywołanym przez DSS. (A) Zawartość kwasu octowego w kale; (B) Zawartość kwasu propionowego w kale; (C) Zawartość kwasu masłowego w kale. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM (n = 6). #p < 0,05 lub ##p < 0,01 w porównaniu z grupą kontrolną (Con); *p < 0,05 lub **p < 0,01 w porównaniu z grupą DSS.
Następnie obliczyliśmy współczynnik korelacji Pearsona między różnicą SCFA na poziomie rodzaju a mikrobiomem kałowym. Jak pokazano na rysunku 6, Akkermansia korelowała dodatnio z produkcją kwasu propionowego (Pearson = 0,4866) i kwasu masłowego (Pearson = 0,6192). Natomiast Enteromonas i Oscillobacter korelowały negatywnie z produkcją octanu, ze współczynnikami Pearsona wynoszącymi odpowiednio 0,4709 i 0,5104. Podobnie, Ruminococcaceae_UCG-014 korelowała negatywnie z produkcją kwasu propionowego (Pearson = 0,4508) i kwasu masłowego (Pearson = 0,5842).
Rysunek 6. Analiza korelacji Pearsona pomiędzy różnicowymi SCFA a mikrobami jelita grubego. (A) Enteromonas z kwasem octowym; (B) Pałeczka wstrząsu mózgu z kwasem octowym; (C) Akkermansia z kwasem propionowym; (D) Ruminococcus_UCG-014 z kwasem propionowym; (E) Akkermansia z kwasem masłowym; (F) Ruminococcus _UCG-014 z kwasem masłowym.
Glukagonopodobny peptyd-1 (GLP-1) jest specyficznym dla typu komórek potranslacyjnym produktem proglukagonu (Gcg) o właściwościach przeciwzapalnych.28 Jak pokazano na rysunku 7, DSS wywołało znaczący spadek ekspresji mRNA Gcg. Leczenie jelita grubego i BLG mogło znacząco odwrócić wywołaną przez DSS redukcję Gcg w porównaniu z grupą kontrolną (rys. 7A). Jednocześnie poziom GLP-1 w surowicy był znacząco zmniejszony w grupie leczonej DSS, a leczenie BLG mogło w dużej mierze zapobiec tej redukcji (rys. 7B). Ponieważ krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe mogą stymulować wydzielanie GLP-1 poprzez aktywację receptora sprzężonego z białkiem G 43 (GRP43) i receptora sprzężonego z białkiem G 41 (GRP41), zbadaliśmy również GPR41 i GRP43 w jelicie grubym myszy z zapaleniem jelita grubego i odkryliśmy, że ekspresja mRNA GRP43 i GPR41 w jelicie grubym była znacząco zmniejszona po DSS wyzwanie, a leczenie BLG może skutecznie przywrócić te spadki (ryc. 7C i D).
Rycina 7 BLG zwiększa poziom GLP-1 w surowicy oraz ekspresję mRNA Gcg, GPR41 i GRP43 w jelicie grubym u myszy leczonych DSS. (A) Ekspresja mRNA Gcg w tkance jelita grubego; (B) Poziom GLP-1 w surowicy; (C) Ekspresja mRNA GPR41 w tkance jelita grubego; (D) Ekspresja mRNA GPR43 w tkance jelita grubego. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 lub ##p < 0,01 w porównaniu z grupą kontrolną (Con); *p < 0,05 w porównaniu z grupą DSS.
Ponieważ leczenie BLG może zwiększyć poziom GLP-1 w surowicy, ekspresję mRNA Gcg w okrężnicy i poziom SCFA w kale u myszy leczonych DSS, zbadaliśmy dalej octan, propionian i maślan, a także od myszy kontrolnych (F-Con), myszy z zapaleniem okrężnicy DSS (F-Con) -DSS) i myszy z zapaleniem okrężnicy leczonych BLG (F-BLG) pod kątem uwalniania GLP-1 z pierwotnych komórek nabłonka okrężnicy u myszy. Jak pokazano na rysunku 8A, pierwotne komórki nabłonka okrężnicy u myszy leczone odpowiednio 2 mM kwasu octowego, kwasu propionowego i kwasu masłowego znacząco stymulowały uwalnianie GLP-1, co jest zgodne z poprzednimi badaniami.29,30 Podobnie wszystkie F-Con, F-DSS i F-BLG (równowartość 0,25 g kału) znacząco stymulowały uwalnianie GLP-1 z pierwotnych komórek nabłonka okrężnicy u myszy. Warto zauważyć, że ilość GLP-1 uwolniona przez Liczba komórek nabłonka jelita grubego u myszy poddanych działaniu F-DSS była znacznie niższa niż liczba komórek nabłonka jelita grubego u myszy poddanych działaniu F-Con i F-BLG (ryc. 8B). Dane te sugerują, że leczenie BLG znacząco przywróciło produkcję GLP-1 pochodzącego z krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w jelitach.
