Metabolity immunomodulacyjne są kluczową cechą mikrośrodowiska guza (TME), ale poza kilkoma wyjątkami, ich tożsamość pozostaje w dużej mierze nieznana. W niniejszym badaniu przeanalizowaliśmy guzy i limfocyty T pochodzące z guzów i wodobrzusza pacjentów z rakiem surowiczym wysokiego stopnia (HGSC), aby ujawnić metabolom tych różnych przedziałów TME. Wodobrzusze i komórki nowotworowe wykazują znaczne różnice w metabolitach. W porównaniu z wodobrzuszem, limfocyty T naciekające guz są znacząco wzbogacone w 1-metylonikotynamid (MNA). Pomimo podwyższonego poziomu MNA w limfocytach T, ekspresja N-metylotransferazy nikotynamidu (enzymu katalizującego transfer grup metylowych z S-adenozylometioniny do nikotynamidu) jest ograniczona do fibroblastów i komórek nowotworowych. Funkcjonalnie MNA indukuje limfocyty T do wydzielania czynnika martwicy nowotworów alfa, cytokiny promującej rozwój nowotworu. Zatem MNA pochodzące z TME przyczynia się do regulacji immunologicznej komórek T i stanowi potencjalny cel immunoterapii w leczeniu raka u ludzi.
Metabolity pochodzące z guza mogą wywierać głęboki hamujący wpływ na odporność przeciwnowotworową, a coraz więcej dowodów wskazuje, że mogą one również stanowić kluczową siłę napędową progresji choroby (1). Oprócz efektu Warburga, ostatnie prace zaczęły charakteryzować stan metaboliczny komórek nowotworowych i jego związek ze stanem odpornościowym mikrośrodowiska guza (TME). Badania na modelach mysich i ludzkich limfocytach T wykazały, że metabolizm glutaminy (2), metabolizm oksydacyjny (3) i metabolizm glukozy (4) mogą działać niezależnie na różne podgrupy komórek układu odpornościowego. Kilka metabolitów w tych szlakach hamuje przeciwnowotworową funkcję limfocytów T. Udowodniono, że blokada koenzymu tetrahydrobiopteryny (BH4) może zaburzać proliferację limfocytów T, a wzrost stężenia BH4 w organizmie może nasilać przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną mediowaną przez CD4 i CD8. Ponadto immunosupresyjne działanie kynureniny można zniwelować poprzez podanie BH4 (5). W glejaku wielopostaciowym z mutacją dehydrogenazy izocytrynianowej (IDH), wydzielanie enancjometabolicznego (R)-2-hydroksyglutaranu (R-2-HG) hamuje aktywację, proliferację i aktywność cytolizy limfocytów T (6). Niedawno wykazano, że metyloglioksal, produkt uboczny glikolizy, jest produkowany przez komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego, a transfer metyloglioksalu przez limfocyty T może hamować funkcję limfocytów T efektorowych. W leczeniu, neutralizacja metyloglioksalu może przezwyciężyć aktywność komórek supresorowych pochodzenia mieloidalnego (MDSC) i synergistycznie wzmocnić terapię blokadą punktów kontrolnych w modelach mysich (7). Badania te łącznie podkreślają kluczową rolę metabolitów pochodzących z TME w regulacji funkcji i aktywności limfocytów T.
Dysfunkcja limfocytów T jest szeroko opisywana w raku jajnika (8). Wynika to częściowo z metabolicznych właściwości inherentnych dla niedotlenienia i nieprawidłowego unaczynienia guza (9), co prowadzi do przekształcania glukozy i tryptofanu w produkty uboczne, takie jak kwas mlekowy i kinurenina. Nadmiar mleczanu pozakomórkowego zmniejsza produkcję interferonu-γ (IFN-γ) i napędza różnicowanie podgrup mielosupresyjnych (10, 11). Zużycie tryptofanu bezpośrednio hamuje proliferację limfocytów T i hamuje sygnalizację receptora limfocytów T (12-14). Pomimo tych obserwacji, wiele prac dotyczących metabolizmu immunologicznego przeprowadzono w hodowli limfocytów T in vitro przy użyciu zoptymalizowanych pożywek lub ograniczono do homologicznych modeli mysich in vivo, z których żadna nie odzwierciedla w pełni heterogeniczności ludzkich nowotworów ani fizjologicznego makro- i mikrośrodowiska.
Wspólną cechą raka jajnika jest rozprzestrzenianie się do otrzewnej i pojawienie się wodobrzusza. Gromadzenie się płynu komórkowego w wodobrzuszu wiąże się z zaawansowaną chorobą i złym rokowaniem (15). Według doniesień, ten unikalny przedział jest niedotleniony, charakteryzuje się wysokim poziomem czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i 2,3-dioksygenazy indoloaminy (IDO) oraz jest naciekany przez limfocyty T regulatorowe i komórki hamujące mieloidalne (15-18). Środowisko metaboliczne wodobrzusza może różnić się od środowiska samego guza, dlatego przeprogramowanie limfocytów T w przestrzeni otrzewnej jest niejasne. Ponadto kluczowe różnice i heterogeniczność między wodobrzuszem a metabolitami obecnymi w środowisku guza mogą utrudniać naciekanie komórek układu odpornościowego i ich funkcję w guzach, co wymaga dalszych badań.
Aby rozwiązać te problemy, zaprojektowaliśmy czułą metodę separacji komórek i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS/MS) do badania różnych typów komórek (w tym komórek CD4+ i CD8+ T), a także wewnątrz i między guzami. Jej metabolity obejmują komórki w tym samym środowisku wodobrzusza i guza pacjenta. Używamy tej metody w połączeniu z cytometrią przepływową o wysokiej rozdzielczości i sekwencjonowaniem RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq), aby zapewnić wysoce rozdzielczy obraz stanu metabolicznego tych kluczowych populacji. Ta metoda ujawniła znaczący wzrost poziomu 1-metylonikotynamidu (MNA) w komórkach T guza, a eksperymenty in vitro wykazały, że immunomodulacyjny wpływ MNA na funkcję komórek T był wcześniej nieznany. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda ujawnia wzajemne interakcje metaboliczne między guzami a komórkami układu odpornościowego i dostarcza unikalnych spostrzeżeń na temat metabolitów regulacji immunologicznej, które mogą być przydatne w leczeniu raka jajnika opartego na komórkach T immunoterapia Możliwości leczenia.
Użyliśmy cytometrii przepływowej o wysokiej rozdzielczości, aby jednocześnie określić ilościowo wychwyt glukozy [2-(N-(7-nitrofenylo-2-oksa-1,3-diaza-4-ylo)amino)-2-deoksyglukoza (2-NBDG) i aktywność mitochondriów [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) są obok siebie typowymi markerami, które odróżniają komórki układu odpornościowego od populacji komórek nowotworowych (Tabela S2 i Rysunek S1A). Analiza ta wykazała, że ​​w porównaniu z komórkami T, wodobrzusze i komórki nowotworowe mają wyższe poziomy wychwytu glukozy, ale mniejsze różnice w aktywności mitochondrialnej. Średni wychwyt glukozy przez komórki nowotworowe [CD45-EpCAM (EpCAM)+] jest trzy do czterech razy większy niż przez komórki T, a średni wychwyt glukozy przez komórki T CD4 + jest 1,2 razy większy niż przez komórki T CD8 +, co wskazuje, że limfocyty naciekające guz (TIL) mają różne wymagania metaboliczne nawet w tym samym TME (Rysunek 1A). Natomiast aktywność mitochondrialna w komórkach nowotworowych jest podobna do aktywności limfocytów T CD4+, a aktywność mitochondrialna obu typów komórek jest wyższa niż limfocytów T CD8+ (Rysunek 1B). Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te ujawniają poziom metaboliczny. Aktywność metaboliczna komórek nowotworowych jest wyższa niż limfocytów T CD4+, a aktywność metaboliczna limfocytów T CD4+ jest wyższa niż limfocytów T CD8+. Pomimo tych efektów w różnych typach komórek, nie ma spójnej różnicy w statusie metabolicznym limfocytów T CD4+ i CD8+ ani ich względnych proporcjach w wodobrzuszu w porównaniu z guzami (Rysunek 1C). Natomiast we frakcji komórek CD45, odsetek komórek EpCAM+ w guzie wzrósł w porównaniu z wodobrzuszem (Rysunek 1D). Zaobserwowaliśmy również wyraźną różnicę metaboliczną między składnikami komórek EpCAM+ i EpCAM-. Komórki EpCAM+ (nowotworowe) wykazują wyższy wychwyt glukozy i większą aktywność mitochondrialną niż komórki EpCAM-, która jest znacznie wyższa niż aktywność metaboliczna fibroblastów w komórkach nowotworowych w TME (ryc. 1, E i F).
