Kwas propionowy (PPA), środek przeciwgrzybiczy i powszechny dodatek do diety, powoduje nieprawidłowy rozwój neurologiczny u myszy, któremu towarzyszy dysfunkcja przewodu pokarmowego, co może być spowodowane dysbiozą jelit. Sugerowano związek między ekspozycją na PPA w diecie a dysbiozą mikrobiomu jelitowego, ale nie został on bezpośrednio zbadany. W niniejszej pracy zbadaliśmy zmiany w składzie mikrobiomu jelitowego związane z PPA, które mogą prowadzić do dysbiozy. Mikrobiomy jelitowe myszy karmionych dietą nieleczoną (n=9) i dietą wzbogaconą w PPA (n=13) zostały sekwencjonowane przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego dalekiego zasięgu w celu oceny różnic w składzie mikrobiologicznym i szlakach metabolicznych bakterii. Dieta z PPA wiązała się ze wzrostem liczebności istotnych taksonów, w tym kilku gatunków Bacteroides, Prevotella i Ruminococcus, których przedstawiciele byli wcześniej powiązani z produkcją PPA. Mikrobiomy myszy narażonych na działanie PPA wykazywały również większą liczbę szlaków związanych z metabolizmem lipidów i biosyntezą hormonów steroidowych. Nasze wyniki wskazują, że PPA może zmieniać mikrobiotę jelitową i powiązane z nią szlaki metaboliczne. Zaobserwowane zmiany wskazują, że konserwanty klasyfikowane jako bezpieczne do spożycia mogą wpływać na skład mikrobioty jelitowej, a tym samym na zdrowie człowieka. Spośród nich wybiera się P, G lub S w zależności od analizowanego poziomu klasyfikacji. Aby zminimalizować wpływ fałszywie pozytywnych klasyfikacji, przyjęto minimalny próg względnej liczebności 1e-4 (1/10 000 odczytów). Przed analizą statystyczną względne liczebności podane przez Brackena (fraction_total_reads) zostały przekształcone za pomocą transformacji centrowanego logarytmu ilorazu (CLR) (Aitchison, 1982). Metoda CLR została wybrana do transformacji danych, ponieważ jest niezmienna w skali i wystarczająca dla nierozrzedzonych zbiorów danych (Gloor i in., 2017). Transformacja CLR wykorzystuje logarytm naturalny. Dane liczbowe podane przez Brackena zostały znormalizowane za pomocą względnego wyrażenia logarytmicznego (RLE) (Anders i Huber, 2010). Rysunki wygenerowano przy użyciu kombinacji matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 i logarytmów sekwencyjnych (Gloor i in., 2017). 0.12.2 i stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier i in., 2022). Współczynnik Bacillus/Bacteroidetes obliczono dla każdej próbki przy użyciu znormalizowanej liczby bakterii. Wartości podane w tabelach zaokrąglono do 4 miejsc po przecinku. Wskaźnik różnorodności Simpsona obliczono przy użyciu skryptu alpha_diversity.py zawartego w pakiecie KrakenTools v. 1.2 (Lu i in., 2022). Raport Brackena znajduje się w skrypcie, a indeks Simpsona „Si” podano dla parametru -an. Istotne różnice w liczebności zdefiniowano jako średnie różnice CLR ≥ 1 lub ≤ -1. Średnia różnica CLR wynosząca ±1 wskazuje na 2,7-krotny wzrost liczebności danego typu próbki. Znak (+/-) wskazuje, czy takson jest bardziej liczny odpowiednio w próbce PPA i próbce kontrolnej. Istotność statystyczną określono za pomocą testu U Manna-Whitneya (Virtanen i in., 2020). Wykorzystano model statystyczny Statsmodels w wersji 0,14 (Benjamini i Hochberg, 1995; Seabold i Perktold, 2010), a w celu skorygowania wielokrotnych testów zastosowano procedurę Benjaminiego-Hochberga. Jako próg istotności statystycznej przyjęto skorygowaną wartość p ≤ 0,05.
Mikrobiom ludzki jest często nazywany „ostatnim organem ciała” i odgrywa kluczową rolę w zdrowiu człowieka (Baquero i Nombela, 2012). W szczególności mikrobiom jelitowy jest uznawany za wpływ na cały organizm i odgrywający wiele istotnych funkcji. Bakterie komensalne występują licznie w jelitach, zajmując liczne nisze ekologiczne, wykorzystując składniki odżywcze i konkurując z potencjalnymi patogenami (Jandhyala i in., 2015). Zróżnicowane składniki bakteryjne mikrobiomu jelitowego są zdolne do produkcji niezbędnych składników odżywczych, takich jak witaminy, i wspomagają trawienie (Rowland i in., 2018). Wykazano również, że metabolity bakteryjne wpływają na rozwój tkanek oraz wzmacniają szlaki metaboliczne i immunologiczne (Heijtz i in., 2011; Yu i in., 2022). Skład mikrobiomu jelitowego człowieka jest niezwykle zróżnicowany i zależy od czynników genetycznych i środowiskowych, takich jak dieta, płeć, przyjmowane leki i stan zdrowia (Kumbhare i in., 2019).
Dieta matki jest kluczowym elementem rozwoju płodu i noworodka oraz potencjalnym źródłem związków, które mogą wpływać na rozwój (Bazer i in., 2004; Innis, 2014). Jednym z takich interesujących związków jest kwas propionowy (PPA), krótkołańcuchowy kwas tłuszczowy, produkt uboczny fermentacji bakteryjnej i dodatek do żywności (den Besten i in., 2013). PPA ma właściwości przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, dlatego jest stosowany jako środek konserwujący żywność oraz w zastosowaniach przemysłowych do hamowania rozwoju pleśni i bakterii (Wemmenhove i in., 2016). PPA wykazuje zróżnicowane działanie w różnych tkankach. W wątrobie PPA działa przeciwzapalnie, wpływając na ekspresję cytokin w makrofagach (Kawasoe i in., 2022). Ten efekt regulacyjny zaobserwowano również w innych komórkach układu odpornościowego, prowadząc do zmniejszenia stanu zapalnego (Haase i in., 2021). Jednak w mózgu zaobserwowano odwrotny efekt. Poprzednie badania wykazały, że ekspozycja na PPA indukuje zachowania typowe dla autyzmu u myszy (El-Ansary i in., 2012). Inne badania wykazały, że PPA może indukować gliozę i aktywować szlaki prozapalne w mózgu (Abdelli i in., 2019). Ponieważ PPA jest słabym kwasem, może dyfundować przez nabłonek jelitowy do krwiobiegu, a tym samym przekraczać bariery restrykcyjne, w tym barierę krew-mózg, a także łożysko (Stinson i in., 2019), co podkreśla znaczenie PPA jako metabolitu regulacyjnego wytwarzanego przez bakterie. Chociaż potencjalna rola PPA jako czynnika ryzyka autyzmu jest obecnie przedmiotem badań, jego wpływ na osoby z autyzmem może wykraczać poza indukowanie różnicowania neuronalnego.