Rycina 8 SCFA pochodzące z BLG stymulują uwalnianie GLP-1 z pierwotnych komórek nabłonka jelita grubego u myszy. (A) Kwas octowy, kwas propionowy i kwas masłowy stymulowały uwalnianie GLP-1 z pierwotnych komórek nabłonka jelita grubego u myszy; (B) wyciągi kałowe F-Con, F-DSS i F-BLG stymulowały pierwotne komórki nabłonka jelita grubego u myszy Ilość uwolnionego GLP-1. Porcje komórek nabłonka jelita grubego umieszczono w płytkach Petriego ze szklanym dnem i potraktowano 2 mM kwasem octowym, kwasem propionowym, kwasem masłowym i wyciągami kałowymi F-Con, F-DSS i F-BLG (równowartość 0,25 g kału). 2 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO2. Ilość GLP-1 uwolnionego z pierwotnych komórek nabłonka jelita grubego myszy została wykryta metodą ELISA. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). #p < 0,05 lub ##p < 0,01 w porównaniu z próbą ślepą lub F-Con; *p < 0,05 w porównaniu z F-DSS.
Skróty: Ace, kwas octowy; Pro, kwas propionowy; jednakże, kwas masłowy; F-Con, wyciąg z kału myszy kontrolnych; F-DSS, wyciąg z kału myszy z zapaleniem okrężnicy; F-BLG, z okrężnicy leczonej BLG. Wyciągi z kału myszy z zapaleniem.
WZJG, uznane przez Światową Organizację Zdrowia za chorobę oporną na leczenie, staje się zagrożeniem dla całego świata; jednak skuteczne metody przewidywania, zapobiegania i leczenia choroby są nadal ograniczone. Dlatego istnieje pilna potrzeba zbadania i opracowania nowych bezpiecznych i skutecznych strategii terapeutycznych dla UC. Preparaty tradycyjnej medycyny chińskiej są obiecującą opcją, ponieważ wiele preparatów tradycyjnej medycyny chińskiej wykazało skuteczność w leczeniu UC w populacji chińskiej na przestrzeni wieków i wszystkie są biologicznymi substancjami organicznymi i naturalnymi materiałami, które są w większości nieszkodliwe dla ludzi i zwierząt.31,32 Niniejsze badanie miało na celu znalezienie bezpiecznego i skutecznego preparatu tradycyjnej medycyny chińskiej do leczenia UC i zbadanie mechanizmu jego działania. BLG to dobrze znana chińska formuła ziołowa stosowana w leczeniu grypy.8,33 Prace w naszym laboratorium i innych wykazały, że indygo, przetworzony produkt tradycyjnej medycyny chińskiej z tego samego surowca co BLG, wykazuje znaczną skuteczność w leczeniu UC u ludzi i zwierząt.4,34 Jednak działanie przeciw zapaleniu jelita grubego BLG i jego działanie Mechanizm jest niejasny. W bieżącym badaniu nasze wyniki pokazują, że BLG skutecznie osłabia wywołane przez DSS zapalenie jelita grubego, które jest związane z modulacją mikrobiomu jelitowego i przywróceniem produkcji GLP-1 pochodzącego z jelit.
Wiadomo, że UC charakteryzuje się okresami nawrotów z typowymi objawami klinicznymi, takimi jak utrata masy ciała, biegunka, krwawienie z odbytu i rozległe uszkodzenie błony śluzowej jelita grubego.35 Zatem przewlekłe nawracające zapalenie jelita grubego leczono poprzez podawanie trzech cykli 1,8% DSS przez pięć dni, a następnie przez siedem dni wody pitnej. Jak pokazano na rysunku 1B, wahania utraty masy ciała i wyników DAI wskazywały na pomyślną indukcję przewlekłego nawracającego zapalenia jelita grubego. Myszy w grupie leczonej BLG wykazały szybszą poprawę od 8. dnia, która istotnie różniła się od 24. dnia. Te same zmiany zaobserwowano również w wyniku DAI, co sugeruje poprawę kliniczną zapalenia jelita grubego. Jeśli chodzi o uszkodzenie jelita grubego i stan zapalny, długość jelita grubego, uszkodzenie tkanki jelita grubego oraz ekspresja genów i produkcja prozapalnych cytokin TNF-α, IL-1β i IL-6 w tkance jelita grubego również uległy znacznej poprawie po leczeniu BLG. Łącznie te wyniki wyraźnie pokazują, że BLG jest skuteczny w leczeniu przewlekłego nawracającego zapalenia jelit u myszy.