(A i B) Mediana intensywności fluorescencji (MFI) wychwytu glukozy (2-NBDG) (A) i aktywność mitochondrialna komórek CD4+ (ciemnoczerwony MitoTracker) (B) Typowe wykresy (po lewej) i dane tabelaryczne (po prawej), komórki CD8+ i komórki nowotworowe EpCAM + CD45- z wodobrzusza i guza. (C) Stosunek komórek CD4+ i CD8+ (z komórek CD3+) w wodobrzuszu i guzie. (D) Odsetek komórek nowotworowych EpCAM + w wodobrzuszu i guzie (CD45−). (E i F) Wychwyt glukozy przez EpCAM + CD45-guz i EpCAM-CD45-macierz (2-NBDG) (E) i aktywność mitochondrialna (ciemnoczerwony MitoTracker) (F) Typowe wykresy (po lewej) i dane tabelaryczne (po prawej) Wodobrzusze i komórki nowotworowe. (G) Reprezentatywne wykresy ekspresji CD25, CD137 i PD1 metodą cytometrii przepływowej. (H i I) Ekspresja CD25, CD137 i PD1 na limfocytach T CD4+ (H) i limfocytach T CD8+ (I). (J i K) Fenotypy naiwne, pamięci centralnej (Tcm), efektorowe (Teff) i pamięci efektorowej (Tem) na podstawie ekspresji CCR7 i CD45RO. Reprezentatywne obrazy (po lewej) i dane tabelaryczne (po prawej) limfocytów T CD4+ (J) i limfocytów T CD8+ (K) w wodobrzuszu i guzach. Wartości p określone za pomocą sparowanego testu t (*P<0,05, **P<0,01 i ***P<0,001). Linia przedstawia dopasowanych pacjentów (n = 6). FMO, fluorescencja minus jeden; MFI, mediana intensywności fluorescencji.
Dalsza analiza ujawniła inne istotne różnice w fenotypie limfocytów T o wysokiej rozdzielczości. Aktywowane (rysunek 1, G do I) i efektorowe komórki pamięci (rysunek 1, J i K) w guzach występują znacznie częściej niż wodobrzusze (odsetek limfocytów T CD3+). Podobnie analiza fenotypu na podstawie ekspresji markerów aktywacji (CD25 i CD137) i markerów wyczerpania [białko programowanej śmierci komórek 1 (PD1)] wykazała, że ​​chociaż charakterystyka metaboliczna tych populacji jest różna (rysunek S1, B do E), to jednak nie zaobserwowano konsekwentnie istotnych różnic metabolicznych między podzbiorami naiwnymi, efektorowymi lub pamięciowymi (rysunek S1, F do I). Wyniki te potwierdzono za pomocą metod uczenia maszynowego w celu automatycznego przypisania fenotypów komórek (21), co dodatkowo ujawniło obecność dużej liczby komórek szpiku kostnego (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) w wodobrzuszu pacjenta (rysunek S2A). Spośród wszystkich zidentyfikowanych typów komórek, ta populacja komórek mieloidalnych wykazała najwyższy wychwyt glukozy i aktywność mitochondrialną (ryc. S2, B–G). Wyniki te podkreślają silne różnice metaboliczne między różnymi typami komórek występującymi w wodobrzuszu i guzach u pacjentów z HGSC.
Głównym wyzwaniem w zrozumieniu metabonomicznych cech TIL jest konieczność wyizolowania próbek limfocytów T o wystarczającej czystości, jakości i ilości z guzów. Ostatnie badania wykazały, że sortowanie i metody wzbogacania kulkami oparte na cytometrii przepływowej mogą prowadzić do zmian w profilach metabolitów komórkowych (22-24). Aby przezwyciężyć ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę wzbogacania kulkami, aby wyizolować i wyizolować TIL z chirurgicznie wyciętego ludzkiego raka jajnika przed analizą za pomocą LC-MS/MS (patrz Materiały i metody; Rysunek 2A). Aby ocenić ogólny wpływ tego protokołu na zmiany metabolitów, porównaliśmy profile metabolitów limfocytów T aktywowanych przez zdrowych dawców po powyższym etapie separacji kulkami z komórkami, które nie zostały rozdzielone kulkami, ale pozostały na lodzie. Ta analiza kontroli jakości wykazała, że ​​istnieje wysoka korelacja między tymi dwoma warunkami (r = 0,77), a techniczna powtarzalność grupy 86 metabolitów ma wysoką powtarzalność (Rysunek 2B). Dlatego też metody te umożliwiają dokładną analizę metabolitów w komórkach poddawanych wzbogaceniu pod względem typu komórek, zapewniając tym samym pierwszą platformę o wysokiej rozdzielczości do identyfikacji specyficznych metabolitów w HGSC i umożliwiając ludziom lepsze zrozumienie specyfiki komórek. Program metabolizmu płciowego.
(A) Schemat wzbogacania za pomocą kulek magnetycznych. Przed analizą metodą LC-MS/MS komórki zostaną poddane trzem kolejnym rundom wzbogacania za pomocą kulek magnetycznych lub pozostaną w lodzie. (B) Wpływ rodzaju wzbogacenia na liczebność metabolitów. Średnia z trzech pomiarów dla każdego rodzaju wzbogacenia ± błąd standardowy (SE). Szara linia przedstawia zależność 1:1. Korelacja wewnątrzklasowa (ICC) powtarzanych pomiarów pokazana na etykiecie osi. NAD, dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy. (C) Schematyczny schemat przebiegu pracy analizy metabolitów pacjentów. Od pacjentów pobiera się płyn otrzewnowy lub guzy i kriokonserwuje. Niewielką część każdej próbki analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej, podczas gdy pozostałe próbki poddano trzem rundom wzbogacania dla komórek CD4+, CD8+ i CD45-. Te frakcje komórek analizuje się za pomocą LC-MS/MS. (D) Mapa cieplna standaryzowanej liczebności metabolitów. Dendrogram przedstawia klasterowanie Warda odległości euklidesowych między próbkami. (E) Analiza głównych składowych (PCA) mapy metabolitów próbki, pokazująca trzy powtórzenia każdej próbki, próbki od tego samego pacjenta połączone linią. (F) Analiza PCA profilu metabolitów próbki uwarunkowanej pacjentem (tj. z wykorzystaniem częściowej redundancji); typ próbki jest ograniczony przez otoczkę wypukłą. PC1, główny składnik 1; PC2, główny składnik 2.
Następnie zastosowaliśmy tę metodę wzbogacania do analizy 99 metabolitów we frakcjach komórek CD4+, CD8+ i CD45- w pierwotnym wodobrzuszu i guzach sześciu pacjentów z HGSC (Rysunek 2C, Rysunek S3A oraz Tabela S3 i S4). Populacja będąca przedmiotem zainteresowania stanowi od 2% do 70% oryginalnej dużej próbki żywych komórek, a proporcje komórek różnią się znacznie między pacjentami. Po oddzieleniu kulek, wzbogacona frakcja będąca przedmiotem zainteresowania (CD4+, CD8+ lub CD45-) stanowi średnio ponad 85% wszystkich żywych komórek w próbce. Ta metoda wzbogacania pozwala nam analizować populacje komórek z metabolizmu tkanki ludzkiego guza, co jest niemożliwe do wykonania w przypadku dużych próbek. Stosując ten protokół, ustaliliśmy, że l-kynurenina i adenozyna, te dwa dobrze scharakteryzowane metabolity immunosupresyjne, były podwyższone w limfocytach T guza lub komórkach guza (Rysunek S3, B i C). Zatem wyniki te dowodzą, że nasza technologia rozdzielania komórek i spektrometrii masowej pozwala na dokładne wykrywanie biologicznie ważnych metabolitów w tkankach pacjentów.
