Dziękujemy za odwiedzenie witryny Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Tymczasem, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
W przeciwieństwie do kręgowców powszechnie uważa się, że owady nie mają hormonów płciowych steroidowych, które są preferowane przez samce. U Anopheles gambiae steryd ekdyzonowy 20-hydroksyekdyzon (20E) wydaje się ewoluować, aby kontrolować rozwój jaj, gdy jest syntetyzowany przez samice2 i indukować okres refrakcji godowej, gdy jest przenoszony płciowo przez samce3. Ponieważ rozwój jaj i krycie są niezbędnymi cechami reprodukcyjnymi, zrozumienie, w jaki sposób samice komarów Anopheles integrują te sygnały hormonalne, może ułatwić projektowanie nowych programów kontroli malarii. W tym miejscu ujawniamy, że te funkcje reprodukcyjne są regulowane przez różne sterydy płciowe za pośrednictwem złożonej sieci enzymów aktywujących/inaktywujących ekdysteroidy. Zidentyfikowaliśmy specyficzny dla samców utleniony ekdyzon, 3-dehydro-20E (3D20E), który chroni rodzicielstwo, wyłączając receptywność płciową samic po przeniesieniu płciowym i aktywacji przez defosforylację. Co godne uwagi, przeniesienie 3D20E indukowało również ekspresję Geny rozrodcze, które podtrzymują rozwój jaj podczas zakażenia Plasmodium, zapewniając zdrowie zakażonych samic. Pochodzący od samic 20E nie wywołuje reakcji seksualnej, ale pozwala osobnikom kopulującym na złożenie jaj po zahamowaniu kinaz hamujących 20E. Identyfikacja tego steroidowego hormonu owadów, specyficznego dla samców, i jego roli w regulacji podatności seksualnej, płodności i interakcji z Plasmodium sugeruje, że może on potencjalnie zmniejszyć sukces reprodukcyjny komarów przenoszących malarię.
Liczba zachorowań na malarię i zgonów z jej powodu znów rośnie4 z powodu powszechnej oporności na insektycydy u komarów Anopheles, jedynego wektora pasożyta malarii przenoszącego ją u ludzi. Biologia godowa tych komarów jest szczególnie atrakcyjnym celem dla nowych metod zwalczania malarii, ponieważ samice kopulują tylko raz5; uczynienie tego pojedynczego aktu kopulacji bezpłodnym miałoby ogromny potencjał zmniejszenia populacji komarów w terenie.
Kobiety stają się niezdolne do czynności seksualnych po otrzymaniu od mężczyzn hormonów steroidowych o wysokim mianie. Badania wykazały, że czynnikiem wyzwalającym trudności w dalszym kryciu jest 20-hydroksyekdyzon (20E), hormon steroidowy lepiej znany jako regulator cyklu linienia w stadium larwalnym. Zdolność samców do syntezy i transferu 20E wyewoluowała specyficznie u gatunków Anopheles, które są częścią podrodzaju Cellia7, występującego w Afryce i obejmującego najgroźniejsze wektory malarii, w tym Anopheles gambiae. Jest to szczególnie godne uwagi, ponieważ u tych gatunków samice również produkują 20E po każdym posiłku krwią, a 20E napędza cykl oogenezy (patrz ref. 8). Jednak niewiele wiadomo o sposobie, w jaki samice integrują sygnały z dwóch różnych źródeł ekdyzonu (transfer męski i indukcja karmienia krwią) bez narażania własnej zdolności do krycia. W rzeczywistości, jeśli 20E produkowane przez samice wywołuje nietolerancję seksualną, prowadzi to do bezpłodności u osobników żerujących na dziewiczych potomkach, co jest bardzo powszechnym zachowaniem u tych komarów5.
Możliwym wyjaśnieniem jest to, że samce A. gambiae przekazują zmodyfikowany, specyficzny dla samców ekdyzon, który aktywuje kaskadę sygnałową w żeńskim układzie rozrodczym, co skutkuje niestabilnością godową. Jednakże, mimo że kręgowce mają wiele hormonów steroidowych, takich jak estrogen i androgen (omówionych w odsyłaczu 9), według naszej wiedzy u owadów nie zidentyfikowano steroidów o przewadze androgenów.
Postawiliśmy sobie za cel określenie repertuaru hormonów steroidowych w męskim gruczole dodatkowym (MAG) u dojrzałych płciowo osobników A. gambiae w poszukiwaniu potencjalnie modyfikujących steroidów. Stosując chromatografię cieczową wysokosprawną sprzężoną ze spektrometrią mas tandemową (HPLC-MS/MS), a nie mniej specyficzną metodę stosowaną wcześniej, wykryliśmy ekdyzon (E) i 20E w tej tkance, co potwierdza poprzedni wynik. Jednak próbka była zdominowana przez utlenione fosforylowane steroidy, co jest zgodne ze wzorem 3-dehydro-20E-22-fosforan (3D20E22P)12 (Rysunek 1). Inne formy obejmują 3-dehydro-20E (3D20E) i 20E-22-fosforan (20E22P). Intensywność sygnału HPLC-MS/MS dla 3D20E22P była o dwa rzędy wielkości wyższa niż dla jego zdefosforylowanej formy, 3D20E, i o trzy rzędy wielkości wyższa wyższe niż E i 20E (Rysunek 1). Chociaż w innych częściach ciała i dolnym odcinku dróg rodnych (LRT; rozszerzone dane, Rys. 1a). Przeanalizowaliśmy również ekdysteroidy u niedawno zamkniętych (<1 dnia) samców i samic i wykryliśmy 3D20E i 3D20E22P tylko w MAG; E, 20E i 20E22P były obecne u obu płci (rozszerzone dane, Rys. 1b). Dane te sugerują, że dorośli samce A. gambiae wytwarzają wysokie miana hormonów modyfikujących w swoich MAG, które nie są syntetyzowane przez samice.
MAG i żeńskie LRT (wliczając przedsionki, pęcherzyki nasienne i parowarium) wypreparowano z 4-dniowych (4-dniowych) dziewiczych samców i dziewiczych i pokrytych samic (0,5, 3 i 12 hpm). Ekdyzon w tych tkankach analizowano metodą HPLC-MS/MS (średnia ± SEM; test t dla prób niezależnych, dwustronny, skorygowany o współczynnik fałszywych odkryć (FDR); NS, nieistotne; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 godziny vs. 0,5 godziny, P = 0,035; 12 godzin vs. 3 godziny, P = 0,0015; 12 godzin vs. 0,5 godziny, P = 0,030. 3D20E22P: 3 godziny vs. 0,5 godziny, P = 0,25; 12 godziny w porównaniu do 3 godzin, P = 0,0032; 12 godzin w porównaniu do 0,5 godziny, P = 0,015). Dane pochodzą z trzech powtórzeń biologicznych. Powierzchnia szczytowa dla każdego interesującego ekdyzonu została obliczona i znormalizowana względem liczby komarów. Ekdyzon jest przedstawiony kolorem w następujący sposób: E — zielony; 20E — pomarańczowy; 20E22P — fioletowy; 3D20E — niebieski; 3D20E22P — różowy. Wstawka zwiększa skalę na osi Y, aby pokazać niższe poziomy ekdyzonu.