W jaki sposób BLG wywiera swoje działanie farmakologiczne? Liczne wcześniejsze badania wykazały, że mikrobiota jelitowa odgrywa kluczową rolę w patogenezie UC, a terapie oparte na mikrobiomie i ukierunkowane na mikrobiom wyłoniły się jako bardzo atrakcyjna strategia leczenia UC. W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że leczenie BLG spowodowało istotne zmiany w składzie mikrobiomu jelitowego, co sugeruje, że ochronne działanie BLG przed zapaleniem okrężnicy wywołanym przez DSS jest związane z modulacją mikrobiomu jelitowego. Ta obserwacja jest zgodna z poglądem, że przeprogramowanie homeostazy mikrobiomu jelitowego jest ważnym podejściem do zrozumienia skuteczności preparatów TCM.36,37 Co godne uwagi, Akkermansia to Gram-ujemna i ściśle beztlenowa bakteria, która żyje w warstwie śluzu jelitowego, rozkłada mucyny, produkuje kwas propionowy, stymuluje różnicowanie komórek kubkowych i utrzymuje błonę śluzową. funkcja integralności bariery.26 Liczne dane kliniczne i zwierzęce wskazują, że Akkermansia jest silnie związana ze zdrową błoną śluzową,38 a doustne podanie Akkermansia spp. może znacząco poprawić stan zapalny błony śluzowej.39 Nasze obecne dane sugerują, że względna liczebność Akkermansia znacznie wzrasta po leczeniu BLG. Ponadto Prevotellaceae_UCG-001 jest bakterią produkującą SCFA.27 Wiele badań wykazało, że Prevotellaceae_UCG-001 została znaleziona w niskiej względnej liczebności w kale zwierząt z zapaleniem okrężnicy.40,41 Nasze obecne dane pokazują również, że leczenie BLG może znacznie zwiększyć względną liczebność Prevotellaceae_UCG-001 w okrężnicy myszy leczonych DSS. Natomiast Oscillibacter jest mezofilną, ściśle beztlenową bakterią.42 doniesiono, że względna liczebność Oscillibacter znacznie wzrosła u myszy z UC i znacząco dodatnio korelowała z poziomami IL-6 i IL-1β oraz wynikami badań patologicznych.43,44 Co godne uwagi, leczenie BLG znacznie zmniejszyło względną liczebność Oscillibacter w kale zwierząt leczonych DSS myszy. Warto zauważyć, że te bakterie zmienione przez BLG były bakteriami produkującymi najwięcej SCFA. Liczne wcześniejsze badania wykazały potencjalnie korzystne efekty SCFA na zapalenie okrężnicy i ochronę integralności nabłonka jelitowego.45,46 Nasze obecne dane wykazały również, że stężenia octanu, propionianu i maślanu SCFA w kale leczonym DSS były znacznie zwiększone u myszy leczonych BLG. Łącznie te odkrycia jasno pokazują, że leczenie BLG może skutecznie zwiększyć produkcję SCFA indukowaną przez DSS u myszy z przewlekłym nawracającym zapaleniem okrężnicy.
GLP-1 to inkretyna produkowana głównie w jelicie krętym i okrężnicy, która odgrywa ważną rolę w opóźnianiu opróżniania żołądka i obniżaniu poposiłkowego stężenia glukozy we krwi.47 Dowody wskazują, że dipeptydylopeptydaza (DPP)-4, agonista receptora GLP-1 i nanomedycyna GLP-1 mogą skutecznie łagodzić stany zapalne jelit u myszy.48-51 Jak donoszono w poprzednich badaniach, wysokie stężenia SCFA były związane z poziomami GLP-1 w osoczu u ludzi i myszy.52 Nasze obecne dane pokazują, że po leczeniu BLG, poziomy GLP-1 w surowicy i ekspresja mRNA Gcg były istotnie zwiększone. Podobnie, wydzielanie GLP-1 było istotnie zwiększone w hodowlach okrężnicy po stymulacji wyciągami kałowymi u myszy z zapaleniem okrężnicy leczonych BLG w porównaniu do stymulacji wyciągami kałowymi u myszy z zapaleniem okrężnicy leczonych DSS.W jaki sposób SCFA wpływają na uwalnianie GLP-1?Gwen Tolhurst i in. doniesiono, że SCFA może stymulować wydzielanie GLP-1 poprzez GRP43 i GPR41.29 Nasze obecne dane pokazują również, że leczenie BLG znacząco zwiększa ekspresję mRNA GRP43 i GPR41 w okrężnicy myszy leczonych DSS. Dane te sugerują, że leczenie BLG może przywrócić produkcję GLP-1 promowaną przez SCFA poprzez aktywację GRP43 i GPR41.