Nasza analiza ujawniła również silne metaboliczne rozdzielenie typów komórek u pacjentów i między nimi (Rysunek 2D i Rysunek S4A). W szczególności, w porównaniu z innymi pacjentami, pacjent 70 wykazał inne cechy metaboliczne (Rysunek 2E i Rysunek S4B), co wskazuje, że może występować znaczna heterogeniczność metaboliczna między pacjentami. Warto zauważyć, że w porównaniu z innymi pacjentami (1,2 do 2 litrów; Tabela S1), całkowita ilość płynu otrzewnowego pobranego u pacjenta 70 (80 ml) była mniejsza. Kontrola heterogeniczności między pacjentami podczas analizy głównych składowych (na przykład z wykorzystaniem analizy częściowej redundancji) pokazuje spójne zmiany między typami komórek, a typy komórek i/lub mikrośrodowisko są wyraźnie agregowane zgodnie z profilem metabolitów (Rysunek 2F). Analiza pojedynczych metabolitów podkreśliła te efekty i ujawniła istotne różnice między typami komórek i mikrośrodowiskiem. Warto zauważyć, że najbardziej ekstremalną zaobserwowaną różnicą jest MNA, który jest zazwyczaj wzbogacony w komórkach CD45- oraz w komórkach CD4+ i CD8+ naciekających guz (rycina 3A). W przypadku komórek CD4+ efekt ten jest najbardziej widoczny, a MNA w komórkach CD8+ wydaje się być również silnie zależny od środowiska. Nie ma to jednak znaczenia, ponieważ tylko u trzech z sześciu pacjentów można było ocenić poziom CD8+ w guzie. Oprócz MNA, w różnych typach komórek w wodobrzuszu i guzach, inne metabolity, słabo scharakteryzowane w TIL, również wykazują różnicowe bogactwo (ryciny S3 i S4). Dlatego dane te wskazują na obiecujący zestaw metabolitów immunomodulacyjnych do dalszych badań.
(A) Znormalizowana zawartość MNA w komórkach CD4+, CD8+ i CD45- z wodobrzusza i guza. Wykres pudełkowy przedstawia medianę (linię), zakres międzykwartylowy (zawias ramki) i zakres danych, do 1,5-krotności zakresu międzykwartylowego (wąs ramki). Jak opisano w Materiałach i metodach pacjenta, użyj wartości limma pacjenta, aby określić wartość P (*P<0,05 i **P<0,01). (B) Schematyczny diagram metabolizmu MNA (60). Metabolity: S-adenozylo-1-metionina; SAH, S-adenozyno-1-homocysteina; NA, nikotynamid; MNA, 1-metylonikotynamid; 2-PY, 1-metylo-2-pirydono-5-karboksyamid; 4-PY, 1-metylo-4-pirydono-5-karboksyamid; NR, ryboza nikotynamidu; NMN, mononukleotyd nikotynamidowy. Enzymy (zielone): NNMT, N-metylotransferaza nikotynamidu; SIRT, sirtuiny; NAMPT, fosforybozylotransferaza nikotynamidu; AOX1, oksydaza aldehydowa 1; NRK, kinaza rybozydowa nikotynamidu; NMNAT, adenylanowa transferaza mononukleotydowa nikotynamidu; Pnp1, fosforylaza nukleozydów purynowych. (C) t-SNE scRNA-seq płynu otrzewnowego (szary) i guza (czerwony; n = 3 pacjentów). (D) Ekspresja NNMT w różnych populacjach komórek zidentyfikowanych przy użyciu scRNA-seq. (E) Ekspresja NNMT i AOX1 w SK-OV-3, ludzkich embrionalnych komórkach nerki (HEK) 293T, limfocytach T i limfocytach T leczonych MNA. Złożona ekspresja jest pokazana w odniesieniu do SK-OV-3. Pokazano wzór ekspresji z SEM (n = 6 zdrowych dawców). Wartości Ct większe niż 35 są uważane za niewykrywalne (UD). (F) Ekspresja SLC22A1 i SLC22A2 w SK-OV-3, HEK293T, limfocytach T i limfocytach T traktowanych 8mM MNA. Złożona ekspresja jest pokazana w odniesieniu do SK-OV-3. Pokazano wzór ekspresji z SEM (n = 6 zdrowych dawców). Wartości Ct większe niż 35 są uważane za niewykrywalne (UD). (G) Zawartość MNA w aktywowanych limfocytach T zdrowych dawców po 72 godzinach inkubacji z MNA. Pokazano wzór ekspresji z SEM (n = 4 zdrowych dawców).
MNA powstaje w wyniku przeniesienia grupy metylowej z S-adenozylo-1-metioniny (SAM) do nikotynamidu (NA) przez nikotynamidową N-metylotransferazę (NNMT; ryc. 3B). NNMT jest nadekspresjonowany w różnych nowotworach u ludzi i jest związany z proliferacją, inwazją i przerzutami (25-27). Aby lepiej zrozumieć źródło MNA w limfocytach T w TME, wykorzystaliśmy metodę scRNA-seq do scharakteryzowania ekspresji NNMT w różnych typach komórek w wodobrzuszu i guzach u trzech pacjentów z HGSC (Tabela S5). Analiza około 6500 komórek wykazała, że ​​w wodobrzuszu i środowisku guza ekspresja NNMT była ograniczona do domniemanych populacji fibroblastów i komórek nowotworowych (ryc. 3, C i D). Warto zauważyć, że nie ma oczywistej ekspresji NNMT w żadnej populacji, która wyraża PTPRC (CD45 +) (Rysunek 3D i Rysunek S5A), co wskazuje, że MNA wykryty w spektrum metabolitów został wprowadzony do limfocytów T. Ekspresja aldehydooksydazy 1 (AOX1) przekształca MNA w 1-metylo-2-pirydono-5-karboksyamid (2-PYR) lub 1-metylo-4-pirydono-5-karboksyamid (4-PYR); Rysunek 3B) jest również ograniczony do populacji fibroblastów wyrażających COL1A1 (Rysunek S5A), co razem wskazuje, że limfocyty T nie mają zdolności konwencjonalnego metabolizmu MNA. Wzór ekspresji tych genów związanych z MNA został zweryfikowany przy użyciu drugiego niezależnego zestawu danych komórkowych z wodobrzusza od pacjentów z HGSC (Rysunek S5B; n = 6) (16). Ponadto, ilościowa analiza łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR) zdrowych komórek T dawcy leczonych MNA wykazała, że ​​w porównaniu z kontrolnymi komórkami guza jajnika SK-OV-3, ekspresja NNMT lub AOX1 była prawie nieobecna (ryc. 3E). Te nieoczekiwane wyniki wskazują, że MNA może być wydzielana z fibroblastów lub guzów do sąsiednich komórek T w TME.
Chociaż wśród kandydatów znajduje się rodzina transporterów kationów organicznych 1 do 3 (OCT1, OCT2 i OCT3) kodowanych przez rodzinę rozpuszczalnego nośnika 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 i SLC22A3), potencjalne transportery MNA są nadal nieokreślone (28). QPCR mRNA ze zdrowych komórek T dawcy wykazało niskie poziomy ekspresji SLC22A1, ale niewykrywalne poziomy SLC22A2, co potwierdziło, że był on wcześniej opisywany w literaturze (ryc. 3F) (29). Natomiast linia komórkowa guza jajnika SK-OV-3 wyrażała wysokie poziomy obu transporterów (ryc. 3F).
Aby sprawdzić, czy limfocyty T mogą absorbować obcy MNA, zdrowe limfocyty T dawcy hodowano przez 72 godziny w obecności różnych stężeń MNA. W przypadku braku egzogennego MNA nie można było określić jego zawartości komórkowej (ryc. 3G). Jednakże aktywowane limfocyty T leczone egzogennym MNA wykazywały zależny od dawki wzrost zawartości MNA w komórkach, do 6 mM MNA (ryc. 3G). Wynik ten wskazuje, że pomimo niskiego poziomu ekspresji transportera i braku głównego enzymu odpowiedzialnego za wewnątrzkomórkowy metabolizm MNA, TIL nadal może absorbować MNA.