Aby zbadać, czy 3D20E22P i 3D20E są przenoszone podczas krycia, przeprowadziliśmy sekcję żeńskich dróg rodnych (LRT) w różnych punktach czasowych po kryciu. Chociaż ekdyzonu nie znaleziono u dziewic, zaobserwowaliśmy znaczne ilości 3D20E22P w LRT bezpośrednio po kryciu (0,5 godziny po kryciu, hpm), zmniejszające się z czasem, podczas gdy poziomy 3D20E znacznie wzrosły (ryc. 1). Używając chemicznie syntetyzowanego 3D20E jako standardu, ustaliliśmy, że poziomy tego hormonu steroidowego w LRT podczas krycia były co najmniej 100 razy wyższe niż 20E (Tabela danych rozszerzonych 1). Zatem 3D20E22P jest głównym męskim ekdyzonem, który jest przenoszony do żeńskiego LRT podczas krycia, a jego zdefosforylowana forma, 3D20E, staje się bardzo obfita wkrótce po kryciu. Sugeruje to ważną rolę tego ostatniego ekdyzonu w kryciu samic po kryciu biologia.
Po wygenerowaniu nowego zestawu danych sekwencjonowania RNA (RNA-seq) (rys. 2a), używając specjalnie zbudowanego procesu bioinformatycznego, przeszukaliśmy kinazę ekdyzonową (EcK), oksydazę ekdyzonową (EO) i gen fosfatazy 20E kodujący ekdyzon.EPP) jest wyrażany w tkankach rozrodczych.Zidentyfikowaliśmy jeden gen kandydujący EPP i dwa potencjalne geny EcK (EcK1 i EcK2), ale nie byliśmy w stanie znaleźć dobrego genu kandydującego EO.Co znamienne, poszczególne geny EPP były wyrażane na wysokim poziomie (98,9 percentyla) w gambijskich MAG, ale nie w żeńskich LRT (rys. 2b), wbrew naszym oczekiwaniom, ponieważ w tej żeńskiej tkance wystąpiła defosforylacja 3D20E22P.W związku z tym uważamy, że męski EPP może być przenoszony podczas krycia.W rzeczywistości użyliśmy znakowania stabilnym izotopem in vivo, aby zamaskować żeńskie białko po krycia, enzym zidentyfikowany przez MS w przedsionku samicy (ryc. 2c i tabela uzupełniająca 1). Obecność EPP w LRT samicy MAG i zapłodnionej (ale nie dziewiczej) potwierdzono również przy użyciu specyficznych przeciwciał (ryc. 2d).
a, Specjalnie zaprojektowany kanał bioinformatyczny do przeszukiwania tkanek rozrodczych każdej płci w celu znalezienia genów kodujących EcK, EO i EPP. Liczby obok strzałek wskazują liczbę kandydatów płci męskiej i żeńskiej na każdym etapie. Ta analiza zidentyfikowała jeden gen EPP (EPP) i jeden gen EcK (EcK1), które są wyrażane u samców, oraz jeden gen EcK (EcK2), który jest wyrażany u obu płci, ale nie daje kandydata na gen EO.b, Mapa cieplna porównująca ekspresję genu kandydata w tkankach dziewiczych (V) i godowych (M) Anopheles gambiae i Anopheles albicans.SPCA, zapłodnienie; MAGs, gruczoły dodatkowe u samców; inne części ciała, w tym piersi, skrzydła, nogi, ciała tłuszczowe i narządy wewnętrzne u obu płci oraz jajniki u samic. EcK2 jest silnie ekspresjonowany zarówno w MAG, jak i przedsionkach Gambii, podczas gdy EPP występuje tylko w MAG.c, Analiza proteomiczna translokacji grupy męskiego ejakulatu do przedsionków samic przy 3, 12 i 24 hpm, wykazująca 67 najliczniejszych białek. Samice hodowano na diecie zawierającej 15N w celu oznakowania (i zamaskowania) wszystkich białek. Samce bez znaczników skrzyżowano z samicami ze znacznikami, a żeńskie LRT wycięto przy 3, 12 i 24 hpm w celu przeprowadzenia analizy proteomicznej (pełna lista białek ejakulacyjnych znajduje się w Tabeli uzupełniającej 1). Wstawka, EPP, Eck1 i EcK2 wykryto w MAG dziewiczych samców za pomocą analizy proteomicznej tych tkanek.d, EPP wykryto metodą western blot w MAG i LRT skrzyżowanych samców samice, ale nie u samic dziewiczych, samców ani reszty ciała samicy. Błony badano jednocześnie przeciwciałami anty-aktynowymi (kontrola obciążenia) i przeciwciałami anty-EPP. Wszystkie samce są dziewicami. Dane źródłowe żelu znajdują się w Dodatku 1. Western bloty wykonano dwukrotnie, uzyskując podobne wyniki.
Aktywność ekdysteroidowej fosfofosfatazy EPP została potwierdzona po inkubacji metodą HPLC-MS/MS z 3D20E22P wyizolowanym z MAG (rozszerzone dane, rys. 2a). Ponadto, gdy wyciszyliśmy EPP metodą interferencji za pośrednictwem RNA (RNAi), zaobserwowaliśmy znaczną redukcję aktywności fosfatazy w tkankach rozrodczych tych samców (rys. 3a), a samice skojarzone z samcami z wyciszonym EPP wykazywały istotnie niższy odsetek zdefosforylowanego 3D20E (rys. 3b) pomimo częściowego wyciszenia genu (rozszerzone dane, rys. 2b, c). Z kolei nie zaobserwowaliśmy istotnych zmian w stosunku 20E22P/20E u tych samych komarów, co może sugerować, że enzym jest specyficzny dla 3D20E22P (rys. 3b).