Objawy żołądkowo-jelitowe, takie jak biegunka i zaparcia, często występują u pacjentów z zaburzeniami neurorozwojowymi (Cao i in., 2021). Wcześniejsze badania wykazały, że mikrobiom pacjentów z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD) różni się od mikrobiomu osób zdrowych, co sugeruje obecność dysbiozy mikrobioty jelitowej (Finegold i in., 2010). Podobnie, mikrobiom pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit, otyłością, chorobą Alzheimera itp. różni się od mikrobiomu osób zdrowych (Turnbaugh i in., 2009; Vogt i in., 2017; Henke i in., 2019). Jednakże, jak dotąd nie wykazano związku przyczynowo-skutkowego między mikrobiomem jelitowym a chorobami lub objawami neurologicznymi (Yap i in., 2021), chociaż uważa się, że kilka gatunków bakterii odgrywa rolę w niektórych z tych stanów chorobowych. Na przykład, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio i inne rodzaje występują liczniej w mikrobiomie pacjentów z autyzmem (Tomova i in., 2015; Golubeva i in., 2017; Cristiano i in., 2018; Zurita i in., 2020). Warto zauważyć, że gatunki należące do niektórych z tych rodzajów posiadają geny związane z produkcją PPA (Reichardt i in., 2014; Yun i Lee, 2016; Zhang i in., 2019; Baur i Dürre, 2023). Biorąc pod uwagę właściwości przeciwdrobnoustrojowe PPA, zwiększenie jego liczebności może być korzystne dla wzrostu bakterii produkujących PPA (Jacobson i in., 2018). Zatem środowisko bogate w PFA może prowadzić do zmian w mikrobiomie jelitowym, w tym patogenów żołądkowo-jelitowych, które mogą być potencjalnymi czynnikami wywołującymi objawy żołądkowo-jelitowe.
Kluczowym pytaniem w badaniach nad mikrobiomem jest to, czy różnice w składzie mikrobiologicznym są przyczyną, czy objawem chorób. Pierwszym krokiem w kierunku wyjaśnienia złożonej relacji między dietą, mikrobiomem jelitowym a chorobami neurologicznymi jest ocena wpływu diety na skład mikrobiologiczny. W tym celu wykorzystaliśmy sekwencjonowanie metagenomiczne z długimi odczytami, aby porównać mikrobiomy jelitowe potomstwa myszy karmionych dietą bogatą w PPA lub zubożoną w PPA. Potomstwo otrzymywało tę samą dietę, co ich matki. Postawiliśmy hipotezę, że dieta bogata w PPA będzie powodować zmiany w składzie mikrobiologicznym jelit i szlakach funkcjonalnych mikroorganizmów, szczególnie tych związanych z metabolizmem PPA i/lub produkcją PPA.
W badaniu wykorzystano transgeniczne myszy FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories), które nadeksprymują zielone białko fluorescencyjne (GFP) pod kontrolą specyficznego dla komórek glejowych promotora GFAP, zgodnie z wytycznymi Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Centralnej Florydy (UCF-IACUC) (numer zezwolenia na użytkowanie zwierząt: PROTO202000002). Po odstawieniu od piersi myszy trzymano pojedynczo w klatkach, po 1–5 osobników każdej płci w każdej klatce. Myszy karmiono ad libitum oczyszczoną dietą kontrolną (zmodyfikowana standardowa dieta otwarta, 16 kcal% tłuszczu) lub dietą wzbogaconą w propionian sodu (zmodyfikowana standardowa dieta otwarta, 16 kcal% tłuszczu, zawierająca 5000 ppm propionianu sodu). Ilość użytego propionianu sodu odpowiadała 5000 mg PFA/kg całkowitej masy żywności. Jest to najwyższe stężenie PPA zatwierdzone do stosowania jako konserwant żywności. Aby przygotować się do tego badania, rodzicielskie myszy karmiono obiema dietami przez 4 tygodnie przed kryciem i kontynuowano przez cały okres ciąży samicy. Potomstwo myszy [22 myszy, 9 kontrolnych (6 samców, 3 samice) i 13 PPA (4 samce, 9 samic)] odstawiono od piersi, a następnie kontynuowano karmienie samicy tą samą dietą przez 5 miesięcy. Potomstwo myszy uśmiercono w wieku 5 miesięcy, a ich zawartość kału jelitowego zebrano i początkowo przechowywano w 1,5 ml probówkach mikrocentrifugowych w temperaturze -20°C, a następnie przeniesiono do zamrażarki o temperaturze -80°C, aż do wyczerpania DNA gospodarza i ekstrakcji kwasów nukleinowych drobnoustrojów.
DNA gospodarza usunięto zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem (Charalampous i in., 2019). W skrócie, zawartość kału przeniesiono do 500 µl InhibitEX (Qiagen, nr kat./ID: 19593) i przechowywano w stanie zamrożonym. Przetworzyć maksymalnie 1-2 peletki kału na ekstrakcję. Zawartość kału zhomogenizowano mechanicznie za pomocą plastikowego tłuczka wewnątrz probówki, aby utworzyć zawiesinę. Wirować próbki z prędkością 10 000 RCF przez 5 minut lub do momentu zbrylenia próbek, a następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić peletki w 250 µl 1× PBS. Dodać do próbki 250 µl 4,4% roztworu saponiny (TCI, numer produktu S0019) jako detergent rozluźniający błony komórkowe eukariotów. Próbki delikatnie wymieszano do uzyskania gładkiej konsystencji i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie, w celu rozbicia komórek eukariotycznych, do próbki dodano 350 μl wody wolnej od nukleaz, inkubowano przez 30 s, a następnie dodano 12 μl 5 M NaCl. Próbki wirowano z prędkością 6000 RCF przez 5 minut. Odessano supernatant i ponownie zawieszono osad w 100 μl 1X PBS. Aby usunąć DNA gospodarza, dodano 100 μl buforu HL-SAN (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml wody wolnej od nukleaz) i 10 μl enzymu HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Próbki dokładnie wymieszano przez pipetowanie i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut przy 800 obr./min w urządzeniu Eppendorf™ ThermoMixer C. Po inkubacji wirowano z prędkością 6000 RCF przez 3 minuty i dwukrotnie przemywano 800 µl i 1000 µl 1X PBS. Na koniec zawiesino osad w 100 µl 1X PBS.