Spektrum metabolitów w limfocytach T pacjentów oraz eksperymenty in vitro dotyczące absorpcji MNA zwiększają prawdopodobieństwo, że fibroblasty związane z rakiem (CAF) wydzielają MNA, a komórki nowotworowe mogą regulować fenotyp i funkcję TIL. Aby określić wpływ MNA na limfocyty T, zdrowe limfocyty T dawcy aktywowano in vitro w obecności lub nieobecności MNA, a następnie oceniano ich proliferację i produkcję cytokin. Po 7 dniach podawania MNA w najwyższej dawce, liczba podwojonych komórek w populacji uległa umiarkowanemu zmniejszeniu, podczas gdy wigor utrzymywał się przy wszystkich dawkach (ryc. 4A). Ponadto leczenie egzogennym MNA spowodowało wzrost odsetka limfocytów T CD4+ i CD8+ wyrażających czynnik martwicy nowotworów alfa (TNFα; ryc. 4B). Natomiast wewnątrzkomórkowa produkcja IFN-γ była istotnie zmniejszona w limfocytach T CD4+, ale nie w limfocytach T CD8+, a stężenie interleukiny 2 (IL-2; ryc. 4, C i D) nie uległo istotnej zmianie. Dlatego też test immunoenzymatyczny (ELISA) supernatantów z hodowli limfocytów T poddanych działaniu MNA wykazał istotny wzrost stężenia TNFα, spadek stężenia IFN-γ i brak zmian stężenia IL-2 (ryc. 4, E–G). Spadek stężenia IFN-γ wskazuje, że MNA może odgrywać rolę w hamowaniu aktywności przeciwnowotworowej limfocytów T. Aby symulować wpływ MNA na cytotoksyczność pośredniczoną przez limfocyty T, chimeryczne komórki T z receptorem antygenu (FRα-CAR-T) ukierunkowane na receptor kwasu foliowego α oraz komórki CAR-T (GFP) regulowane przez zielone białko fluorescencyjne (GFP-CAR-T) są produkowane przez zdrowe komórki jednojądrowe krwi obwodowej (PBMC) od dawców. Komórki CAR-T hodowano przez 24 godziny w obecności MNA, a następnie współhodowano z ludzkimi komórkami guza jajnika SK-OV-3 z ekspresją receptora kwasu foliowego α w stosunku komórek efektorowych do docelowych 10:1. Leczenie MNA spowodowało znaczące zmniejszenie aktywności zabijania komórek FRα-CAR-T, podobnej do aktywności komórek FRα-CAR-T leczonych adenozyną (ryc. 4H).
(A) Całkowita liczba żywych komórek i podwojenie populacji (PD) bezpośrednio z hodowli w dniu 7. Wykres słupkowy przedstawia średnią ± SEM dla sześciu zdrowych dawców. Przedstawia dane z co najmniej n = 3 niezależnych eksperymentów. (B do D) CD3/CD28 i IL-2 zostały użyte do aktywacji limfocytów T przy ich odpowiednich stężeniach MNA przez 7 dni. Przed analizą komórki stymulowano PMA/jonomycyną z GolgiStop przez 4 godziny. Ekspresja TNFα (B) w limfocytach T. Przykładowy obraz (po lewej) i dane tabelaryczne (po prawej) ekspresji TNFα w żywych komórkach. Ekspresja IFN-γ (C) i IL-2 (D) w limfocytach T. Ekspresję cytokin mierzono metodą cytometrii przepływowej. Wykres słupkowy przedstawia średnią (n = 6 zdrowych dawców) ± SEM. Użyj jednokierunkowej analizy wariancji i powtarzanych pomiarów (*P<0,05 i **P<0,01), aby określić wartość P. Reprezentuje dane z co najmniej n = 3 niezależnych eksperymentów. (E do G) CD3/CD28 i IL-2 były używane do aktywacji limfocytów T przy odpowiednich stężeniach MNA przez 7 dni. Medium zostało zebrane przed i po 4 godzinach stymulacji PMA/jonomycyną. Stężenia TNFα (E), IFN-γ (F) i IL-2 (G) były mierzone metodą ELISA. Wykres słupkowy przedstawia średnią (n = 5 zdrowych dawców) + SEM. Wartość p określono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji i powtarzanych pomiarów (*P < 0,05). Linia przerywana wskazuje granicę wykrywalności. (H) Test lizy komórek. Komórki FRα-CAR-T lub GFP-CAR-T były korygowane adenozyną (250 μM) lub MNA (10 mM) przez 24 godziny lub pozostawione bez leczenia (Kontrola). Mierzono procent zabijania komórek SK-OV-3. Wartość p określona za pomocą testu t Welcha (*P<0,5 i **P<0,01).
Aby uzyskać mechanistyczne zrozumienie zależnej od MNA regulacji ekspresji TNFα, oceniono zmiany w mRNA TNFα w limfocytach T leczonych MNA (ryc. 5A). Zdrowe limfocyty T od dawców leczone MNA wykazały dwukrotny wzrost poziomów transkrypcji TNFα, co wskazuje, że MNA jest zależne od regulacji transkrypcyjnej TNFα. Aby zbadać ten możliwy mechanizm regulacyjny, oceniono dwa znane czynniki transkrypcyjne regulujące TNFα, mianowicie aktywowany czynnik jądrowy limfocytów T (NFAT) i specyficzne białko 1 (Sp1), w odpowiedzi na wiązanie MNA z proksymalnym promotorem TNFα (30). Promotor TNFα zawiera 6 zidentyfikowanych miejsc wiązania NFAT i 2 miejsca wiązania Sp1, nakładające się w jednym miejscu [-55 par zasad (pz) od czapeczki 5'] (30). Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) wykazała, że ​​po leczeniu MNA wiązanie Sp1 z promotorem TNFα wzrosło trzykrotnie. Włączenie NFAT również wzrosło i zyskało na znaczeniu (ryc. 5B). Dane te wskazują, że MNA reguluje ekspresję TNFα poprzez transkrypcję Sp1, a w mniejszym stopniu ekspresję NFAT.
(A) W porównaniu z limfocytami T hodowanymi bez MNA, krotność zmiany ekspresji TNFα w limfocytach T leczonych MNA. Przedstawiono wzór ekspresji z SEM (n = 5 zdrowych dawców). Przedstawia dane z co najmniej n = 3 niezależnych eksperymentów. (B) Promotor TNFα limfocytów T leczonych z lub bez 8 mM MNA po połączeniu NFAT i Sp1 z (Ctrl) i stymulacją PMA/jonomycyną przez 4 godziny. Immunoglobulina G (IgG) i H3 były używane jako kontrole ujemne i dodatnie dla immunoprecypitacji, odpowiednio. Kwantyfikacja ChIP wykazała, że ​​wiązanie Sp1 i NFAT z promotorem TNFα w komórkach leczonych MNA wzrosło kilkakrotnie w porównaniu z kontrolą. Przedstawia dane z co najmniej n = 3 niezależnych eksperymentów. Wartość p określona za pomocą wielokrotnych testów t (*** P <0,01). (C) W porównaniu z wodobrzuszem HGSC, limfocyty T (niecytotoksyczne) wykazały zwiększoną ekspresję TNF w guzie. Kolory reprezentują różnych pacjentów. Wyświetlane komórki zostały losowo wybrane do 300 i poddane drganiom w celu ograniczenia nadmiernego rysowania (** Padj = 0,0076). (D) Proponowany model MNA w raku jajnika. MNA jest wytwarzany w komórkach nowotworowych i fibroblastach w TME i jest wychwytywany przez limfocyty T. MNA zwiększa wiązanie Sp1 z promotorem TNFα, co prowadzi do zwiększonej transkrypcji TNFα i produkcji cytokin TNFα. MNA powoduje również zmniejszenie IFN-γ. Hamowanie funkcji limfocytów T prowadzi do zmniejszenia zdolności zabijania i przyspieszenia wzrostu guza.
Według doniesień, TNFα wykazuje zależne od przedniej i tylnej części ciała działanie przeciwnowotworowe i przeciwnowotworowe, ale ma on dobrze znaną rolę w promowaniu wzrostu i przerzutów raka jajnika (31-33). Według doniesień, stężenie TNFα w wodobrzuszu i tkankach nowotworowych u pacjentek z rakiem jajnika jest wyższe niż w tkankach łagodnych (34-36). Pod względem mechanizmu, TNFα może regulować aktywację, funkcję i proliferację białych krwinek oraz zmieniać fenotyp komórek nowotworowych (37, 38). Zgodnie z tymi wynikami, analiza różnicowej ekspresji genów wykazała, że ​​TNF był istotnie podwyższony w limfocytach T w tkankach nowotworowych w porównaniu z wodobrzuszem (rycina 5C). Wzrost ekspresji TNF był widoczny tylko w populacjach limfocytów T o fenotypie niecytotoksycznym (rycina S5A). Podsumowując, dane te potwierdzają pogląd, że MNA ma podwójne działanie immunosupresyjne i promujące rozwój nowotworu w HGSC.