a, Obniżona aktywność fosfatazy w MAG spowodowana wyciszeniem EPP przy użyciu kontroli z dwuniciowym RNA EPP (dsEPP) lub dwuniciowym RNA GFP (dsGFP). W każdej replikacji użyto dwudziestu pul MAG (P = 0,0046, sparowany test t, dwustronny), reprezentowanych przez oddzielne kropki.b, Samice skojarzone z samcami z wyciszonym EPP miały istotnie niższy odsetek zdefosforylowanego 3D20E po 3 hpm (P = 0,0043, niesparowany test t, dwustronny), podczas gdy poziomy 20E nie uległy zmianie (P = 0,063, niesparowany). Test t, dwustronny). Dane przedstawiono jako średnią ± SEM z trzech pul po 13, 16 i 19 samic każda. c, Samice skojarzone z samcami z wyciszonym genem EPP miały znacznie wyższy wskaźnik ponownych kryć (P = 0,0002, dokładny test Fishera, dwustronny). Samice były najpierw zmuszane do krycia w celu potwierdzenia ich statusu godowego; 2 dni później skontaktowano je z innymi samcami posiadającymi plemniki transgeniczne w celu oceny wskaźników ponownych kryć poprzez ilościową detekcję transgenu metodą PCR.d, Samice karmione krwią, skojarzone z samcami z wyciszonym genem EPP, miały znacznie zmniejszoną płodność (P < 0,0001; test Manna-Whitneya, dwustronny) i nieznacznie zmniejszoną liczbę jaj (P = 0,088, test Manna-Whitneya, dwustronny), podczas gdy wskaźnik tarła nie został naruszony (P = 0,94, dokładny test Fishera, dwustronny). We wszystkich panelach n oznacza liczbę biologicznie niezależnych próbek komarów. NS, nieistotne statystycznie. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Następnie oceniliśmy, czy defosforylacja ekdyzonu jest ważna dla wywołania oporności na krycie u samic. Co godne uwagi, samice skojarzone z samcami pozbawionymi EPP skojarzyły się ponownie znacznie częściej (44,9%) niż samice kontrolne (10,4%) po narażeniu na dodatkowe samce (transgeniczne) (rys. 3c). Zaobserwowaliśmy również znaczący spadek płodności (rys. 3d, lewa strona) i niewielki spadek liczby jaj złożonych przez te samice (rys. 3d, środek), podczas gdy odsetek jaj złożonych przez samice (inna reakcja wywołana u samic przez krycie)) nie został naruszony (rys. 3d, prawa strona). Biorąc pod uwagę zaobserwowaną specyficzność EPP dla 3D20E22P, wyniki te sugerują, że aktywacja 3D20E przez EPP przeniesiony podczas krycia może mieć ważną rolę w wyłączaniu podatności samic na dalsze krycie, zachowania wcześniej przypisywanego seksualnemu przeniesieniu 20E. Dlatego też, Hormon specyficzny dla mężczyzn ma również silny wpływ na płodność kobiet.
Następnie porównaliśmy działania 20E i 3D20E w eksperymentach iniekcyjnych u dojrzałych płciowo dziewic, wykorzystując chemicznie syntetyzowany 3D20E (rys. 4a–c) i komercyjnie dostępny 20E. Zaobserwowaliśmy, że 3D20E był znacznie skuteczniejszy niż 20E w wyłączaniu wrażliwości samic na krycie przy obu stężeniach (rys. 4d). Co godne uwagi, połowa fizjologicznego poziomu 3D20E w LRT (1066 pg po iniekcji w porównaniu do 2022 pg po kryciu) wywołała odsetek opornych samic, który był 20-krotnie wyższy niż fizjologiczny poziom 20E (361 pg po iniekcji) 24 godziny po wstrzyknięciu przy najwyższym stężeniu 18 pg po kryciu; Rozszerzona tabela danych 1). Wynik ten jest zgodny z poglądem, że przenoszenie płciowe 20E nie powoduje okresów refrakcji dla kopulacji i dodatkowo wskazuje na 3D20E jako główny czynnik zapewniający relację rodzic-dziecko. 3D20E było również znacząco bardziej aktywne niż 20E w testach składania jaj u dziewiczych samic (ryc. 4e), co sugeruje, że normalna szybkość składania jaj, którą obserwowaliśmy po częściowym wyciszeniu EPP, wynikała z obecności resztkowej aktywności 3D20E nadal wytwarzanej przez czynniki żeńskie indukowane kopulacją.
(a,b) 3D20E syntetyzowane chemicznie z 20E (a) z bardzo wysoką konwersją/wydajnością (dane przedstawione jako średnia ± sem z trzech niezależnych reakcji syntezy) (b).c, Widmo masowe (dolna połowa) dokładnie odpowiada ekdyzonowi znalezionemu w pokrytym żeńskim LRT (górna połowa).d, W porównaniu z 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; dokładny test Fishera, dwustronny) i 10% etanolem (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; dokładny test Fishera, dwustronny), podczas gdy 20E było istotnie wyższe niż kontrola tylko przy wyższych dawkach (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; dokładny test Fishera, dwustronny). e, wstrzyknięcie 3D20E wywołało znacząco wyższe wskaźniki tarła u dziewiczych samic niż kontrole z 10% etanolem (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; dokładny test Fishera, dwustronny), podczas gdy 20E w porównaniu do kontroli tylko przy wyższych dawkach (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; dokładny test Fishera, dwustronny). 3D20E wywołało znacząco wyższe wskaźniki tarła niż 20E przy wyższych dawkach (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; dokładny test Fishera, dwustronny). We wszystkich panelach n oznacza liczbę biologicznie niezależnych próbki komarów.NS, nieistotne statystycznie.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.Dane pochodzą z trzech powtórzeń.
W poprzednich badaniach ustaliliśmy, że płciowy transfer hormonów steroidowych indukuje ekspresję MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), żeńskiego genu rozrodczego, który chroni samice A. gambiae przed zakażeniem P. falciparum Koszty zdrowotne spowodowane przez 13, najgroźniejszego pasożyta malarii u ludzi. Biorąc pod uwagę znaczenie MISO dla sprawności reprodukcyjnej Anopheles w obszarach endemicznych dla malarii, postanowiliśmy ustalić, który hormon 3D20E lub 20E wyzwala ekspresję tego genu. Odkryliśmy, że podczas gdy wstrzyknięcie 20E specyficznie lub silniej indukowało niektóre receptory hormonów jądrowych (HR), takie jak HR3 i HR4, oraz typowe cele steroidowe w dół, takie jak geny żółtkowe Vg14, 15, 16, MISO było silniej indukowane przez 3D20E (rozszerzone dane, ryc. 3). Tak więc płciowy transfer tego androgennego hormonu steroidowego wydaje się indukować mechanizmy, które chronią samice przed kosztami powodowanymi przez zakażenie pasożytnicze. Co więcej, 3D20E w różny sposób oddziałuje na obie izoformy receptora E EcR, indukując EcR-A i hamując EcR-B, a silniej aktywując inne geny indukujące łączenie się w pary, w tym HPX15, który wpływa na płodność samic. Może to wyjaśniać znaczną niepłodność obserwowaną u samic skojarzonych z samcami z wyciszonym genem EPP (rozszerzone dane, ryc. 3). Dane te sugerują istnienie dalszych szlaków preferencyjnie aktywowanych przez dwa hormony ekdyzonu, które mogą leżeć u podstaw funkcji specyficznych dla płci.