BLG to w Chinach lek dostępny bez recepty (OTC) o przedłużonym działaniu. Maksymalna tolerowana dawka BLG u myszy Kunming wynosi 80 g/kg, a nie zaobserwowano żadnej ostrej toksyczności.53 Obecnie zalecana dawka BLG (bez cukru) u ludzi wynosi 9-15 g/dzień (3 razy dziennie). Nasze badanie wykazało, że BLG w dawce 1 g/kg łagodziło przewlekłe nawracające zapalenie jelit wywołane przez DSS u myszy. Ta dawka jest zbliżona do dawki BLG stosowanej klinicznie. Nasze badanie wykazało również, że jego mechanizm działania jest pośredniczony, przynajmniej częściowo, przez zmiany w mikrobiomie jelitowym, a konkretnie w bakteriach produkujących SCFA, takich jak Akkermansia i Prevotellaceae_UCG-001, w celu przywrócenia produkcji GLP-1 pochodzącego z jelit. Te odkrycia sugerują, że BLG zasługuje na dalsze rozważenie jako potencjalny środek terapeutyczny w leczeniu klinicznego zapalenia jelit. Jednak dokładny mechanizm, za pomocą którego moduluje on mikrobiotę jelitową, pozostaje do potwierdzenia u myszy z niedoborem mikrobioty i przeszczep bakterii kałowych.
Ace, kwas octowy; but, kwas masłowy; BLG, pandan; DSS, siarczan sodu dekstranu; DAI, wskaźnik aktywności choroby; DPP, dipeptydylopeptydaza; FID, detektor z płomieniową jonizacją; F-Con, kontrola Wyciągi kałowe myszy; F-DSS, wyciągi kałowe myszy z zapaleniem okrężnicy DSS; F-BLG, wyciągi kałowe myszy z zapaleniem okrężnicy leczonych BLG; GLP-1, glukagonopodobny peptyd-1; Gcg, glukagon; chromatografia gazowa; GRP43, receptor sprzężony z białkiem G 43; GRP41, receptor sprzężony z białkiem G 41; H&E, hematoksylina-eozyna; HBSS, zrównoważony roztwór soli Hanksa; OTC, OTC; PCA, analiza głównych składowych; PCoA, analiza głównych współrzędnych; Pro, kwas propionowy; SASP, sulfasalazyna; SCFA, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe; medycyna chińska, tradycyjna medycyna chińska; UC, wrzodziejące zapalenie jelita grubego.
Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komisję ds. etyki badań nad zwierzętami przy Centrum Medycznym Uniwersytetu Pekińskiego w Shenzhen i Uniwersytetu Naukowo-Technicznego w Hongkongu (Shenzhen, Chiny) zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i przepisami dotyczącymi zwierząt (numer komisji etycznej A2020157).
Wszyscy autorzy wnieśli znaczący wkład w koncepcję i projekt, gromadzenie lub analizę i interpretację danych; uczestniczyli w tworzeniu artykułu lub krytycznym poprawieniu ważnych treści intelektualnych; zgodzili się przesłać manuskrypt do bieżącego czasopisma; ostatecznie zatwierdzili wersję do publikacji; odpowiadają za wszystkie aspekty pracy.
Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81560676 i 81660479), projekt pierwszorzędny Uniwersytetu w Shenzhen (86000000210), Fundusz Komitetu ds. Innowacji Naukowych i Technologicznych w Shenzhen (JCYJ20210324093810026), Fundusz Badań Naukowych i Technologicznych w Medycynie Prowincji Guangdong (A2020157 i A2020272), Aptekę Uniwersytetu Medycznego w Guizhou prowincji Guizhou finansowaną przez Key Laboratory (YWZJ2020-01) oraz Szpital Uniwersytetu Pekińskiego w Shenzhen (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B i in. Potencjał terapeutyczny tryptolidu jako środka przeciwzapalnego w eksperymentalnym zapaleniu okrężnicy wywołanym siarczanem dekstranu sodu u myszy. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Globalne obciążenie NZJ: od 2015 do 2025 r. Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue i in. Alkaloidy pochodzenia roślinnego: obiecujące modyfikatory choroby w nieswoistych zapaleniach jelit. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B i in. Indigo Naturalis hamuje stres oksydacyjny okrężnicy i reakcje Th1/Th17 w zapaleniu okrężnicy wywołanym przez DSS u myszy. Oxid Med Cell Longev. 2019; 2019:9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Skuteczność i bezpieczeństwo chińskiego leku ziołowego Sophora flavescens (Sophora flavescens) w leczeniu wrzodziejącego zapalenia jelita grubego: dowody kliniczne i potencjalne mechanizmy.Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Produkty naturalne: leki o udowodnionej skuteczności w leczeniu chorób zapalnych jelit. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Refleksje na temat leczenia adiuwantowego wrzodziejącego zapalenia jelita grubego za pomocą tradycyjnej medycyny chińskiej. Clinical Rev Allergy Immunization.2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT i in. Skuteczność i bezpieczeństwo stosowania granulek Banlangen w leczeniu grypy sezonowej: protokół badania z randomizacją kontrolowaną.trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x