Znakowanie fluorescencyjne oparte na cytometrii przepływowej stało się główną metodą badania metabolizmu TIL. Badania te wykazały, że w porównaniu z limfocytami krwi obwodowej lub komórkami T z wtórnych narządów limfoidalnych, mysie i ludzkie TIL wykazują wyższą tendencję do wychwytywania glukozy (4, 39) i stopniowej utraty funkcji mitochondriów (19, 40). Chociaż zaobserwowaliśmy podobne wyniki w tym badaniu, kluczowym osiągnięciem jest porównanie metabolizmu komórek nowotworowych i TIL z tej samej wyciętej tkanki guza. Zgodnie z niektórymi z tych wcześniejszych doniesień, komórki nowotworowe (CD45-EpCAM +) z wodobrzusza i guzów wykazują wyższy wychwyt glukozy niż komórki T CD8 + i CD4 +, co potwierdza, że ​​wysoki wychwyt glukozy przez komórki nowotworowe można porównać z limfocytami T. Koncepcja konkurencji limfocytów T. TME. Jednakże aktywność mitochondrialna komórek nowotworowych jest wyższa niż limfocytów T CD8 +, ale aktywność mitochondrialna jest podobna do aktywności limfocytów T CD4 +. Wyniki te wzmacniają wyłaniający się temat, że metabolizm oksydacyjny jest ważny dla komórek nowotworowych (41, 42). Sugerują one również, że limfocyty T CD8+ mogą być bardziej podatne na dysfunkcję oksydacyjną niż limfocyty T CD4+ lub że limfocyty T CD4+ mogą wykorzystywać inne źródła węgla niż glukoza do utrzymania aktywności mitochondrialnej (43, 44). Należy zauważyć, że nie zaobserwowaliśmy różnicy w wychwycie glukozy lub aktywności mitochondrialnej między efektorami T CD4+, efektorowymi komórkami pamięci T i centralnymi komórkami pamięci T w wodobrzuszu. Podobnie, stan zróżnicowania limfocytów T CD8+ w guzach nie ma nic wspólnego ze zmianami w wychwycie glukozy, co podkreśla istotną różnicę między limfocytami T hodowanymi in vitro a ludzkimi TIL in vivo (22). Obserwacje te zostały również potwierdzone przez zastosowanie obiektywnej automatycznej alokacji populacji komórek, która dodatkowo ujawniła, że ​​komórki CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ o wyższym wychwycie glukozy i aktywności mitochondrialnej niż komórki nowotworowe są powszechne, ale mają populację komórek aktywnych metabolicznie. Populacja ta może stanowić domniemaną subpopulację komórek supresorowych mieloidalnych lub komórek dendrytycznych plazmocytoidalnych zidentyfikowanych w analizie scRNA-seq. Chociaż obie te grupy zostały opisane w ludzkich guzach jajnika [45], nadal konieczne są dalsze prace w celu opisania tej subpopulacji mieloidalnej.
Chociaż metody oparte na cytometrii przepływowej mogą wyjaśnić ogólne różnice w metabolizmie glukozy i utleniania między typami komórek, dokładne metabolity wytwarzane przez glukozę lub inne źródła węgla dla metabolizmu mitochondrialnego w TME nie zostały jeszcze określone. Przypisanie obecności lub braku metabolitów do danego podzbioru TIL wymaga oczyszczenia populacji komórek z wyciętej tkanki. Dlatego nasza metoda wzbogacania komórek w połączeniu ze spektrometrią mas może dostarczyć informacji na temat metabolitów, które są różnicowo wzbogacane w populacjach limfocytów T i komórek nowotworowych w dopasowanych próbkach pacjentów. Chociaż ta metoda ma zalety w porównaniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją, niektóre biblioteki metabolitów mogą być naruszone ze względu na wrodzoną stabilność i/lub szybkie tempo obrotu (22). Niemniej jednak, nasza metoda była w stanie zidentyfikować dwa rozpoznane metabolity immunosupresyjne, adenozynę i kinureninę, ponieważ różnią się one znacznie w zależności od rodzaju próbki.
Nasza analiza metabonomiczna guzów i podtypów TIL dostarcza więcej informacji na temat roli metabolitów w jajnikowym TME. Po pierwsze, za pomocą cytometrii przepływowej ustaliliśmy, że nie ma różnicy w aktywności mitochondrialnej między guzami a limfocytami T CD4+. Jednak analiza LC-MS/MS ujawniła istotne zmiany w liczebności metabolitów w tych populacjach, co wskazuje, że wnioski dotyczące metabolizmu TIL i jego ogólnej aktywności metabolicznej wymagają starannej interpretacji. Po drugie, metabolitem o największej różnicy między komórkami CD45 a limfocytami T w wodobrzuszu jest MNA, a nie guzy. Dlatego też kompartmentalizacja i lokalizacja guza mogą mieć różny wpływ na metabolizm TIL, co podkreśla możliwą heterogeniczność w danym mikrośrodowisku. Po trzecie, ekspresja enzymu NNMT produkującego MNA jest ograniczona głównie do CAF, który w mniejszym stopniu dotyczy komórek nowotworowych, ale wykrywalne poziomy MNA obserwuje się w limfocytach T pochodzących z guzów. Nadmierna ekspresja NNMT w jajnikowym CAF ma znany efekt promujący raka, częściowo ze względu na promowanie metabolizmu CAF, inwazji guza i przerzutów (27). Chociaż ogólny poziom TIL jest umiarkowany, ekspresja NNMT w CAF jest ściśle związana z podtypem mezenchymalnym Cancer Genome Atlas (TCGA), który jest powiązany ze złym rokowaniem (27, 46, 47). Wreszcie, ekspresja enzymu AOX1 odpowiedzialnego za degradację MNA jest również ograniczona do populacji CAF, co wskazuje, że limfocyty T nie mają zdolności metabolizowania MNA. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że chociaż potrzebne są dalsze prace w celu weryfikacji tego odkrycia, wysokie poziomy MNA w limfocytach T mogą wskazywać na obecność immunosupresyjnego mikrośrodowiska CAF.
Biorąc pod uwagę niski poziom ekspresji transporterów MNA i niewykrywalne poziomy kluczowych białek zaangażowanych w metabolizm MNA, obecność MNA w limfocytach T jest nieoczekiwana. Ani NNMT, ani AOX1 nie zostały wykryte za pomocą analizy scRNA-seq ani ukierunkowanej reakcji łańcuchowej polimerazy (CPP) w dwóch niezależnych kohortach. Wyniki te wskazują, że MNA nie jest syntetyzowany przez limfocyty T, lecz absorbowany z otaczającego TME. Eksperymenty in vitro pokazują, że limfocyty T mają tendencję do akumulacji egzogennego MNA.
Nasze badania in vitro wykazały, że egzogenny MNA indukuje ekspresję TNFα w limfocytach T i wzmacnia wiązanie Sp1 z promotorem TNFα. Chociaż TNFα ma zarówno działanie przeciwnowotworowe, jak i przeciwnowotworowe, w raku jajnika TNFα może promować wzrost raka jajnika (31-33). Neutralizacja TNFα w hodowli komórek guza jajnika lub eliminacja sygnału TNFα w modelach mysich może poprawić produkcję cytokin zapalnych zależną od TNFα i zahamować wzrost guza (32, 35). Dlatego w tym przypadku MNA pochodzący z TME może działać jako metabolit prozapalny poprzez mechanizm zależny od TNFα poprzez pętlę autokrynną, promując w ten sposób występowanie i rozprzestrzenianie się raka jajnika (31). W oparciu o tę możliwość, blokada TNFα jest badana jako potencjalny środek terapeutyczny w raku jajnika (37, 48, 49). Ponadto MNA osłabia cytotoksyczność limfocytów CAR-T w stosunku do komórek guza jajnika, dostarczając dalszych dowodów na immunosupresję zależną od MNA. Łącznie wyniki te sugerują model, w którym guzy i komórki CAF wydzielają MNA do zewnątrzkomórkowego TME. Poprzez (i) stymulację wzrostu raka jajnika indukowaną TNF oraz (ii) hamowanie aktywności cytotoksycznej limfocytów T indukowane przez MNA, może to mieć podwójny wpływ na guz (ryc. 5D).