Następnie przetestowaliśmy funkcję dwóch genów EcK zidentyfikowanych w naszym procesie bioinformatycznym. Wyciszenie EcK1 lub EcK2 skutkowało znaczną śmiertelnością u samców (rozszerzone dane, ryc. 4a), co sugeruje, że fosforylacja ekdyzonu, a tym samym jego inaktywacja, jest ważna dla przeżycia. Ponieważ EcK2 był wyrażany na wyższych poziomach niż EcK1 i został wykryty w MAG za pomocą proteomiki (ryc. 2b, c i tabela uzupełniająca 2), zweryfikowaliśmy jego aktywność kinazy ekdysteroidowej, inkubując go z 20E, co spowodowało fosforylację 20E22P (rozszerzone dane, ryc. 2).4b). Używając 3D20E jako substratu, nie byliśmy w stanie wykryć fosforylowanego produktu 3D20E22P (rozszerzone dane, ryc. 4c), co sugeruje, że 20E, a nie 3D20E może być preferowanym celem EcK2.
Zgodnie z naszą analizą RNA-seq, EcK2 był również silnie ekspresjonowany w LRT dziewiczych samic, gdzie został wyłączony po kopulacji (ryc. 2b). Potwierdziliśmy te dane i ustaliliśmy, że ekspresja EcK2 nie była zmieniana przez karmienie krwią (rozszerzone dane, ryc. 5a). Rozszerzając nasze początkowe eksperymenty MS, ustaliliśmy, że szczyt 20E22P był ściśle związany ze szczytem 20E (22-26 godzin po posiłku krwią; rozszerzone dane, ryc. 5b). Wyciszenie EcK2 u dziewiczych samic spowodowało 3-krotny wzrost względnego stosunku 20E do 20E22P po 26 godzinach od posiłku krwią (rozszerzone dane, ryc. 2c i 5c), co potwierdza, że ​​EcK2 fosforyluje również 20E u samic. Co godne uwagi, dziewice z wyczerpanym EcK2 zachowały pełną receptywność seksualną (rozszerzone dane, ryc. 5d,e), co dodatkowo sugeruje, że samice produkcja 20E nie wywołuje okresów refrakcji godowej. Jednak te samice miały znacząco zwiększone wskaźniki składania jaj w porównaniu z grupą kontrolną, przy czym ponad 30% dziewic złożyło jaja (rozszerzone dane, rys. 5f). Jeśli wstrzyknięcia dwuniciowego RNA Eck2 (dsEcK2) wykonano po karmieniu krwią, tarło nie nastąpiło, w którym to momencie szczyt 20E spowodowany pobieraniem krwi spadł. Ogólnie rzecz biorąc, te wyniki wspierają model, że 20E wytwarzane po ssaniu krwi może wywołać tarło, ale tylko wtedy, gdy blokada tarła (EcK2 i prawdopodobnie inne czynniki) jest wyłączana przez krycie. Ani wstrzyknięcia 20E, ani 3D20E nie zahamowały ekspresji EcK2 u dziewic (rozszerzone dane, rys. 5g), co sugeruje, że inne czynniki pośredniczą w hamowaniu tej kinazy. Jednak poziomy 20E po karmieniu krwią nie były wystarczające, aby wywołać dyskomfort podczas krycia, ale zostały skutecznie wywołane przez wysokie miana przenoszonych drogą płciową 3D20E.
Nasze wyniki dostarczają ważnych spostrzeżeń na temat mechanizmów regulujących sukces reprodukcyjny A. gambiae. Pojawił się model, w którym samce ewoluowały, aby syntetyzować wysokie miana 3D20E, specyficznego dla samców zmodyfikowanego ekdyzonu, który zapewnia rodzicielstwo poprzez odczulanie samic na dalsze krycie. Jednocześnie te wektory malarii wyewoluowały również skuteczny system aktywacji 3D20E u samic w odpowiedzi na płciowy transfer specyficznego dla samców EPP. Według naszej wiedzy jest to pierwszy przykład zdominowanego przez samce i samice układu hormonów steroidowych pełniącego unikalną i krytyczną funkcję u owadów. Specyficzna dla samców funkcja ekdyzonu była postulowana, ale nie została ostatecznie udowodniona. Na przykład w dużej mierze obalona hipoteza18 głosi, że funkcje te może pełnić prekursor 20E E1. Powszechnie wiadomo, że u Drosophila monandria jest wyzwalana przez płciowy transfer małych peptydów płciowych19,20, które oddziałują z neuronami unerwiającymi żeńskiego układu rozrodczego poprzez specyficzne receptory peptydów płciowych21,22. Konieczne są dalsze badania w celu określenia kaskad sygnałowych kontrolowanych przez 3D20E u samic A. gambiae i ustalenia, czy kaskady te mogą być zachowane pomiędzy komarami i Drosophila.
Biorąc pod uwagę ważną rolę 3D20E w płodności i zachowaniu samic zidentyfikowaną w naszym badaniu, ścieżki prowadzące do syntezy i aktywacji 3D20E oferują nowe możliwości dla przyszłych strategii kontroli komarów, takich jak generowanie konkurencyjnych sterylnych samców w strategiach technologii sterylnych owadów Użyj do wypuszczenia na wolność lub do imitacji 3D20E w dziewiczej zabawie. Specyficzna dla samców funkcja 3D20E mogła wyewoluować, gdy A. gambiae i inne gatunki Cellia nabyły zdolność do koagulacji nasienia w czopach godowych, ponieważ pozwala to na wydajny transfer dużej liczby hormonów i enzymów aktywujących hormony. Z kolei ewolucja 3D20E wdrażająca monandrię zapewnia samicom (poprzez wysoką ekspresję MISO) mechanizm sprzyjający ich sprawności reprodukcyjnej na obszarach o wysokiej częstości występowania malarii, co pośrednio przyczynia się do transmisji Plasmodium. Biorąc pod uwagę, że wykazano, że samice 20E mają głęboki wpływ na przeżycie i wzrost P. falciparum u samic komarów Anopheles,24 zarówno samce, jak i Szlaki żeńskich hormonów steroidowych stały się obecnie kluczowym aspektem interakcji komarów i pasożytów.