Całkowite DNA bakteryjne wyizolowano za pomocą zestawu New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, nr kat. T3010L). Standardowa procedura obsługi dołączona do zestawu została nieznacznie zmodyfikowana. Przed użyciem, w celu ostatecznej elucji, inkubować i utrzymywać wodę wolną od nukleaz w temperaturze 60°C. Do każdej próbki dodać 10 µl proteinazy K i 3 µl rybonukleazy A. Następnie dodać 100 µl buforu do lizy komórek i delikatnie wymieszać. Próbki inkubowano w urządzeniu Eppendorf™ ThermoMixer C w temperaturze 56°C i przy 1400 obr./min przez co najmniej 1 godzinę, a maksymalnie 3 godziny. Inkubowane próbki wirowano z prędkością 12 000 RCF przez 3 minuty, a supernatant z każdej próbki przeniesiono do oddzielnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, zawierającej 400 µl roztworu wiążącego. Następnie probówki wirowano pulsacyjnie przez 5–10 sekund w odstępach 1-sekundowych. Przeniesiono całą płynną zawartość każdej próbki (około 600–700 µl) do wkładu filtracyjnego umieszczonego w przepływowej probówce zbiorczej. Probówki wirowano przy 1000 RCF przez 3 minuty, aby umożliwić wstępne wiązanie DNA, a następnie wirowano przy 12000 RCF przez 1 minutę w celu usunięcia resztek płynu. Kolumnę z próbką przeniesiono do nowej probówki zbiorczej, a następnie przemyto dwukrotnie. Do pierwszego płukania dodano 500 µl buforu do płukania do każdej probówki. Odwrócono probówkę 3–5 razy, a następnie wirowano przy 12000 RCF przez 1 minutę. Wylano płyn z probówki zbiorczej i umieszczono wkład filtracyjny z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Do drugiego płukania dodano 500 µl buforu do płukania do filtra bez odwracania. Próbki wirowano przy 12000 RCF przez 1 minutę. Przenieść filtr do probówki LoBind® o pojemności 1,5 ml i dodać 100 µl podgrzanej wody wolnej od nukleaz. Filtry inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, a następnie wirowano z prędkością 12 000 RCF przez 1 minutę. Eluowane DNA przechowywano w temperaturze -80°C.
Stężenie DNA określono ilościowo za pomocą fluorometru Qubit™ 4.0. DNA przygotowano za pomocą zestawu Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (nr kat. Q33231) zgodnie z instrukcją producenta. Dystrybucję długości fragmentów DNA zmierzono za pomocą urządzenia TapeStation Aglient™ 4150 lub 4200. DNA przygotowano za pomocą odczynników Agilent™ Genomic DNA Reagents (nr kat. 5067-5366) i taśmy Genomic DNA ScreenTape (nr kat. 5067-5365). Przygotowanie biblioteki przeprowadzono za pomocą zestawu Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) zgodnie z instrukcją producenta. Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono za pomocą sekwencera ONT GridION™ Mk1 z komorą przepływową Min106D (R 9.4.1). Ustawienia sekwencjonowania obejmowały: wysoką dokładność wywołania zasad, minimalną wartość q równą 9, konfigurację kodu kreskowego i przycięcie kodu kreskowego. Próbki sekwencjonowano przez 72 godziny, po czym dane wywołania zasad przekazano do dalszego przetwarzania i analizy.
Przetwarzanie bioinformatyczne przeprowadzono przy użyciu wcześniej opisanych metod (Greenman i in., 2024). Pliki FASTQ uzyskane z sekwencjonowania podzielono na katalogi dla każdej próbki. Przed analizą bioinformatyczną dane przetworzono w następujący sposób: najpierw pliki FASTQ próbek połączono w jeden plik FASTQ. Następnie odczyty krótsze niż 1000 pb filtrowano za pomocą programu Filtlong w wersji 0.2.1, a jedynym zmienionym parametrem było –min_length 1000 (Wick, 2024). Przed dalszą filtracją jakość odczytu kontrolowano za pomocą programu NanoPlot w wersji 1.41.3 z następującymi parametrami: –fastq –plots dot –N50 -o
Do klasyfikacji taksonomicznej, odczyty i złożone kontigi klasyfikowano przy użyciu programu Kraken2 w wersji 2.1.2 (Wood i in., 2019). Wygeneruj raporty i pliki wyjściowe odpowiednio dla odczytów i złożonych zestawów. Użyj opcji –use-names do analizy odczytów i złożonych zestawów. Opcje –gzip-compressed i –paired są określone dla segmentów odczytu. Względną liczebność taksonów w metagenomach oszacowano przy użyciu programu Bracken w wersji 2.8 (Lu i in., 2017). Najpierw utworzyliśmy bazę danych kmer zawierającą 1000 zasad przy użyciu polecenia bracken-build z następującymi parametrami: -d
Adnotację genu i oszacowanie względnej liczebności przeprowadzono przy użyciu zmodyfikowanej wersji protokołu opisanego przez Marangę i in. (Maranga i in., 2023). Najpierw usunięto kontigi krótsze niż 500 pz ze wszystkich zespołów za pomocą SeqKit w wersji 2.5.1 (Shen i in., 2016). Wybrane zespoły następnie połączono w pan-metagenom. Otwarte ramki odczytu (ORF) zidentyfikowano za pomocą Prodigal w wersji 1.0.1 (równoległej wersji Prodigal w wersji 2.6.3) z następującymi parametrami: -d
Geny pogrupowano najpierw według identyfikatorów ortologów (KO) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) przypisanych przez eggNOG w celu porównania liczebności szlaków genowych. Geny bez knockoutów lub geny z wieloma knockoutami zostały usunięte przed analizą. Następnie obliczono średnią liczebność każdego KO na próbkę i przeprowadzono analizę statystyczną. Geny metabolizmu PPA zdefiniowano jako każdy gen, któremu przypisano wiersz ko00640 w kolumnie KEGG_Pathway, wskazujący na rolę w metabolizmie propionianu zgodnie z KEGG. Geny zidentyfikowane jako związane z produkcją PPA wymieniono w Tabeli uzupełniającej 1 (Reichardt i in., 2014; Yang i in., 2017). Przeprowadzono testy permutacyjne w celu zidentyfikowania genów metabolizmu i produkcji PPA, które były istotnie liczniejsze w każdym typie próbki. Dla każdego analizowanego genu wykonano tysiąc permutacji. Wartość p 0,05 została użyta jako punkt odcięcia w celu określenia istotności statystycznej. Adnotacje funkcjonalne przypisano poszczególnym genom w klastrze na podstawie adnotacji reprezentatywnych genów w klastrze. Taksony związane z metabolizmem PPA i/lub produkcją PPA można było zidentyfikować, dopasowując identyfikatory kontigów w plikach wyjściowych Kraken2 do tych samych identyfikatorów kontigów zachowanych podczas adnotacji funkcjonalnej za pomocą eggNOG. Test istotności przeprowadzono za pomocą opisanego wcześniej testu U Manna-Whitneya. Korektę dla testów wielokrotnych przeprowadzono za pomocą procedury Benjaminiego-Hochberga. Jako punkt odcięcia do określenia istotności statystycznej przyjęto wartość p ≤ 0,05.