Podsumowując, dzięki zastosowaniu połączenia szybkiego wzbogacania komórek, sekwencjonowania pojedynczych komórek i profilowania metabolicznego, niniejsze badanie ujawniło ogromne różnice immunometabolomiczne między komórkami nowotworowymi a komórkami wodobrzusza u pacjentów z HGSC. Ta kompleksowa analiza wykazała różnice w wychwycie glukozy i aktywności mitochondrialnej między limfocytami T oraz zidentyfikowała MNA jako nieautonomiczny metabolit regulujący odpowiedź immunologiczną. Dane te mają wpływ na to, jak TME wpływa na metabolizm limfocytów T w ludzkich nowotworach. Chociaż odnotowano bezpośrednią konkurencję o składniki odżywcze między limfocytami T a komórkami nowotworowymi, metabolity mogą również działać jako pośrednie regulatory, promując progresję nowotworu i potencjalnie hamując endogenne odpowiedzi immunologiczne. Dalszy opis funkcjonalnej roli tych metabolitów regulacyjnych może otworzyć alternatywne strategie wzmacniania przeciwnowotworowej odpowiedzi immunologicznej.
Próbki pacjentów i dane kliniczne uzyskano z repozytorium tkanek nowotworowych BC, certyfikowanego przez Canadian Tissue Repository Network. Zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez BC Cancer Research Ethics Committee i University of British Columbia (H07-00463), wszystkie próbki pacjentów i dane kliniczne uzyskały świadomą pisemną zgodę lub formalnie zrzeczono się takiej zgody. Próbki są przechowywane w certyfikowanym BioBanku (BRC-00290). Szczegółowa charakterystyka pacjentów została przedstawiona w Tabelach S1 i S5. W celu kriokonserwacji, skalpel jest używany do mechanicznego rozłożenia próbki guza pacjenta, a następnie przeciskany przez 100-mikronowy filtr w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Płyn otrzewnowy pacjenta wirowano z prędkością 1500 obr./min przez 10 minut w temperaturze 4°C w celu oddzielenia komórek i usunięcia supernatantu. Komórki pobrane z guza i wodobrzusza poddano kriokonserwacji w 50% inaktywowanej termicznie ludzkiej surowicy AB (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) i 10% dimetylosulfotlenku. Tak zachowane zawiesiny pojedynczych komórek rozmrożono i wykorzystano do badań metabolomicznych i oznaczania metabolitów opisanych poniżej.
Kompletne medium składa się z RPMI 1640, przefiltrowanego przez filtr o średnicy porów 0,22 μm i uzupełnionego w stosunku 50:50: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutaminy (Thermo Fisher Scientific) uzupełnionego 10% inaktywowanej termicznie surowicy ludzkiej AB (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutaminy (Thermo Fisher Scientific), 1 x roztwór penicyliny i streptomycyny (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) oraz 50 μMB-merkaptoetanolu. AimV (Invitrogen) uzupełniono 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) i 2 mM l-glutaminy (Thermo Fisher Scientific). Bufor do barwienia cytometru przepływowego składał się z 0,22 μm przefiltrowanego buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS; Invitrogen) uzupełnionego 3% inaktywowaną termicznie surowicą ludzką AB (Sigma). Bufor wzbogacający komórki składa się z 0,22 μm przefiltrowanego buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej (PBS) uzupełnionego 0,5% inaktywowaną termicznie surowicą ludzką AB (Sigma-Aldrich).
W kompletnym medium w temperaturze 37°C komórki barwiono 10 nM MT DR i 100 μM 2-NBDG przez 30 minut. Następnie komórki barwiono barwnikiem żywotności eF506 w temperaturze 4°C przez 15 minut. Zawiesić komórki ponownie w buforze FC Block (eBioscience) i Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), rozcieńczyć w buforze do barwienia cytometrii przepływowej (zgodnie z instrukcją producenta) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zabarwić komórki zestawem przeciwciał (Tabela S2) w buforze do barwienia cytometrii przepływowej w temperaturze 4°C przez 20 minut. Przed analizą zawiesić komórki ponownie w buforze do barwienia cytometrii przepływowej (Cytek Aurora; konfiguracja 3L-16V-14B-8R). Do analizy danych dotyczących liczby komórek użyć SpectroFlo i FlowJo V10, a do wygenerowania danych użyć GraphPad Prism 8. Medianę intensywności fluorescencji (MFI) dla 2-NBDG i MT DR znormalizowano logarytmicznie, a następnie do analizy statystycznej użyto sparowanego testu t, aby uwzględnić dopasowanie pacjentów. Usuń z analizy wszystkie populacje z liczbą zdarzeń mniejszą niż 40; wprowadź wartość MFI równą 1 dla wszystkich wartości ujemnych przed wykonaniem analizy statystycznej i wizualizacji danych.
Aby uzupełnić strategię ręcznego bramkowania w powyższym panelu procesów, wykorzystaliśmy pełną adnotację drzewa ograniczeń kształtu (FAUST) (21), aby automatycznie przypisać komórki do populacji po wyeliminowaniu martwych komórek w programie FlowJo. Ręcznie zarządzamy danymi wyjściowymi, aby scalić populacje, które wydają się być nieprawidłowo przydzielone (łącząc komórki nowotworowe PD1+ z PD1-) i populacje zachowane. Każda próbka zawiera średnio ponad 2% komórek, co daje łącznie 11 populacji.
Do oddzielenia PBMC od produktów separacji leukocytów zastosowano wirowanie w gradiencie gęstości Ficollu (STEMCELL Technologies). Komórki T CD8+ wyizolowano z PBMC za pomocą mikrokulek CD8 MicroBeads (Miltenyi) i namnażano w kompletnym podłożu za pomocą TransAct (Miltenyi) przez 2 tygodnie, zgodnie z instrukcją producenta. Komórki pozostawiono na 5 dni w kompletnym podłożu zawierającym IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), a następnie ponownie stymulowano za pomocą TransAct. W 7. dniu, zgodnie z instrukcją producenta, użyto ludzkich mikrokulek CD45 MicroBeads (Miltenyi) do wzbogacenia komórek w trzech kolejnych rundach. Komórki podzielono na alikwoty do analizy metodą cytometrii przepływowej (jak opisano powyżej), a milion komórek podzielono na alikwoty trzykrotnie do analizy metodą LC-MS/MS. Próbki poddano obróbce metodą LC-MS/MS zgodnie z poniższym opisem. Oszacowaliśmy wartość brakującego metabolitu, przyjmując liczbę jonów równą 1000. Każda próbka jest normalizowana według całkowitej liczby jonów (TIC), przekształcana logarytmicznie i automatycznie normalizowana w programie MetaboAnalystR przed analizą.
Zawiesinę pojedynczych komórek każdego pacjenta rozmrożono i przefiltrowano przez filtr 40 μm do kompletnego podłoża (jak opisano powyżej). Zgodnie z protokołem producenta, w celu wzbogacenia próbek w komórki CD8+, CD4+ i CD45- (na lodzie) przeprowadzono trzy kolejne rundy selekcji pozytywnej metodą separacji kulek magnetycznych z użyciem MicroBeads (Miltenyi). Krótko mówiąc, komórki zawieszono w buforze do wzbogacania komórek (jak opisano powyżej) i zliczono. Komórki inkubowano z ludzkimi kulkami CD8, ludzkimi kulkami CD4 lub ludzkimi kulkami CD45 (Miltenyi) w temperaturze 4°C przez 15 minut, a następnie przemyto buforem do wzbogacania komórek. Próbkę przepuszczono przez kolumnę LS (Miltenyi), a następnie zebrano frakcje dodatnie i ujemne. Aby skrócić czas trwania i zmaksymalizować etap odzyskiwania komórek, frakcja CD8 jest następnie wykorzystywana do drugiej rundy wzbogacania CD4+, a frakcja CD4 do późniejszego wzbogacania CD45. Przechowywać roztwór w lodzie przez cały proces separacji.
Aby przygotować próbki do analizy metabolitów, komórki przemyto jednokrotnie lodowatym roztworem soli, a następnie do każdej próbki dodano 1 ml 80% metanolu, a następnie zawirowano i szybko zamrożono w ciekłym azocie. Próbki poddano trzem cyklom zamrażania i rozmrażania i wirowano z prędkością 14 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4°C. Supernatant zawierający metabolity odparowywano do sucha. Metabolity ponownie rozpuszczono w 50 μl 0,03% kwasu mrówkowego, zawirowano w celu wymieszania, a następnie odwirowano w celu usunięcia zanieczyszczeń.