Szczepy A. gambiae G3 hodowano w standardowych warunkach dla owadów (26–28 °C, wilgotność względna 65–80%, fotoperiod 12:12 godz. światła/ciemności). Larwy karmiono sproszkowanym pokarmem dla ryb (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets i Tetra Pond Sticks w stosunku 7:7:2). Dorosłe komary karmiono ad libitum 10% roztworem dekstrozy i co tydzień ludzką krwią (badane składniki krwi). Dziewicze komary uzyskano poprzez segregację płci w stadium poczwarki po zbadaniu końcówek pod mikroskopem. Samce będące nosicielami transgenu DsRed zostały opisane wcześniej.
Eksperymenty z wymuszonym kopulowaniem przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. W przypadku kopulacji naturalnej 4-dniowe dziewicze samice przetrzymywano w stosunku 1:3 z dojrzałymi płciowo dziewiczymi samcami przez dwie noce. W przypadku eksperymentów, w których samcom wstrzykiwano dsEPP, wspólne umieszczanie w klatkach zbiegało się z 3–4 dniami po iniekcji, kiedy aktywność fosfatazy była maksymalnie wyciszona (rozszerzone dane, rys. 2b).
Tkanki komarów, pozostałe zwłoki (resztę ciała) lub całe ciało rozcięto w 100% metanolu i zhomogenizowano za pomocą homogenizatora (2 mm szklane koraliki, 2400 obr./min, 90 s). Ilości tkanek i objętości metanolu były następujące: reszta ciała 50 w 1000 µl; MAG 50–100 80 µl; żeńskie odmrożone odmrożenia (LRT) 25–50 80 µl. Osad poddano drugiej ekstrakcji metanolem, stosując taką samą objętość metanolu. Szczątki komórek usunięto przez wirowanie. Metanol z obu ekstrakcji połączono i wysuszono pod strumieniem azotu, a następnie zawieszono w następujących objętościach 80% metanolu w wodzie: reszta ciała 50 µl; MAG i żeńskie odmrożenia (LRT) 30 µl.
Próbki analizowano za pomocą spektrometru masowego (ID-X, Thermo Fisher) sprzężonego z urządzeniem LC (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl próbki wstrzykiwano na kolumnę 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) utrzymywaną w temperaturze 25 °C. Fazami ruchomymi dla LC były A (woda, 0,1% kwas mrówkowy) i B (acetonitryl, 0,1% kwas mrówkowy). Gradient LC był następujący: 5% B przez 1 minutę, a następnie zwiększany do 100% B w ciągu 11 minut. Po 8 minutach przy 100% ponownie równoważono kolumnę przy 5% B przez 4 minuty. Szybkość przepływu wynosiła 0,3 ml min-1. Jonizacja w źródle MS jest realizowana przez jonizację elektrosprayową na gorąco w trybie dodatnim i ujemnym.
Spektrometr masowy mierzy dane w zakresie m/z od 350 do 680 przy rozdzielczości 60 000 w pełnym trybie MS. Dane MS/MS uzyskano dla [M + H]+ (wszystkie cele), [M - H2O + H]+ (wszystkie cele) i [M - H]- (fosforylowane cele). Dane MS/MS wykorzystano do potwierdzenia właściwości ekdyzonu celów, dla których nie był dostępny żaden standard. Aby zidentyfikować niecelowane ekdysteroidy, przeanalizowano dane MS/MS dla wszystkich pików HPLC o względnej obfitości >15%. Dokonano ilościowej analizy przy użyciu krzywych standardowych utworzonych z czystych standardów (20E, 3D20E), aby obliczyć bezwzględne ilości lub rozcieńczenia jednej konkretnej próbki (wszystkie inne cele), aby obliczyć ich równoważność z ilościami znalezionymi u jednego mężczyzny. Dla 3D20E kwantyfikację przeprowadzono przy użyciu sumy następujących adduktów: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Dane ekstrahowano i kwantyfikowano przy użyciu programu Tracefinder (wersja 4.1). Dane MS/MS analizowano przy użyciu programu Xcalibur (wersja 4.4). Widma MS E, 20E i 3D20E porównywano z odpowiednimi standardami. 3D20E22P analizowano przez derywatyzację odczynnikiem Girarda. 20E22P analizowano przy użyciu stosunku m/z.
Związek 3D20E22P oczyszczono z MAG. Oczyszczanie przeprowadzono na skalę analityczną przy użyciu chromatografu cieczowego o ultrawydajności (Acquity, Waters) z detektorem masowym typu kwadrupol (QDa, Acquity, Waters) w tych samych warunkach LC, co analiza HPLC-MS/MS. Zbieranie frakcji rozpoczęto, gdy wykryto stosunek m/z odpowiadający związkowi 3D20E22P przy tym samym czasie retencji, co wcześniej. Następnie sprawdzono czystość wyekstrahowanych związków za pomocą HPLC-MS/MS, jak opisano powyżej.
Całkowity RNA wyekstrahowano z 10-12 tkanek rozrodczych lub innych części ciała (bez głowy) przy użyciu odczynnika TRI (Thermo Fisher) zgodnie z instrukcją producenta. RNA potraktowano TURBO DNAzą (Thermo Fisher). cDNA zsyntetyzowano przy użyciu odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki myszy Moloneya (M-MLV RT; Thermo Fisher) zgodnie z instrukcją producenta. Startery do ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR; Extended Data Table 2) zostały wcześniej opublikowane24 lub zaprojektowane przy użyciu Primer-BLAST26, przy czym preferowane były produkty o wielkości 70-150 pb obejmujące połączenia ekson-ekson lub pary starterów rozdzielające eksony. Próbki cDNA z trzech do czterech replikatów biologicznych rozcieńczono czterokrotnie w wodzie do RT-qPCR. Kwantyfikację przeprowadzono w 15 µl reakcjach replikacyjnych zawierających 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher). Fisher), startery i 5 µl rozcieńczonego cDNA. Reakcje przeprowadzono w systemie PCR w czasie rzeczywistym QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher), a dane zebrano i przeanalizowano przy użyciu oprogramowania Design and Analysis (wersja 2.4.3). Jak wykazano w tym badaniu, względne ilości znormalizowano do genu rybosomalnego RpL19 (AGAP004422), którego ekspresja nie zmieniła się znacząco podczas karmienia krwią27 lub krycia3.
Jakość RNA sprawdzono przy użyciu urządzenia Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Biblioteki typu paired-end Illumina przygotowano i uruchomiono w Broad Institute of MIT i Harvard. Odczyty sekwencjonowania wyrównano z genomem A. gambiae (szczep PEST, wersja 4.12) przy użyciu HISAT2 (wersja 2.0.5) z domyślnymi parametrami. Odczyty z wynikami jakości mapowania (MAPQ) <30 usunięto przy użyciu narzędzia Samtools (wersja 1.3.1). Liczbę odczytów zmapowanych na geny zliczono przy użyciu narzędzia htseq-count (wersja 0.9.1) z domyślnymi parametrami. Obliczono znormalizowaną liczbę odczytów i przeanalizowano różnicową ekspresję genów przy użyciu pakietu DESeq2 (wersja 1.28.1) w R (wersja 4.0.3).