Różnorodność mikrobiomu jelitowego myszy oceniono za pomocą wskaźnika różnorodności Simpsona. Nie zaobserwowano istotnych różnic między próbkami kontrolnymi a próbkami PPA pod względem różnorodności rodzajowej i gatunkowej (wartość p dla rodzaju: 0,18, wartość p dla gatunku: 0,16) (Rysunek 1). Następnie porównano skład mikrobiologiczny za pomocą analizy głównych składowych (PCA). Rysunek 2 przedstawia klasteryzacja próbek według ich typów, co wskazuje na różnice w składzie gatunkowym mikrobiomów między próbkami PPA a próbkami kontrolnymi. Klasteryzacja ta była mniej wyraźna na poziomie rodzaju, co sugeruje, że PPA wpływa na niektóre bakterie (Rysunek uzupełniający 1).
Rycina 1. Różnorodność alfa rodzajów i skład gatunkowy mikrobiomu jelitowego myszy. Wykresy pudełkowe przedstawiające wskaźniki różnorodności Simpsona rodzajów (A) i gatunków (B) w próbkach PPA i kontrolnych. Istotność statystyczną określono za pomocą testu U Manna-Whitneya, a korektę wielokrotną wykonano za pomocą procedury Benjaminiego-Hochberga. ns, wartość p nie była istotna statystycznie (p>0,05).
Rysunek 2. Wyniki analizy głównych składowych składu mikrobiomu jelitowego myszy na poziomie gatunku. Wykres analizy głównych składowych przedstawia rozkład próbek w odniesieniu do ich dwóch pierwszych głównych składowych. Kolory oznaczają rodzaj próbki: myszy narażone na działanie PPA są fioletowe, a myszy kontrolne – żółte. Główne składowe 1 i 2 są naniesione odpowiednio na osi x i y i wyrażone jako ich wyjaśniony współczynnik wariancji.
Korzystając z danych liczbowych po transformacji RLE, zaobserwowano istotny spadek mediany stosunku Bacteroidetes/Bacilli u myszy kontrolnych i myszy z grupy PPA (kontrola: 9,66, PPA: 3,02; wartość p = 0,0011). Różnica ta wynikała z większej liczebności bakterii Bacteroidetes u myszy z grupy PPA w porównaniu z myszami z grupy kontrolnej, chociaż różnica ta nie była istotna statystycznie (średnia wartość CLR w grupie kontrolnej: 5,51, średnia wartość CLR w grupie PPA: 6,62; wartość p = 0,054), podczas gdy liczebność bakterii Bacteroidetes była podobna (średnia wartość CLR w grupie kontrolnej: 7,76, średnia wartość CLR w grupie PPA: 7,60; wartość p = 0,18).
Analiza liczebności przedstawicieli taksonomicznych mikrobiomu jelitowego wykazała, że 1 typ i 77 gatunków różniły się istotnie między próbkami PPA i kontrolnymi (Tabela uzupełniająca 2). Liczebność 59 gatunków w próbkach PPA była istotnie wyższa niż w próbkach kontrolnych, podczas gdy liczebność zaledwie 16 gatunków w próbkach kontrolnych była wyższa niż w próbkach PPA (Rysunek 3).
Rycina 3. Różnice w liczebności taksonów w mikrobiomie jelitowym myszy PPA i kontrolnych. Wykresy wulkaniczne przedstawiają różnice w liczebności rodzajów (A) lub gatunków (B) między próbkami PPA i kontrolnymi. Szare kropki oznaczają brak istotnych różnic w liczebności taksonów. Kolorowe kropki oznaczają istotne różnice w liczebności (wartość p ≤ 0,05). 20 największych taksonów o największych różnicach w liczebności między typami próbek pokazano odpowiednio na czerwono i jasnoniebiesko (próbki kontrolne i PPA). Żółte i fioletowe kropki były co najmniej 2,7 razy bardziej liczne w próbkach kontrolnych lub PPA niż w kontrolnych. Czarne kropki oznaczają taksony o istotnie różnych liczebnościach, ze średnimi różnicami CLR między -1 a 1. Wartości p obliczono za pomocą testu U Manna-Whitneya i skorygowano o wielokrotne testowanie za pomocą procedury Benjaminiego-Hochberga. Pogrubione średnie różnice CLR oznaczają istotne różnice w liczebności.
Po przeanalizowaniu składu mikroflory jelitowej przeprowadziliśmy adnotację funkcjonalną mikrobiomu. Po odfiltrowaniu genów niskiej jakości, zidentyfikowano łącznie 378 355 unikalnych genów we wszystkich próbkach. Przekształconą liczebność tych genów wykorzystano do analizy głównych składowych (PCA), a wyniki wykazały wysoki stopień grupowania typów próbek na podstawie ich profili funkcjonalnych (ryc. 4).