Ekstrakt metabolitów należy przeprowadzić zgodnie z powyższym opisem. Przenieść supernatant do butelki do wysokosprawnej chromatografii cieczowej w celu przeprowadzenia badań metabolomicznych. Zastosować losowy protokół przetwarzania, aby do każdej próbki dodać podobną liczbę komórek, aby zapobiec efektom wsadowym. Przeprowadziliśmy jakościową ocenę metabolitów globalnych, której wyniki opublikowano wcześniej, dla spektrometru masowego AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole (50). Analizę chromatograficzną i integrację powierzchni pików przeprowadzono za pomocą oprogramowania MultiQuant w wersji 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Liczba jonów wynosząca 1000 została użyta do oszacowania brakującej wartości metabolitu, a TIC każdej próbki zostało użyte do obliczenia znormalizowanej powierzchni piku każdego wykrytego metabolitu, aby skorygować zmiany wprowadzone przez analizę instrumentalną z przetwarzania próbki. Po znormalizowaniu TIC, MetaboAnalystR(51) (parametr domyślny) jest używany do konwersji logarytmicznej i automatycznego skalowania linii normy. Użyliśmy PCA z pakietem vegan R do przeprowadzenia analizy eksploracyjnej różnic metabolomów między typami próbek i zastosowaliśmy analizę częściowej redundancji do analizy pacjentów. Użyliśmy metody Warda do skonstruowania dendrogramu mapy cieplnej, aby pogrupować odległość euklidesową między próbkami. Użyliśmy limma (52) na standaryzowanej obfitości metabolitów, aby zidentyfikować metabolity o różnicowej obfitości w całym typie komórki i mikrośrodowisku. Aby uprościć wyjaśnienie, użyliśmy parametru średniej grupy do określenia modelu i rozważyliśmy typy komórek w mikrośrodowisku jako każdą grupę (n = 6 grup); W celu przeprowadzenia testu istotności przeprowadziliśmy trzy powtórzenia pomiarów dla każdego metabolitu. Aby uniknąć fałszywej replikacji, pacjent został uwzględniony jako przeszkoda w modelu limma. Aby sprawdzić różnice w metabolitach między różnymi pacjentami, dostosowaliśmy model limma, uwzględniając pacjentów w ustalony sposób. Przedstawiamy istotność wstępnie określonego kontrastu między typem komórki a mikrośrodowiskiem Padj <0,05 (poprawka Benjaminiego-Hochberga).
Po wzbogaceniu wigorowym przy użyciu zestawu Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% żywotności), przeprowadzono sekwencjonowanie transkryptomu pojedynczych komórek na wszystkich żywych zamrożonych próbkach wodobrzusza i guzów, stosując protokół ekspresji genu 10x 5′. Przeanalizowano pięć przypadków z dopasowanymi guzami i wodobrzuszem, chociaż niska żywotność jednej próbki guza uniemożliwiła jej włączenie. Aby uzyskać wielokrotną selekcję pacjentów, połączyliśmy próbki każdego pacjenta w pasmach 10x kontrolera chromowego i przeanalizowaliśmy wodobrzusze i guzy oddzielnie. Po sekwencjonowaniu [Illumina HiSeq 4000 28×98 pb sparowany koniec (PE), genom Quebec; średnio 73 488 i 41 378 odczytów na komórkę odpowiednio dla guza i wodobrzusza]], użyliśmy CellSNP i Vireo (53) (w oparciu o CellSNP jako Wspólny ludzki SNP (VCF) dostarczony przez GRCh38 ma przypisaną tożsamość dawcy. Używamy SNPRelate, aby wywnioskować najbliższą tożsamość (IBS) statusu genotypu pacjenta (IBS), wykluczając nieprzypisane komórki i komórki zidentyfikowane jako dupleksy oraz pasujących dawców między próbkami wodobrzusza i guza (54). Na podstawie tego zadania zachowaliśmy trzy przypadki z obfitą reprezentacją komórek w guzie i wodobrzuszu do dalszej analizy. Po wykonaniu etapu filtracji masowej w opakowaniu BioConductor scater (55) i scran (56), uzyskano 6975 komórek (odpowiednio 2792 i 4183 komórek z guza i wodobrzusza) do analizy. Używamy klastrowania Louvain igraph (57) wspólnej sieci najbliższego sąsiada (SNN) w oparciu o odległość Jaccarda do komórek klastra w oparciu o ekspresję. Klastry zostały ręcznie adnotowane do potencjalnych typów komórek na podstawie ekspresji genu markerowego i uwidocznione za pomocą t-SNE. Komórki T cytotoksyczne są definiowane na podstawie ekspresji CD8A i GZMA, z wyłączeniem podklastrów o niskiej ekspresji białka rybosomalnego. Uzyskaliśmy dostęp do opublikowanych danych Izar i in. (16), w tym ich osadzanie t-SNE, co pozwala kontrolować nakładanie się ekspresji między markerami komórek układu odpornościowego a ekspresją NNMT.
Komórki PBMC oddzielono od produktów separacji leukocytów (STEMCELL Technologies) metodą wirowania w gradiencie gęstości Ficollu. Komórki CD3+ wyizolowano z komórek PBMC za pomocą kulek CD3 (Miltenyi). W obecności lub nieobecności MNA, komórki CD3+ aktywowano za pomocą CD3 związanego z płytką (5 μg/ml), rozpuszczalnego CD28 (3 μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin). W ostatnim dniu namnażania żywotność (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) i proliferację (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Ocenić funkcję efektorową poprzez stymulację komórek PMA (20 ng/ml) i jonomycyną (1 μg/ml) za pomocą GolgiStop przez 4 godziny i monitorować CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) (BioLegend) i izotiocyjanian fluoresceiny TNFα (FITC) (MAb11, BD). Stymulować komórki qPCR i ChIP za pomocą PMA (20 ng/ml) i jonomycyny (1 μg/ml) przez 4 godziny. Supernatant ELISA zebrano przed i po stymulacji PMA (20 ng/ml) i jonomycyną (1 μg/ml) przez 4 godziny.
Postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby wyizolować RNA za pomocą zestawu RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Użyj QIAshredder (QIAGEN) do homogenizacji próbki. Użyj zestawu RNA do cDNA o dużej pojemności (Thermo Fisher Scientific) do syntezy komplementarnego DNA (cDNA). Użyj mieszanki TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) do ilościowego określenia ekspresji genów (zgodnie z protokołem producenta) z następującymi sondami: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehyd-3-fosforan z wodoru (GAPDH)] i Hs01010726_m1 (SLC22A2). Próbki poddano reakcji PCR w czasie rzeczywistym w systemie StepOnePlus (Applied Biosystems) na szybkiej optycznej 96-dołkowej płytce reakcyjnej MicroAmp (Applied Biosystems) z folią optyczną MicroAmp. Wartość Ct przekraczająca 35 jest uznawana za wartość powyżej progu wykrywalności i oznaczana jako niewykrywalna.
Wykonaj ChIP jak opisano wcześniej (58). W skrócie, komórki traktowano formaldehydem (stężenie końcowe 1,42%) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Użyj uzupełnionego buforu pęczniejącego (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl i 0,1% NP-40) na lodzie przez 10 minut, a następnie ponownie zawiesz w buforze do immunoprecypitacji jak opisano (58). Próbkę następnie sonikowano w następujących cyklach: 10 cykli (20 1-sekundowych impulsów) i czas statyczny 40 sekund. Inkubuj immunoglobulinę G klasy ChIP (Cell Signaling Technology; 1 μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) i przeciwciała SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) z próbką w 4°C wytrząsając przez noc. Inkubować kulki z białkiem A (Thermo Fisher Scientific) z próbką w temperaturze 4°C, delikatnie wstrząsając, przez 1 godzinę, a następnie użyć kulek Chelex (Bio-Rad) do wzbogacenia DNA i proteinazy K (Thermo Fisher) do trawienia białka. Promotor TNFα wykryto metodą PCR: w kierunku do przodu, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; przeciwnie, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produkt o długości 207 pz). Obrazy wykonano w firmie Image Lab (Bio-Rad) i zmierzono ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ.
Nadsącz hodowli komórkowej zebrano zgodnie z powyższym opisem. Oznaczenie przeprowadzono zgodnie z procedurami producenta zestawu ELISA do oznaczania ludzkiego TNFα (Invitrogen), zestawu ELISA do oznaczania ludzkiej IL-2 (Invitrogen) oraz zestawu ELISA do oznaczania ludzkiego IFN-γ (Abcam). Zgodnie z protokołem producenta, nadsącz rozcieńczono w stosunku 1:100 w celu wykrycia TNFα i IL-2 oraz w stosunku 1:3 w celu wykrycia IFN-γ. Do pomiaru absorbancji przy długości fali 450 nm należy użyć czytnika EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer).