Kandydatów na geny modyfikujące ekdyzon zidentyfikowano najpierw przeszukując genom A. gambiae przy użyciu algorytmu PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), używając domyślnych wartości parametrów z następującymi sekwencjami białek zapytania: z Bombyx mori (nr akcesyjny NP_001038956.1), Musca domestica (nr akcesyjny XP_005182020.1, XP_005175332.1 i XP_011294434.1) i Microplitis demolitor (nr akcesyjny XP_008552646.1 i XP_008552645.1) EcK z B. mori (nr akcesyjny NP_001036900), Drosophila melanogaster (Numer dostępu NP_651202), Apis mellifera (Numer dostępu XP_394838) i Acyrthosiphon pisum (Numer dostępu XP_001947166); oraz EPP z B. mori (Numer dostępu XP_001947166) NP_001177919.1 i NP_001243996.1) i EO z D. melanogaster (Numer dostępu NP_572986.1) (krok 1). Następnie przefiltruj trafienia na podstawie wysokiej ekspresji mRNA (>100 fragmentów/eksonów kilozasadowych na milion zmapowanych odczytów (FPKM) lub >85%) w tkance rozrodczej (żeński LRT lub MAG) w Gambii (krok 2). Aby poprawić specyficzność, wybraliśmy kandydackie enzymy, które są również ekspresjonowane w tkance rozrodczej A. albimanus, gatunku widliszka, który nie syntetyzuje ani nie transferuje ekdyzonu podczas krycia. Geny kandydackie zostały przefiltrowane na podstawie niskiej ekspresji (<100 FPKM lub <85. percentyla) w tkance rozrodczej A. albimanus (krok 3). Jako ostatni filtr (krok 4) geny kandydackie muszą spełniać co najmniej jeden z następujących warunków: (1) znacząco zwiększone po kryciu (P < 0,05) zgodnie z analizą różnicowo ekspresjonowanych genów i (2) w tkankach nierozrodczych (<85% lub <100 FPKM).
Zmodyfikowaliśmy wcześniej opisane metody 28,29,30, aby uzyskać znakowanie izotopowe całego organizmu. Krótko mówiąc, dzikiego typu Saccharomyces cerevisiae typu II (YSC2, Sigma) testowano w drożdżowej bazie azotowej (BD Difco, DF0335) zawierającej (wag./obj.) 2% glukozy (G7528, Sigma), 1,7% wolnej od aminokwasów i siarczanu amonu. pożywka hodowlana) i 5% 15N siarczanu amonu (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) jako jedyne źródło azotu. Drożdże odzyskiwano przez wirowanie, a larwy komarów karmiono ad libitum aż do przepoczwarzenia. Uzupełniano mączką rybną (0,5 mg na 300 larw) w celu zapobiegania śmiertelności w czwartym stadium larwalnym. Następnie w eksperymentach godowych użyto wyłącznie samic z nieoznakowanymi samcami w celu analizy męskiego proteomu przenoszonego podczas godów.
4-6-dniowe dziewicze samice oznaczone znacznikiem 15N zmuszano do kopulacji z odpowiadającymi im wiekiem dziewiczymi samcami bez znacznika. Pomyślne kopulacja została potwierdzona poprzez wykrycie czopów kopulacyjnych pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Przy 3, 12 i 24 hpm przedsionki 45-55 zapłodnionych samic zostały wypreparowane w 50 µl buforu wodorowęglanu amonu (pH 7,8) i zhomogenizowane tłuczkiem. Homogenat odwirowano, a supernatant zmieszano z 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) w 50 mM wodorowęglanie amonu. Supernatant i osad z każdej próbki zamrożono na suchym lodzie i wysłano na noc do laboratorium MacCossa na Uniwersytecie w Waszyngtonie, gdzie zakończono przygotowywanie próbek do LC-MS/MS. Ponownie zawieszono osad w 50 µl 0,1% RapiGest w 50 mM wodorowęglanie amonu i sonikowano w łaźni wodnej. Stężenie białka w osadzie i supernatancie mierzono metodą BCA, próbki zredukowano 5 mM ditiotreitolu (DTT; Sigma), alkilowano 15 mM jodoacetamidem (Sigma) i inkubowano w temperaturze 37 °C (1:0 50) przez 1 godzinę z trypsynizacją: stosunek trypsyny:substratu). RapiGest lizowano przez dodanie 200 mM HCl, a następnie inkubowano w temperaturze 37 °C przez 45 minut i wirowano przy 14 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń. Próbki przemyto metodą ekstrakcji w fazie stałej w trybie dwufazowym (wkłady Oasis MCX, Waters) i zawieszono w 0,1% kwasie mrówkowym, uzyskując końcowe stężenie białka wynoszące 0,33 µg µl-1. Nieoznakowane proteomy MAG analizowano w podobny sposób u samców dziewiczych. Dla każdej próbki wykonano dwie replikacje analityczne. Następnie analizowano 1 µg każdej próbki przy użyciu 25-centymetrowej kolumny z topionej krzemionki o średnicy 75 μm z pułapką z fryty Kasil1 (PQ) z topionej krzemionki o średnicy 4 cm wypełnioną żywicą do odwróconej fazy Jupiter C12 (Phenomenex) i 180-minutowej chromatografii cieczowej. Próbki strawień – MS/MS przeprowadzono na spektrometrze masowym Q-Exactive HF (Thermo Fisher) z systemem nanoACQUITY UPLC (Waters). Dane dotyczące akwizycji danych wygenerowane dla każdego przebiegu zostały przekonwertowane do formatu mzML przy użyciu Proteowizard (wersja 3.0.20287) i Comet31 (wersja 3.2) w oparciu o bazę danych FASTA zawierającą sekwencje białek z Anopheles gambiae (VectorBase wersja 54), Anopheles coluzzi Przeprowadzono wyszukiwanie w Mali-NIH (VectorBase wersja 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, marzec 2021), RNA-seq A. gambiae i translacje trzech ramek znanych zanieczyszczeń ludzkich. Dopasowane do mapy peptydów FDR zostały określone przy użyciu Percolator32 (wersja 3.05) z progiem 0,01, a peptydy były zmontowane w identyfikacje białek przy użyciu parsymonii białek w Limelight33 (wersja 2.2.0). Względną obfitość białka oszacowano przy użyciu znormalizowanego współczynnika obfitości widmowej (NSAF) obliczonego dla każdego białka w każdym przebiegu, jak opisano wcześniej. NSAF w odniesieniu do każdego białka uśredniono w próbkach z dwóch różnych powtórzeń biologicznych. Znakowanie 15N skutecznie zamaskowało proteom żeński, chociaż niewielką ilość nieoznakowanego białka można było wykryć w znakowanych dziewiczych próbkach. Odnotowaliśmy wykrycie redukcji białka męskiego (widma 1–5) w surowych próbkach żeńskich tylko w przebiegach technicznych, w których surowe próbki były analizowane po próbkach męskich/kryjących, w wyniku „przeniesienia” HPLC. Sporadyczne białka znalezione jako „zanieczyszczenia” w znakowanych dziewiczych próbkach są wymienione w Tabeli uzupełniającej 1.