Rysunek 4. Wyniki analizy PCA z wykorzystaniem profilu funkcjonalnego mikrobiomu jelitowego myszy. Wykres PCA przedstawia rozkład próbek w odniesieniu do ich dwóch pierwszych głównych składowych. Kolory oznaczają rodzaj próbki: myszy narażone na działanie PPA są fioletowe, a myszy kontrolne – żółte. Główne składowe 1 i 2 są naniesione odpowiednio na osi x i y i wyrażone jako ich wyjaśniony współczynnik wariancji.
Następnie przeanalizowaliśmy liczebność knockoutów genu KEGG w różnych typach próbek. Zidentyfikowano łącznie 3648 unikalnych knockoutów, z czego 196 było istotnie liczniejszych w próbkach kontrolnych, a 106 było liczniejszych w próbkach PPA (ryc. 5). W próbkach kontrolnych wykryto łącznie 145 genów, a w próbkach PPA – 61 genów, o istotnie różniących się liczebnościach. Szlaki związane z metabolizmem lipidów i aminocukrów były istotnie bardziej liczne w próbkach PPA (Tabela uzupełniająca 3). Szlaki związane z metabolizmem azotu i układami przekaźników siarki były istotnie bardziej liczne w próbkach kontrolnych (Tabela uzupełniająca 3). Liczebność genów związanych z metabolizmem aminocukrów/nukleotydów (ko:K21279) i metabolizmem fosforanu inozytolu (ko:K07291) była istotnie wyższa w próbkach PPA (ryc. 5). W próbkach kontrolnych stwierdzono istotnie więcej genów związanych z metabolizmem benzoesanu (ko:K22270), metabolizmem azotu (ko:K00368) i glikolizą/glukoneogenezą (ko:K00131) (ryc. 5).
Rys. 5. Zróżnicowana liczebność KO w mikrobiomie jelitowym myszy PPA i kontrolnych. Wykres wulkaniczny przedstawia różnice w liczebności grup funkcyjnych (KO). Szare kropki oznaczają KO, których liczebność nie różniła się istotnie między typami próbek (wartość p > 0,05). Kolorowe kropki oznaczają istotne różnice w liczebności (wartość p ≤ 0,05). 20 KO z największymi różnicami w liczebności między typami próbek pokazano na czerwono i jasnoniebiesko, co odpowiada odpowiednio próbkom kontrolnym i PPA. Żółte i fioletowe kropki oznaczają KO, które były co najmniej 2,7 razy liczniejsze odpowiednio w próbkach kontrolnych i PPA. Czarne kropki oznaczają KO o istotnie różnej liczebności, ze średnimi różnicami CLR między -1 a 1. Wartości p obliczono za pomocą testu U Manna-Whitneya i skorygowano o wielokrotne porównania za pomocą procedury Benjaminiego-Hochberga. NaN oznacza, że KO nie należy do szlaku w KEGG. Pogrubione średnie wartości różnic CLR wskazują na istotne różnice w liczebności. Szczegółowe informacje na temat szlaków, do których należą wymienione KO, znajdują się w tabeli uzupełniającej 3.
Spośród adnotowanych genów, 1601 genów wykazywało istotnie różną liczebność między typami próbek (p ≤ 0,05), przy czym każdy gen był co najmniej 2,7-krotnie bardziej liczny. Spośród tych genów, 4 geny były bardziej liczne w próbkach kontrolnych, a 1597 genów było bardziej liczne w próbkach PPA. Ponieważ PPA ma właściwości przeciwdrobnoustrojowe, zbadaliśmy liczebność genów metabolizmu i produkcji PPA między typami próbek. Spośród 1332 genów związanych z metabolizmem PPA, 27 genów było istotnie bardziej licznych w próbkach kontrolnych, a 12 genów było bardziej licznych w próbkach PPA. Spośród 223 genów związanych z produkcją PPA, 1 gen był istotnie bardziej liczny w próbkach PPA. Rysunek 6A dodatkowo pokazuje większą liczebność genów zaangażowanych w metabolizm PPA, ze istotnie większą liczebnością w próbkach kontrolnych i dużymi rozmiarami efektu, podczas gdy rysunek 6B podkreśla poszczególne geny o istotnie większej liczebności obserwowanej w próbkach PPA.
Rys. 6. Zróżnicowana liczebność genów związanych z PPA w mikrobiomie jelitowym myszy. Wykresy wulkaniczne przedstawiają różnice w liczebności genów związanych z metabolizmem PPA (A) i produkcją PPA (B). Szare kropki oznaczają geny, których liczebność nie różniła się istotnie między typami próbek (wartość p > 0,05). Kolorowe kropki oznaczają istotne różnice w liczebności (wartość p ≤ 0,05). 20 genów o największych różnicach w liczebności przedstawiono odpowiednio na czerwono i jasnoniebiesko (próbki kontrolne i PPA). Liczebność żółtych i fioletowych kropek była co najmniej 2,7 razy większa w próbkach kontrolnych i PPA niż w próbkach kontrolnych. Czarne kropki oznaczają geny o istotnie różnych liczebnościach, ze średnimi różnicami CLR między -1 a 1. Wartości p obliczono za pomocą testu U Manna-Whitneya i skorygowano o wielokrotne porównania za pomocą procedury Benjaminiego-Hochberga. Geny odpowiadają reprezentatywnym genom w katalogu genów nieredundantnych. Nazwy genów składają się z symbolu KEGG oznaczającego gen KO. Pogrubione średnie różnice CLR wskazują na znacząco różne liczebności. Myślnik (-) oznacza brak symbolu dla danego genu w bazie danych KEGG.
Taksony z genami związanymi z metabolizmem i/lub produkcją PPA zidentyfikowano poprzez dopasowanie tożsamości taksonomicznej kontigów do identyfikatora kontigu genu. Na poziomie rodzaju stwierdzono, że 130 rodzajów posiadało geny związane z metabolizmem PPA, a 61 rodzajów posiadało geny związane z produkcją PPA (Tabela uzupełniająca 4). Jednak żaden rodzaj nie wykazał istotnych różnic w liczebności (p > 0,05).