Komórki PBMC oddzielono od produktów separacji leukocytów (STEMCELL Technologies) metodą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll. Komórki CD3+ wyizolowano z komórek PBMC za pomocą kulek CD3 (Miltenyi). W obecności lub nieobecności MNA, komórki CD3+ aktywowano przez 3 dni za pomocą CD3 (5 μg/ml) związanego z płytką, rozpuszczalnego CD28 (3 μg/ml) i IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Po 3 dniach komórki zebrano i przemyto 0,9% roztworem soli fizjologicznej, a osad zamrożono. Liczbę komórek określono metodą cytometrii przepływowej (Cytek Aurora; konfiguracja 3L-16V-14B-8R) z użyciem kulek eBeads o gęstości 123 zliczeń.
Ekstrakt metabolitów należy przeprowadzić zgodnie z powyższym opisem. Wysuszony ekstrakt zrekonstytuowano w stężeniu 4000 ekwiwalentów komórek/μl. Próbkę należy przeanalizować za pomocą chromatografii w odwróconym układzie faz (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia) z użyciem kolumny CORTECS T3 (2,1×150 mm, wielkość cząstek 1,6 μm, średnica porów 120 Å; nr kat. 186008500, Waters). Spektrometr masowy z polarem (6470, Agilent), w którym jonizacja elektrorozpyłowa działa w trybie dodatnim. Faza ruchoma A to 0,1% kwas mrówkowy (w H2O), faza ruchoma B to 90% acetonitryl, 0,1% kwas mrówkowy. Gradient LC wynosi od 0 do 2 minut dla 100% A, od 2 do 7,1 minut dla 99% B i od 7,1 do 8 minut dla 99% B. Następnie ponownie zrównoważyć kolumnę z fazą ruchomą A przy szybkości przepływu 0,6 ml/min przez 3 minuty. Szybkość przepływu wynosi 0,4 ml/min, a komora kolumny jest podgrzewana do 50°C. Użyj czystego standardu chemicznego MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanada), aby ustalić czas retencji (RT) i transformację (RT = 0,882 minuty, transformacja 1 = 137→94,1, transformacja 2 = 137→92, konwersja 3 = 137→78). Gdy wszystkie trzy przejścia zajdą przy prawidłowym czasie retencji, przejście 1 jest używane do kwantyfikacji w celu zapewnienia specyficzności. Krzywa standardowa MNA (Toronto Research Chemical Company) została wygenerowana poprzez sześć seryjnych rozcieńczeń roztworu macierzystego (1 mg/ml) w celu uzyskania roztworów wzorcowych o stężeniach odpowiednio 0,1, 1,0, 10 i 100 ng/ml oraz 1,0 i 10 μg/ml. Granica wykrywalności wynosi 1 ng/ml, a liniowa odpowiedź mieści się w zakresie od 10 ng/ml do 10 μg/ml. Do analizy LC/MS wykorzystuje się każdą iniekcję dwóch mikrolitrów próbki i standardu, a mieszaną próbkę kontroli jakości przeprowadza się co osiem iniekcji, aby zapewnić stabilność platformy analitycznej. Odpowiedzi MNA wszystkich próbek komórek traktowanych MNA mieściły się w zakresie liniowym testu. Analizę danych przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy ilościowej MassHunter (wersja 9.0, Agilent).
Konstrukt αFR-CAR drugiej generacji został zaczerpnięty z pracy Song i wsp. (59). W skrócie, konstrukt zawiera następujące elementy: sekwencję liderową CD8a, ludzki, jednołańcuchowy fragment zmienny specyficzny dla αFR, region zawiasowy i transbłonowy CD8a, domenę wewnątrzkomórkową CD27 i domenę wewnątrzkomórkową CD3z. Pełną sekwencję CAR zsyntetyzowano za pomocą GenScript, a następnie sklonowano do lentiwirusowego wektora ekspresyjnego drugiej generacji, znajdującego się przed kasetą ekspresyjną GFP, użytą do oceny wydajności transdukcji.
Lentiwirus jest produkowany poprzez transfeccję komórek HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); hodowanych w zmodyfikowanym podłożu Eagle'a Dulbecco, zawierającym 10% surowicy płodowej bydlęcej (FBS) i 1% PenStrep, z użyciem wektora CAR-GFP i plazmidów pakujących (psPAX2 i pMD2.G, Addgene) z użyciem aminy lipofekcyjnej (Sigma-Aldrich). Supernatant zawierający wirusa zebrano 48 i 72 godziny po transfeccji, przefiltrowano i zagęszczono przez ultracentrifugację. Zagęszczony supernatant wirusa należy przechowywać w temperaturze -80°C do momentu transdukcji.
Komórki PBMC są oddzielane od produktów separacji leukocytów zdrowych dawców (STEMCELL Technologies) przez wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll. Użyj mikrokulek CD8 selekcji pozytywnej (Miltenyi) do wyizolowania komórek CD8+ z PBMC. Stymuluj komórki T za pomocą TransAct (Miltenyi) i w podłożu TexMACS [Miltenyi; uzupełnionym 3% inaktywowanej cieplnie surowicy ludzkiej, 1% PenStrep i IL-2 (300 U/ml)]. Dwadzieścia cztery godziny po stymulacji komórki T transdukowano lentiwirusem (10 μl stężonego supernatantu wirusa na 106 komórek). 1 do 3 dni po transdukcji na Cytek Aurora (na FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), oceń ekspresję GFP komórek, aby wykazać wydajność transdukcji na poziomie co najmniej 30%.
Komórki CAR-T hodowano przez 24 godziny w pożywce Immunocult (STEMCELL Technologies; z dodatkiem 1% PenStrep) w następujących warunkach: bez leczenia, z dodatkiem 250 μM adenozyny lub 10 mM MNA. Po wstępnym leczeniu komórki CAR-T przemyto PBS i połączono z 20 000 komórek SK-OV-3 [ATCC; w pożywce McCoy 5A (Sigma-Aldrich) z dodatkiem 10% FBS i 1% PenStrep w stężeniu 10:1. Stosunek komórek efektorowych do docelowych wynoszący 1 amplifikowano w trzech powtórzeniach w pożywce Immunocult z dodatkiem. Komórki SK-OV-3 i komórki SK-OV-3 lizowane saponiną naparstnicy (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) wykorzystano odpowiednio jako kontrolę negatywną i pozytywną. Po 24 godzinach kokultywacji zebrano supernatant i zmierzono aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH) zgodnie z instrukcją producenta (zestaw LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatant LDH rozcieńczono w buforze LDH w stosunku 1:50. Procent zabijania mierzono według następującego wzoru: procent zabijania = procent korekty / maksymalny wskaźnik zabijania x 100%, gdzie procent korekty = kokultywacja – tylko limfocyty T, a maksymalny wskaźnik zabijania = kontrola dodatnia – kontrola ujemna.
Zgodnie z opisem w tekście lub materiałach i metodach, do analizy statystycznej należy użyć oprogramowania GraphPad Prism 8, Microsoft Excel lub R v3.6.0. W przypadku pobrania wielu próbek od tego samego pacjenta (takich jak wodobrzusze i guz), stosujemy sparowany test t lub uwzględniamy pacjenta jako efekt losowy w modelu liniowym lub uogólnionym, w zależności od potrzeb. W przypadku analizy metabolomicznej test istotności przeprowadza się trzykrotnie.
Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć na stronie http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Niniejszy artykuł jest udostępniany w otwartym dostępie na warunkach licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne, która zezwala na używanie, rozpowszechnianie i reprodukcję w dowolnym medium, pod warunkiem, że ostateczne wykorzystanie nie ma na celu osiągnięcia korzyści komercyjnych, a założeniem jest, że oryginalne dzieło jest poprawne. Źródło.
Uwaga: Prosimy o podanie adresu e-mail tylko po to, aby osoba, którą polecasz na stronie, wiedziała, że ​​chcesz, aby otrzymała wiadomość e-mail i że nie jest to spam. Nie będziemy przechwytywać żadnych adresów e-mail.
To pytanie służy do sprawdzenia, czy jesteś gościem, i zapobiegania automatycznemu wysyłaniu spamu.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA przyczynia się do immunosupresji limfocytów T i stanowi potencjalny cel immunoterapii w leczeniu raka u ludzi.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA przyczynia się do immunosupresji limfocytów T i stanowi potencjalny cel immunoterapii w leczeniu raka u ludzi.
©2021 Amerykańskie Stowarzyszenie Postępu Nauki. wszelkie prawa zastrzeżone. AAAS jest partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.