Dwa peptydy antygenowe, QTTDRVAPAPDQQQ (w obrębie izotypu PA) i MESDGTTPSGDSEQ (w obrębie izotypu PA i PB) w programie Genscript. Dwa peptydy połączono, a następnie sprzężono z białkiem nośnikowym KLH i wstrzyknięto królikom nowozelandzkim. Króliki uśmiercono po czwartej iniekcji, a całkowite IgG wyizolowano metodą oczyszczania powinowactwa. IgG pochodzące od królika najbardziej specyficznego dla EPP wykorzystano do dalszych analiz metodą western blotting.
Do western blotów, MAG (n = 10, gdzie n oznacza liczbę biologicznie niezależnych próbek komarów) i żeńskich LRT (n = 30) od 4-dniowych dziewiczych samców i dziewiczych lub wymuszonych samic (<10 po kryciu), dodano oddzielnie bufor ekstrakcyjny białka (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% deoksycholan sodu; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× koktajl inhibitorów proteazy (Roche)). Próbki homogenizowano natychmiast po rozcięciu za pomocą beadera (2 mm szklane koraliki, 2400 obr./min, 90 s). Nierozpuszczalne zanieczyszczenia usunięto przez wirowanie przy 20 000 g w temperaturze 4 °C. Białka ilościowo oznaczono za pomocą testu Bradforda (Bio-Rad). Następnie 20 µg białka MAG, 40 µg LRT białko i 20 µg pozostałego białka zdenaturowano i rozdzielono za pomocą 10% Bis-Tris NuPAGE przy użyciu buforu MOPS. Białka przeniesiono na membrany z polifluorku winylidenu przy użyciu systemu transferowego iBlot2 (Thermo Fisher). Membrany przemyto dwukrotnie w 1× PBS-T (0,1% Tween-20 w PBS), a następnie zablokowano w buforze blokującym Odyssey (Li-Cor) przez 1 godzinę w temperaturze 22°C. Membrany wytrząsano przez noc w temperaturze 4°C z niestandardowym króliczym poliklonalnym przeciwciałem pierwotnym anty-EPP (1:700 w buforze blokującym) i szczurzym monoklonalnym przeciwciałem pierwotnym anty-aktyna MAC237 (Abeam; 1:4000). Membrany przemyto w PBS-T, a następnie inkubowano z przeciwciałami wtórnymi (osioł anty-królicze 800CW i kozie anty-szczurze 680LT (Li-Cor), oba 1:20 000) w buforze blokującym zawierającym 0,01% SDS i 0,2% Tween-20 przez 1 godzinę w temperaturze 22 °C. Membrany przemyto PBS-T i obrazowano za pomocą skanera Odyssey CLx. Obrazy zbierano i przetwarzano w programie Image Studio (wersja 5.2). Nie wykryto specyficznego pasma odpowiadającego izoformie EPP-RA (82 kDa).
Regiony kodujące EPP (jako izoforma AGAP002463-RB zawierająca domenę fosfatazy histydynowej, konserwatywne wyszukiwanie domen NCBI 34) i EcK2 (AGAP002181) sklonowano do plazmidu pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Startery wymieniono w tabeli danych rozszerzonych 2. Osiem łączników GS4 (w tandemie) wprowadzono przed znacznikiem C-końcowym 6xHis konstruktu pET-21a(+)-EcK2. Białka rekombinowane wytworzono przy użyciu reakcji syntezy białek E. coli bezkomórkowej NEBExpress (New England BioLabs). Białka rekombinowane oczyszczono przy użyciu kolumn wirowych Ni NEBExpress (New England BioLabs). Białko kontrolne reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) wytworzono przy użyciu matrycy DNA z zestawu NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Białka przechowywano w 50% glicerolu w PBS w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.
Aktywność fosfatazy EPP i ekstraktów tkankowych mierzono przy użyciu 4-nitrofenylofosforanu (pNPP; Sigma-Aldrich). Bufor reakcyjny zawierał 25 mM Tris, 50 mM kwasu octowego, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA i 1 mM DTT. Tkankę zhomogenizowano w buforze reakcyjnym, a szczątki komórek usunięto przez wirowanie. Reakcję rozpoczęto dodając enzym lub ekstrakt tkankowy do buforu reakcyjnego zawierającego 2,5 mg ml-1 pNPP. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności, a ilość pNP przekształconego z pNPP określono ilościowo, mierząc absorbancję przy 405 nm w różnych momentach.
W celu zbadania aktywności EcK in vitro białko inkubowano z 0,2 mg 20E lub 3D20E w 200 µl buforu (pH 7,5) zawierającego 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP i 10 mM MgCl2 przez 2 godz. w temp. 27°C. Reakcję zatrzymano, dodając 800 µl metanolu, a następnie schłodzono do temperatury -20°C przez 1 godzinę, po czym wirowano przy 20 000 g przez 10 minut w temp. 4°C. Następnie supernatant przeanalizowano metodą HPLC-MS/MS. Aby inaktywować cieplnie białka stosowane w grupie kontrolnej, białka inkubowano w 50% glicerolu w PBS przez 20 min w temp. 95°C.
W celu zbadania aktywności EPP in vitro białko inkubowano z 3D20E22P (w ilości odpowiadającej ilości znajdującej się w 18 parach MAG, oczyszczonej metodą HPLC-MS/MS) w 100 µl buforu (pH 7,5) zawierającego 25 mM Tris, 50 mM kwasu octowego, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA i 1 mM DTT przez 3 godziny w temperaturze 27 °C. Reakcję zatrzymano, dodając 400 µl metanolu i schłodzono do temperatury -20 °C przez 1 godzinę, a następnie wirowano przy 20 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant przeanalizowano metodą HPLC-MS/MS.