Na poziomie gatunku stwierdzono, że 144 gatunki bakterii mają geny związane z metabolizmem PPA, a 68 gatunków bakterii ma geny związane z produkcją PPA (Tabela uzupełniająca 5). Spośród metabolizerów PPA, osiem bakterii wykazało istotny wzrost liczebności między typami próbek, a wszystkie wykazały istotne zmiany w efekcie (Tabela uzupełniająca 6). Wszystkie zidentyfikowane metabolizery PPA o istotnych różnicach w liczebności były liczniejsze w próbkach PPA. Klasyfikacja na poziomie gatunku ujawniła przedstawicieli rodzajów, które nie różniły się istotnie między typami próbek, w tym kilka gatunków Bacteroides i Ruminococcus, a także Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus i Alcaligenes polymorpha. Spośród bakterii wytwarzających PPA, cztery bakterie wykazały istotne różnice w liczebności między typami próbek. Gatunki o istotnych różnicach w liczebności obejmowały Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis i Ruminococcus bovis.
W niniejszym badaniu przeanalizowaliśmy wpływ ekspozycji na PPA na mikrobiotę jelitową myszy. PPA może wywoływać zróżnicowane reakcje u bakterii, ponieważ jest produkowany przez niektóre gatunki, wykorzystywany jako źródło pożywienia przez inne gatunki lub ma działanie przeciwdrobnoustrojowe. Dlatego też jego dodanie do środowiska jelitowego poprzez suplementację diety może mieć różne skutki w zależności od tolerancji, wrażliwości i zdolności do wykorzystania go jako źródła składników odżywczych. Wrażliwe gatunki bakterii mogą zostać wyeliminowane i zastąpione przez te, które są bardziej odporne na PPA lub zdolne do wykorzystania go jako źródła pożywienia, co prowadzi do zmian w składzie mikrobioty jelitowej. Nasze wyniki ujawniły istotne różnice w składzie mikrobiomu, ale nie miały wpływu na ogólną różnorodność mikroorganizmów. Największe efekty zaobserwowano na poziomie gatunkowym, przy czym ponad 70 taksonów istotnie różniło się liczebnością między próbkami z PPA a próbkami kontrolnymi (Tabela uzupełniająca 2). Dalsza ocena składu próbek z ekspozycją na PPA ujawniła większą heterogeniczność gatunków drobnoustrojów w porównaniu z próbkami bez ekspozycji, co sugeruje, że PPA może wzmacniać charakterystykę wzrostu bakterii i ograniczać populacje bakterii, które mogą przetrwać w środowiskach bogatych w PPA. PPA może zatem wybiórczo indukować zmiany, zamiast powodować powszechne zaburzenia w różnorodności mikrobiomu jelitowego.
Wykazano już, że konserwanty żywności, takie jak PPA, zmieniają liczebność składników mikrobiomu jelitowego bez wpływu na jego ogólną różnorodność (Nagpal i in., 2021). W niniejszym badaniu zaobserwowaliśmy najbardziej uderzające różnice między gatunkami Bacteroidetes w obrębie typu Bacteroidetes (wcześniej znanego jako Bacteroidetes), których liczebność znacznie wzrosła u myszy narażonych na działanie PPA. Zwiększona liczebność gatunków Bacteroides wiąże się ze wzmożoną degradacją śluzu, co może zwiększać ryzyko infekcji i sprzyjać stanom zapalnym (Cornick i in., 2015; Desai i in., 2016; Penzol i in., 2019). Jedno z badań wykazało, że nowonarodzone samce myszy leczone bakterią Bacteroides fragilis wykazywały zachowania społeczne przypominające zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD) (Carmel i in., 2023), a inne badania wykazały, że bakterie z rodzaju Bacteroides mogą zmieniać aktywność układu odpornościowego i prowadzić do kardiomiopatii zapalnej o podłożu autoimmunologicznym (Gil-Cruz i in., 2019). U myszy narażonych na działanie PPA stwierdzono również znaczny wzrost liczby gatunków należących do rodzajów Ruminococcus, Prevotella i Parabacteroides (Coretti i in., 2018). Niektóre gatunki Ruminococcus są związane z chorobami takimi jak choroba Leśniowskiego-Crohna poprzez produkcję cytokin prozapalnych (Henke i in., 2019), podczas gdy gatunki Prevotella, takie jak Prevotella humani, są związane z chorobami metabolicznymi, takimi jak nadciśnienie tętnicze i insulinooporność (Pedersen i in., 2016; Li i in., 2017). Wreszcie stwierdziliśmy, że stosunek bakterii Bacteroidetes (wcześniej znanych jako Firmicutes) do bakterii Bacteroidetes był istotnie niższy u myszy narażonych na PPA niż u myszy kontrolnych, ze względu na wyższą całkowitą liczebność gatunków Bacteroidetes. Wykazano wcześniej, że stosunek ten jest ważnym wskaźnikiem homeostazy jelitowej, a zaburzenia tego stosunku były powiązane z różnymi stanami chorobowymi (Turpin i in., 2016; Takezawa i in., 2021; An i in., 2023), w tym z nieswoistymi zapaleniami jelit (Stojanov i in., 2020). Ogólnie rzecz biorąc, gatunki z typu Bacteroidetes wydają się być najsilniej dotknięte podwyższonym poziomem PPA w diecie. Może to wynikać z wyższej tolerancji na PPA lub zdolności do wykorzystywania PPA jako źródła energii, co wykazano w przypadku co najmniej jednego gatunku, Hoylesella enocea (Hitch i in., 2022). Alternatywnie, narażenie matki na działanie PPA może poprawić rozwój płodu, czyniąc jelita potomstwa myszy bardziej podatnymi na kolonizację bakteriami Bacteroidetes; jednak projekt naszego badania nie pozwalał na taką ocenę.