Fragmenty PCR dla EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) i EcK2 (556 pb) amplifikowano z cDNA przygotowanego z bezgłowych zwłok komarów różnej płci. Fragment PCR kontroli eGFP (495 pb) amplifikowano z wcześniej opisanego pCR2.1-eGFP; Startery PCR wymieniono w rozszerzonej tabeli danych 2. Fragment PCR wstawiono pomiędzy odwrócone promotory T7 na plazmidzie pL4440. Konstrukcje plazmidu odzyskano z kompetentnej bakterii E. coli NEB 5-α (New England Biolabs) i zweryfikowano sekwencjonowaniem DNA przed użyciem (sekwencję insertu podano w danych uzupełniających 1). Startery dopasowane do promotora T7 (rozszerzona tabela danych 2) użyto do amplifikacji insertu z plazmidu opartego na pL4440. Wielkość produktu PCR potwierdzono elektroforezą w żelu agarozowym. dsRNA transkrybowano z matryc PCR przy użyciu zestawu Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) i oczyszczono zgodnie z instrukcją producenta ze zmianami opisanymi wcześniej.
Do wstrzyknięcia dsRNA, 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) w stężeniu 10 ng nl-1 w klatkę piersiową dorosłych samców lub samic (Nanoject III, Drummond) w ciągu 1 dnia po wykluciu. Poziomy wyciszenia genu określono w co najmniej trzech powtórzeniach biologicznych poprzez ekstrakcję RNA, syntezę cDNA i RT-qPCR. Do wstrzyknięcia ekdyzonu, 4-dniowym dziewiczym lub 6-dniowym dziewiczym karmionym krwią samicom wstrzyknięto 0,13, 0,21 lub 0,63 µg 20E lub 3D20E (Nanoject III, Drummond) w stężeniach odpowiednio 1,3, 2,1, w zależności od projektu eksperymentu lub 6,3 ng nl-1. Wstrzyknij 100 nl 10% (obj./obj.) etanolu w wodzie; 100 nl 3D20E22P w 10% etanolu (co odpowiada 75% ilości znajdującej się w parze MAG). Komary przydzielono losowo do grupy otrzymującej iniekcje.
Do badań tarła 3-dniowe samice karmiono ad libitum ludzką krwią. Usuwano częściowo nakarmione lub niekarmione komary. W zależności od zastosowanego leczenia samice umieszczano w oddzielnych pojemnikach na tarło przez cztery noce, co najmniej 48 godzin po posiłku krwią. Jaja liczono pod stereoskopem (Stemi 508, Zeiss); w przypadku samic zapłodnionych, jaja, z których wykluły się larwy, uznawano za zapłodnione.
Podczas prób godowych samicom pozwolono na wytworzenie odporności na gody przez co najmniej 2 dni, w zależności od zastosowanego leczenia, a następnie do tej samej klatki wprowadzono samce dzikiego typu w tym samym wieku. Dwie noce później zapłodnione pęcherzyki samic wypreparowano, a genomowe DNA uwolniono przez zamrożenie i rozmrożenie oraz sonikację w buforze zawierającym 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA i 25 mM NaCl (pH 8,2). Próbki inkubowano z proteinazą K (0,86 µg µl-1) przez 15 minut w temperaturze 55 °C, a następnie przez 10 minut w temperaturze 95 °C. Surowe preparaty genomowego DNA rozcieńczono 10-krotnie i poddano wykrywaniu qPCR sekwencji chromosomu Y; startery wymieniono w tabeli danych rozszerzonych 2. Brak sekwencji chromosomu Y wskazuje na brak krycia.
W przypadku testów ponownego krycia, samice poddane przymusowemu kryciu badano pod kątem obecności czopów godowych, aby potwierdzić status krycia, i pozostawiono na 2 dni, aby rozwinęły oporność na krycie pod nieobecność samców, jak opisano wcześniej36. Następnie samce posiadające plemniki transgeniczne DsRed wprowadzono do klatek samic. Dwie noce później pęcherzyki zapładniające wycięto z samic, a genomowe DNA przygotowano, jak opisano powyżej, i poddano wykrywaniu qPCR transgenu DsRed; startery wymieniono w tabeli danych rozszerzonych 2. Brak transgenu DsRed wskazywał, że nie doszło do ponownego krycia.
3D20E zsyntetyzowano jak opisano wcześniej 37. W skrócie, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) rozpuszczono w 10 ml wody, a następnie dodano 30 mg czerni platynowej (w postaci proszku, Sigma-Aldrich). Do mieszaniny reakcyjnej ciągle przepuszczano łagodny strumień O2, mieszano ją w temperaturze pokojowej. Po 6 godzinach dodano 30 ml metanolu, aby zatrzymać reakcję. Mieszaninę odwirowano w celu usunięcia cząstek katalizatora. Supernatant odparowano do sucha pod próżnią w temperaturze pokojowej. Wysuszony produkt reakcji rozpuszczono w 10% etanolu i metanolu do wstrzyknięcia w celu analizy HPLC-MS/MS. Stopień konwersji (z 20E do 3D20E) wyniósł około 97% (rys. 4b), a widmo MS zsyntetyzowanego 3D20E było zgodne z widmem uzyskanym u pokrytych samic (rys. 4c).
Legenda zawiera szczegółowe informacje na temat przeprowadzonych testów statystycznych. Do przeprowadzenia testu dokładnego Fishera, testu Mantela-Coxa i testu t-Studenta użyto programu GraphPad (wersja 9.0). Testy Cochrana-Mantela-Haenszela wykonano przy użyciu skryptu R (dostępnego pod adresem https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Rozkład danych sprawdzono pod kątem normalności za pomocą testu Shapiro-Wilka z progiem istotności 0,05. Jeśli dane nie przeszły testu normalności, wykonano test Manna-Whitneya. Dane dotyczące przeżycia przeanalizowano za pomocą testu Mantela-Coxa. Do przeprowadzenia analizy różnicowej ekspresji genów metodą sekwencjonowania RNA na poziomie genów użyto pakietu DESeq2 (wersja 1.28.1). Poziomy pasek na wykresie przedstawia medianę. Jako próg istotności dla wszystkich testów zastosowano wartość P = 0,05.
Więcej informacji na temat projektu badania można znaleźć w streszczeniu raportu badawczego Nature Research Report dostępnym pod linkiem do tego artykułu.
Dane proteomiczne MS zdeponowano w ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) za pośrednictwem repozytorium partnerów PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) z identyfikatorem zbioru danych PXD032157.
Zbiór danych RNA-seq został zdeponowany w Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) pod numerem seryjnym GSE198665.
Dodatkowe zestawy danych wygenerowane i/lub przeanalizowane w trakcie bieżącego badania można uzyskać od autorów na uzasadnioną prośbę. W niniejszym artykule podano dane źródłowe.
De Loof, A. Ekdysteroidy: Zaniedbywane sterydy płciowe owadów? Samiec: Czarna skrzynka. Nauka o owadach. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroksyekdyzon i rozwój jajników u Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).