Ocena zawartości metagenomicznej ujawniła istotne różnice w liczebności genów związanych z metabolizmem i produkcją PPA, przy czym myszy narażone na działanie PPA wykazywały większą liczebność genów odpowiedzialnych za produkcję PPA, podczas gdy myszy nienarażone na działanie PPA wykazywały większą liczebność genów odpowiedzialnych za metabolizm PAA (ryc. 6). Wyniki te sugerują, że wpływ PPA na skład mikrobiologiczny może nie wynikać wyłącznie z jego stosowania, w przeciwnym razie liczebność genów związanych z metabolizmem PPA powinna być wyższa w mikrobiomie jelitowym myszy narażonych na działanie PPA. Jednym z wyjaśnień jest to, że PPA wpływa na liczebność bakterii głównie poprzez swoje działanie przeciwdrobnoustrojowe, a nie poprzez wykorzystanie go przez bakterie jako składnika odżywczego. Wcześniejsze badania wykazały, że PPA hamuje wzrost Salmonella Typhimurium w sposób zależny od dawki (Jacobson i in., 2018). Ekspozycja na wyższe stężenia PPA może prowadzić do selekcji bakterii opornych na jego właściwości przeciwdrobnoustrojowe i niekoniecznie zdolnych do jego metabolizowania lub produkcji. Na przykład, kilka gatunków Parabacteroides wykazało istotnie wyższą liczebność w próbkach PPA, ale nie wykryto żadnych genów związanych z metabolizmem lub produkcją PPA (tabele uzupełniające 2, 4 i 5). Ponadto produkcja PPA jako produktu ubocznego fermentacji jest szeroko rozpowszechniona wśród różnych bakterii (Gonzalez-Garcia i in., 2017). Większa różnorodność bakteryjna może być przyczyną wyższej liczebności genów związanych z metabolizmem PPA w próbkach kontrolnych (Averina i in., 2020). Co więcej, tylko 27 (2,14%) z 1332 genów było przewidywanych jako geny związane wyłącznie z metabolizmem PPA. Wiele genów związanych z metabolizmem PPA jest również zaangażowanych w inne szlaki metaboliczne. To dodatkowo dowodzi, że liczebność genów zaangażowanych w metabolizm PPA była wyższa w próbkach kontrolnych; geny te mogą funkcjonować w szlakach, które nie prowadzą do wykorzystania lub tworzenia PPA jako produktu ubocznego. W tym przypadku tylko jeden gen związany z generacją PPA wykazał istotne różnice w liczebności między typami próbek. W przeciwieństwie do genów związanych z metabolizmem PPA, geny markerowe dla produkcji PPA wybrano ze względu na ich bezpośredni udział w bakteryjnym szlaku produkcji PPA. U myszy narażonych na PPA stwierdzono istotnie zwiększoną liczebność i zdolność do produkcji PPA u wszystkich gatunków. Potwierdza to przewidywania, że PPA będą selekcjonować producentów PPA, a tym samym przewidywać wzrost zdolności produkcyjnej PPA. Jednakże liczebność genów niekoniecznie koreluje z ekspresją genów; zatem, chociaż liczebność genów związanych z metabolizmem PPA jest wyższa w próbkach kontrolnych, tempo ekspresji może być inne (Shi i in., 2014). Aby potwierdzić związek między częstością występowania genów produkujących PPA a produkcją PPA, konieczne są badania ekspresji genów zaangażowanych w produkcję PPA.
Adnotacja funkcjonalna metagenomów PPA i kontrolnych ujawniła pewne różnice. Analiza PCA zawartości genów ujawniła dyskretne skupiska między próbkami PPA i kontrolnymi (Rysunek 5). Klastrowanie w obrębie próbki wykazało, że zawartość genów kontrolnych była bardziej zróżnicowana, podczas gdy próbki PPA grupowały się. Klastrowanie według zawartości genów było porównywalne z klastrowaniem według składu gatunkowego. Zatem różnice w liczebności szlaków metabolicznych są zgodne ze zmianami w liczebności poszczególnych gatunków i szczepów w ich obrębie. W próbkach PPA dwa szlaki o istotnie wyższej liczebności były związane z metabolizmem aminocukrów/cukrów nukleotydowych (ko:K21279) i wieloma szlakami metabolizmu lipidów (ko:K00647, ko:K03801; Tabela uzupełniająca 3). Wiadomo, że geny powiązane z ko:K21279 są powiązane z rodzajem Bacteroides, jednym z rodzajów o istotnie wyższej liczbie gatunków w próbkach PPA. Enzym ten może unikać odpowiedzi immunologicznej poprzez ekspresję polisacharydów otoczkowych (Wang i in., 2008). Może to wyjaśniać wzrost liczby bakterii Bacteroidetes obserwowany u myszy narażonych na działanie PPA. Uzupełnia to zwiększoną syntezę kwasów tłuszczowych obserwowaną w mikrobiomie PPA. Bakterie wykorzystują szlak FASIIko:K00647 (fabB) do produkcji kwasów tłuszczowych, co może wpływać na szlaki metaboliczne gospodarza (Yao i Rock, 2015; Johnson i in., 2020), a zmiany w metabolizmie lipidów mogą odgrywać rolę w rozwoju układu nerwowego (Yu i in., 2020). Innym szlakiem wykazującym zwiększoną liczebność w próbkach PPA była biosynteza hormonów steroidowych (ko:K12343). Coraz więcej dowodów wskazuje na odwrotną zależność między zdolnością mikrobioty jelitowej do wpływania na poziom hormonów a poddawaniem się wpływowi hormonów, tak że podwyższony poziom steroidów może mieć dalsze konsekwencje zdrowotne (Tetel i in., 2018).
Niniejsze badanie nie jest pozbawione ograniczeń i wątpliwości. Istotną różnicą jest to, że nie przeprowadziliśmy oceny fizjologicznej zwierząt. W związku z tym nie jest możliwe bezpośrednie stwierdzenie, czy zmiany w mikrobiomie są związane z jakąkolwiek chorobą. Inną kwestią jest to, że myszy w tym badaniu były karmione tą samą dietą co ich matki. Przyszłe badania mogą określić, czy przejście z diety bogatej w PPA na dietę bez PPA poprawia jej wpływ na mikrobiom. Jednym z ograniczeń naszego badania, podobnie jak wielu innych, jest ograniczona liczebność próby. Chociaż można wyciągnąć trafne wnioski, większa próba zapewniłaby większą moc statystyczną przy analizie wyników. Jesteśmy również ostrożni w wyciąganiu wniosków na temat związku między zmianami w mikrobiomie jelitowym a jakąkolwiek chorobą (Yap i in., 2021). Czynniki zakłócające, takie jak wiek, płeć i dieta, mogą znacząco wpływać na skład mikroorganizmów. Czynniki te mogą wyjaśniać niespójności obserwowane w literaturze dotyczące związku mikrobiomu jelitowego ze złożonymi chorobami (Johnson i in., 2019; Lagod i Naser, 2023). Na przykład wykazano, że przedstawiciele rodzaju Bacteroidetes są albo podwyższeni, albo obniżeni u zwierząt i ludzi z ASD (Angelis i in., 2013; Kushak i in., 2017). Podobnie badania składu jelit u pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit wykazały zarówno wzrosty, jak i spadki w tych samych taksonach (Walters i in., 2014; Forbes i in., 2018; Upadhyay i in., 2023). Aby ograniczyć wpływ uprzedzeń ze względu na płeć, staraliśmy się zapewnić równą reprezentację płci, tak aby różnice były najprawdopodobniej spowodowane dietą. Jednym z wyzwań adnotacji funkcjonalnej jest usunięcie zbędnych sekwencji genów. Nasza metoda klastrowania genów wymaga 95% identyczności sekwencji i 85% podobieństwa długości, a także 90% pokrycia dopasowania, aby wyeliminować fałszywe klastrowanie. Jednak w niektórych przypadkach obserwowaliśmy COG z tymi samymi adnotacjami (np. MUT) (ryc. 6). Konieczne są dalsze badania, aby ustalić, czy te ortologi są odrębne, powiązane z określonymi rodzajami, czy też stanowi to ograniczenie metody klastrowania genów. Kolejnym ograniczeniem adnotacji funkcjonalnej jest potencjalna błędna klasyfikacja; gen bakteryjny mmdA jest znanym enzymem zaangażowanym w syntezę propionianu, ale KEGG nie wiąże go ze szlakiem metabolicznym propionianu. Natomiast ortologi scpB i mmcD są spokrewnione. Duża liczba genów bez wyznaczonych knockoutów może uniemożliwić identyfikację genów powiązanych z PPA podczas oceny liczebności genów. Przyszłe badania skorzystają na analizie metatranskryptomu, która może zapewnić głębsze zrozumienie cech funkcjonalnych mikrobioty jelitowej i powiązać ekspresję genów z potencjalnymi efektami następczymi. W przypadku badań dotyczących specyficznych zaburzeń neurorozwojowych lub chorób zapalnych jelit, konieczna jest ocena fizjologiczna i behawioralna zwierząt, aby powiązać zmiany w składzie mikrobiomu z tymi zaburzeniami. Dodatkowe badania z przeszczepieniem mikrobiomu jelitowego do myszy wolnych od zarazków byłyby również przydatne w celu ustalenia, czy mikrobiom jest czynnikiem napędzającym lub charakterystycznym dla choroby.
Podsumowując, wykazaliśmy, że PPA w diecie działa jako czynnik zmieniający skład mikrobiomu jelitowego. PPA to zatwierdzony przez FDA konserwant, powszechnie występujący w różnych produktach spożywczych, który po długotrwałej ekspozycji może prowadzić do zaburzeń prawidłowej flory jelitowej. Zaobserwowaliśmy zmiany w liczebności kilku bakterii, co sugeruje, że PPA może wpływać na skład mikrobiomu jelitowego. Zmiany w mikrobiomie mogą prowadzić do zmian w poziomach niektórych szlaków metabolicznych, co z kolei może prowadzić do zmian fizjologicznych istotnych dla zdrowia gospodarza. Konieczne są dalsze badania w celu ustalenia, czy wpływ PPA w diecie na skład mikrobiomu może prowadzić do dysbiozy lub innych chorób. Niniejsze badanie kładzie podwaliny pod przyszłe badania nad wpływem PPA na skład jelit na zdrowie człowieka.
Zestawy danych przedstawione w niniejszym badaniu są dostępne w repozytoriach online. Nazwa repozytorium i numer dostępu to: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Niniejsze badanie na zwierzętach zostało zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania Uniwersytetu Centralnej Florydy (UCF-IACUC) (numer zezwolenia na użytkowanie zwierząt: PROTO202000002). Badanie jest zgodne z lokalnymi przepisami, regulacjami i wymogami instytucjonalnymi.
NG: Konceptualizacja, Gromadzenie danych, Analiza formalna, Badania, Metodologia, Oprogramowanie, Wizualizacja, Pisanie (wersja robocza), Pisanie (recenzja i redakcja). LA: Konceptualizacja, Gromadzenie danych, Metodologia, Zasoby, Pisanie (recenzja i redakcja). SH: Analiza formalna, Oprogramowanie, Pisanie (recenzja i redakcja). SA: Badania, Pisanie (recenzja i redakcja). Sędzia Główny: Badania, Pisanie (recenzja i redakcja). SN: Konceptualizacja, Zarządzanie projektem, Zasoby, Nadzór, Pisanie (recenzja i redakcja). TA: Konceptualizacja, Zarządzanie projektem, Nadzór, Pisanie (recenzja i redakcja).
Autorzy oświadczyli, że nie otrzymali żadnego wsparcia finansowego na badania, autorstwo ani publikację niniejszego artykułu.
Autorzy oświadczają, że badania przeprowadzono bez żadnych powiązań komercyjnych lub finansowych, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów. nie dotyczy.
Wszystkie opinie wyrażone w niniejszym artykule są wyłącznie opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy ich instytucji, wydawców, redaktorów ani recenzentów. Wydawca nie gwarantuje ani nie popiera żadnych produktów ocenianych w niniejszym artykule ani żadnych zapewnień ich producentów.
Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć w Internecie: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Kwas propionowy indukuje gliozę i neurozapalenie poprzez regulację szlaku PTEN/AKT w zaburzeniach ze spektrum autyzmu. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Analiza statystyczna danych kompozycyjnych. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Współczynnik Firmicutes/Bacteroidetes jako czynnik ryzyka raka piersi. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Analiza różnicowej ekspresji danych dotyczących liczby sekwencji. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI i wsp. (2013). Mikrobiota kałowa i metabolom u dzieci z autyzmem i całościowymi zaburzeniami rozwoju, nieokreślonymi gdzie indziej. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Charakterystyka neurometaboliczna bakterii w mikrobiomie jelitowym małych dzieci z zaburzeniami ze spektrum autyzmu. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiom jako narząd ludzki. Mikrobiologia kliniczna i zakażenia 18, s. 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Nowe spojrzenie na fizjologię bakterii produkujących kwas propionowy: Anaerotignum propionicum i Anaerotignum neopropionicum (dawniej Clostridium propionicum i Clostridium neopropionicum). Mikroorganizmy 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Żywienie matki i rozwój płodu. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y. i Hochberg, J. (1995). Kontrola wskaźnika wyników fałszywie dodatnich: praktyczne i efektywne podejście do testów wielokrotnych. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Czas publikacji: 18 kwietnia 2025 r.